异牡荆素的制备和用图
【专利摘要】本发明属医药及天然产物化学领域，具体涉及一种黄酮碳苷类化合物的制备方法及其新的用途。本发明先采用正相（硅胶）柱色谱分离，再采用反相（开放ODS）柱色谱分离后，即自然析出异牡荆素结晶。采用硅胶柱色谱分离时，采用干法上样；采用开放ODS柱色谱分离时，采用湿法上样。本发明还提供异牡荆素的心肌保护用途。
【专利说明】
异牡荆素的制备和用途
技术领域
[0001] 本发明属医药及天然产物化学领域，具体涉及一种黄酮碳苷类化合物的制备方法 及其新的用途。
【背景技术】
[0002] 异牡荆素为一典型的黄酮碳苷，广泛地存在于蔬菜、水果和中草药中，如马鞭草科 植物滨牡荆（Vitex littoralis A.Cunn.)的叶、豆科植物阜荚（Gleditsia sinensis Lam.)与夜关门（Lespedeza cuneata G.Don)的叶，以及绿豆（Vigna radiate L.)的种子 等。大量研究表明，异牡荆素具有抗氧化、抑菌、抗病原体以及降血糖等活性，但目前异牡荆 素的心肌保护作用尚未见报道。
[0003] 近年来，硅胶与0DS等填料在天然药物化学成分的提取、分离纯化、制剂工艺改革、 制剂质量分析等方面有了较广泛的应用研究，并明确显示出其独特的作用。利用硅胶与0DS 的相反的吸附功能和物质的相似相容原理可从中药提取液中分离精制有效成分或有效部 位，最大限度地去粗取精，促进中药现代化研究的发展。
[0004]给予异丙肾上腺素（丨8(^代仙1;[116，150)可诱导大鼠发生急性心肌缺血损伤，其在 心电图、心肌酶学及组织病理学等方面的改变类似于人类急性心肌缺血的病变特征，已成 为心血管疾病研究领域的一种重要的动物模型。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供异牡荆素的制备方法。具体步骤如下：
[0006] (1)取绿豆适量，用乙醇或甲醇提取，过滤，合并滤液，得醇提液;将醇提液减压回 收醇至无醇味，得粗提液；
[0007] (2)所获得的粗提液依次用不同极性有机溶剂萃取，弃去萃取液，再用正丁醇萃 取，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，得绿豆提取物；
[0008] (3)所得的绿豆提取物，用适量甲醇分散，加入适量硅胶，搅拌均匀，装入预先处理 好的硅胶柱中，以两种有机溶剂混合的混合有机溶剂（100:0~0:100)进行梯度洗脱，收集 混合有机溶剂(50: 50~30:70)洗脱液，浓缩至浓稠状，加适量乙醇或甲醇分散;上开放0DS 柱，以醇-水(0:100~100:0)，优选为醇-水（10:90~40:60)，进行梯度洗脱，收集醇-水(35: 65~40:60)洗脱液，放置过夜析出黄色结晶，即为异牡荆素，纯度在95%以上。
[0009；
[0010] 本发明中，步骤(1)中所述的乙醇或甲醇的浓度为30%~100%。
[0011] 本发明中，步骤（1)中所述的提取是用5~20倍量的30 %~100 %乙醇或甲醇闪式 提取1~3次，并合并提取液。
[0012] 本发明中，步骤(2)中所述的不同极性有机溶剂包括，但不仅限于：石油醚、环己 烷、二氯甲烷、氯仿、醋酸乙酯。
[0013] 本发明中，步骤(2)中所述的不同极性有机溶剂、正丁醇的用量为0.5~2倍体积， 萃取次数为1~5次。
[0014] 本发明中，步骤(3)中所述的混合有机溶剂为二氯甲烷-甲醇，或氯仿-甲醇，或二 氯甲烷-乙醇，或氯仿-乙醇。
[0015] 本发明中，步骤(3)中所述的醇-水为甲醇-水或乙醇-水。
[0016] 本发明中，先采用正相(硅胶)柱色谱分离，再采用反相(开放0DS)柱色谱分离后， 即自然析出异牡荆素结晶。
[0017] 本发明中，采用硅胶柱色谱分离时，采用干法上样;采用开放0DS柱色谱分离时，采 用湿法上样。
[0018] 本发明的另一个目的在于提供异牡荆素的心肌保护用途。
【附图说明】
[0019] 图1为异牡荆素的氢谱图。
[0020] 图2为异牡荆素的碳谱图。
[0021]图3为异牡荆素提取分离流程图。
[0022]图4为异牡荆素对ISO致心肌缺血大鼠心肌组织病理形态学的影响(HE染色）。
【具体实施方式】
[0023]实施例一、异牡荆素的分离制备
[0024] 1 ·植物材料:豆科植物绿豆(Vigna radiate L.)的种子。
[0025] 2.分离制备方法:绿豆种子50kg，用10、10、10倍量的95%乙醇回流提取3次，过滤， 合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得浓缩液约5L。分别用石油醚5L、二氯甲烷5L、正丁醇5L 各萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，得绿豆提取物。将绿豆提取物用适量甲醇 溶解，并取适量硅胶拌样。将拌好的样品装入硅胶柱中，用二氯甲烷-甲醇（1〇〇:〇~〇:1〇〇) 梯度洗脱，得到5个流分，收集流分4 (45:55~35:65 )，上样开放0DS柱，用甲醇-水（10:90~ 40:60)梯度洗脱，收集甲醇-水(40:60)洗脱液，放置，析出黄色固体，即为异牡荆素。实施例 二、异牡荆素的心肌保护活性试验
[0026] 1.实验动物：SD大鼠，体重200~220g，沈阳药科大学动物中心提供；合格证号： SCXK(辽）2015-0001。
[0027] 2.试剂：IS0注射液(上海禾丰制药有限公司，批号：41150402 )，乌拉坦（中国医药 (集团）上海化学试剂公司），肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶(S0D)试剂盒(南京建成生物工程研究所）。
[0028]实验所用的异牡荆素为发明人自制，其化学结构经氢谱、碳谱确定无误，HPLC纯度 在98%以上。
[0029] 3.实验方法：取SD大鼠18只，随机分成三组：空白组、模型组和异牡荆素组，每组6 只。空白组和模型组连续灌胃7天生理盐水，异牡荆素组连续灌胃7天异牡荆素溶液(30mg/ kg)，模型组与异牡荆素组在第6天和第7天给药后5分钟，分别腹腔给予ISO 2mg/kg，第7天 给予ISO后2小时，眼眶静脉丛取血，分离血清，测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、 谷草转氨酶(AST)的活性。取血后处死大鼠，迅速摘取心脏。取部分心脏组织匀浆，离心 (3500r/min，15min)，取出心肌匀浆上清液，测定心肌匀浆中S0D、MDA含量，实验结果用 Excel统计处理，经t检验判断显著性。另取部分心脏组织置于10%的福尔马林溶液中固定， 常规脱水，石蜡包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察组织病理改变。
[0030] 4.试验结果：如表2所示，与空白组对比，模型组大鼠血清中的CK、LDH与AST均明显 升高，表明三者均从细胞中外漏增加，且模型组大鼠心肌组织中MDA显著增加，S0D显著下 降，以上指标均表明ISO诱导大鼠心肌缺血的模型成立。异牡荆素组与模型组对比，异牡荆 素组血清中的CK、LDH与AST均明显下降，抑制了三者细胞外漏，且异牡荆素组大鼠心肌组织 中MDA显著下降，S0D显著上升，提示异牡荆素可通过增强抗氧化能力对缺血心肌产生保护 作用。
[0031] 表2.异牡荆素对ISO致心肌缺血大鼠心肌酶活性影响
[0032]
[0033] 光学显微镜下观察，空白组大鼠心肌未见病理形态学改变模型组大鼠可见心肌断 裂，心肌间质水肿，炎症细胞浸润明显。异牡荆素组大鼠心肌组织病理性损害改变较模型组 有所减轻，未见心肌间质水肿，极少见炎性细胞浸润。结果见图4,提示异牡荆素能明显减轻 ISO诱导的大鼠心肌缺血损伤的程度。
[0034]该发明试验结果表明，异牡荆素具有心肌保护活性，故该化合物具有良好的应用 与开发前景。
【主权项】
1. 异牡荆素的制备方法，包括以下步骤： (1) 绿豆粗提液的制备:取绿豆适量，乙醇或甲醇回流提取，过滤，合并滤液，得醇提液， 将醇提液减压回收醇至无醇味，得粗提液； (2) 绿豆提取物的制备:绿豆粗提液，依次用不同极性有机溶剂萃取，弃去萃取液，再用 正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，减压回收正丁醇，得绿豆植株提取物； (3) 异牡荆素的精制:所得的绿豆提取物，用适量甲醇分散，加入适量硅胶，搅拌均匀， 装入预先处理好的硅胶柱中，以两种有机溶剂混合的混合有机溶剂（100:0~0:100)进行梯 度洗脱，收集混合有机溶剂（50:50~30:70)洗脱液，浓缩至浓稠状，加适量乙醇或甲醇分 散;上开放ODS柱，以醇-水(0:100~100:0)，优选为醇-水（10:90~40:60)，进行梯度洗脱， 收集醇-水(35:65~40:60)洗脱液，放置过夜析出黄色结晶，即为异牡荆素。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述的乙醇或甲醇浓度为 30%~100%，步骤（1)中采用5~20倍量的30%~100%乙醇或甲醇提取1~3次，并合并提 取液。3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中先用0.5~2倍体积石油醚或 环己烷萃取1~5次后，再用0.5~2倍体积二氯甲烷或氯仿或醋酸乙酯萃取1~5次，最后用 0.5~2倍体积的正丁醇萃取1~5次。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的混合有机溶剂梯度洗 脱，其混合有机溶剂为二氯甲烷-甲醇，或氯仿-甲醇，或二氯甲烷-乙醇，或氯仿-乙醇。5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的醇-水为甲醇-水或乙 醇-水。6. -种药物组合物，包含权利要求1-5任何一项所述的制备方法制备的异牡荆素和药 学上可接受的载体。7. 异牡荆素在制备用于心肌保护药物中的用途。8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的心肌保护是对异丙肾上腺素诱导的心 肌缺血的保护作用。9. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的心肌保护药物为心脏病，尤其是心肌 缺血引起的心绞痛预防和症状缓解的药物。10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶 液、注射用无菌粉末或注射液。
【文档编号】C07D407/04GK106008483SQ201610405166
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】于治国, 赵云丽, 白岩
【申请人】沈阳药科大学