专利名称：紫花牡荆素在制备镇痛药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是紫花牡荆素用于制备镇痛药物的新用途。
背景技术：
疼痛是多种疾病的一个症状，它使患者感受痛苦，尤其是剧痛，还可能引起生理功能紊乱，甚至休克。因此，适当地应用药物缓解疼痛，防止可能产生的生理功能紊乱是很必要的。缓解疼痛的药物，按其药理作用机制，可以分为两大类一种是主要作用于中枢神经 系统、能选择性地消除或缓解疼痛的药物。在镇痛过程中，患者意识清醒，其他感觉不受影响，这类药物称为镇痛药(analgesics)。另一种是具有镇痛、解热和抗炎作用的药物，对各种钝痛(如头痛、牙痛等)有效。典型的镇痛药为阿片生物碱类及其合成代用品，其特点是镇痛作用强大，但反复应用易于成瘾，故又称为成瘾性镇痛药或麻醉性镇痛药。紫花牡荆素(Casticin-5,3' -dihydroxy-3,6,7,4 1 -tetramethoxyf lavon,PAME)是牡荆属中多中药材中的黄酮类成分，是中药材蔓荆子中的黄酮成分。其化学结构式如下
OH
^k/OCH3
H3CO^f^Y^OCH3 OH〇《中华人民共和国药典》将紫花牡荆素作为蔓荆子生药的鉴别成分，因此可以将其作为药材和原料药品质评价的重要指标性成分。紫花牡荆素主要存在于马鞭草科牡荆属多种植物中如蔓荆(Vitex trifolia L)、单叶蔓荆(Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham)、黄荆(Vitex negundo L)、牡荆(Vitex negundo var. cannabifolia(Sieb. et Zucc. )Hand.-Mazz.)等。而药典收载的蔓荆子为马鞭草科植物单叶蔓荆(Vitex trifolia var simplicifolia Cham.)或蔓荆(V. trifolia L.)的干燥果实，具有疏风散热、清利头目的功效，历代本草典籍均有记载。研究表明蔓荆植物主要含有挥发油、黄酮类(苷元及苷)、环烯醚萜(苷元及苷)、二萜(苷元及苷)、生物碱、留体等成分。其中紫花牡荆素作为其主要成分，能够阻断由组胺诱导的雄性豚鼠气管的自发性收缩，通过稳定细胞膜，从而抑制组胺从肥大细胞中的释放，体外实验中发现紫花牡荆素能够选择性地抑制小鼠T淋巴细胞的增生，能抑制肿瘤细胞系的生长，还具有抑制淋巴细胞增殖的活性，对淋巴细胞瘤有治疗潜力(Gemini，A. ,Subagus,ff. , Ibnu, G. G. , Lukman, H. , Timmerman, H. , Rob Verpoorte. ,2002. Tracheospasmolyticactivity of Viteosin-A and Vitexcarpin isolated from Vitex trifolia. PlantaMed. 68，1047-1049)。紫花牡荆素能通过促使癌细胞发生G2/M期阻滞，并最终诱导其凋亡来发挥抑制癌细胞增殖的抗癌活性(Kobayakawa, J. , Sato-Nishimori, F. , Moriyasu, M.,Matsukawa, Y.,2004.G2-M arrest and antimitotic activity mediated by Casticin，aflavonoid isolated from Viticis fructus(Vitex rotundifolia linne fil.). CancerLett. 208,59-64.)。对人宫颈癌HeLa细胞增殖活性有较强的抑制作用，呈剂量和时间依赖性；这种抑制作用与降低CyclinBl蛋白表达、活化P21蛋白有关(谢晶，白军，盛习锋，曹建国，谢宛玉.紫花牡荆素体外抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖的研究.中国癌症杂志，2010,20(6) =406-410)。紫花牡荆素还有较强的抗炎作用，对二甲苯所致小鼠耳廊肿胀、鸡蛋清所致大鼠足肿胀以及醋酸所致小鼠毛细血管通透性增加均有明显的抑制作用(Lin S，Zhang H,Han T,ffu JZ,Rahman K, Qin LP. In vivo effect of casticin on acute inflammation. Journal of Chinese Integrative Medicine, 2007, 5 (5) I :573-576)。但至今未见紫花牡荆素具有镇痛活性的的相关报道。
发明内容
本发明为紫花牡荆素(PAME)提供一种治疗疼痛症状的新用途。
本发明的紫花牡荆素制备方法如下I、制备紫花牡荆素提取液将PAME原药材按常规用75%乙醇回流提取，得紫花牡荆素提取液；2、制备浸膏将上述提取液减压浓缩，得浸膏；2、萃取2. I提取物浸膏混悬液的制备将浸膏去离子水分散，得提取物浸膏混悬液；2. 2石油醚萃取将上述混悬液中石油醚萃取，得石油醚萃取液；2. 3 二氯甲烷萃取在石油醚萃取液中加入二氯甲烷萃取得二氯甲烷萃取液；2. 4 浓缩将上述二氯甲烷萃取液减压浓缩至呈浸膏状，得到蔓荆子二氯甲烷提取部位；3、纯化将上述二氯甲烷部位用95%医用酒精加热溶解后，放冷至室温，0.45 iim滤膜过滤；滤液缓慢加入到已处理好的葡聚糖凝胶色谱柱中(Sephadex LH-20, O40X600mm),95 %医用酒精洗脱，流速lBV/h，收集3-8BV洗脱液，分别用TLC及HPLC检查，结果发现紫花牡荆素集中于5-6BV洗脱液，并与一种绿色色素一起被洗脱下来。合并5-6BV洗脱液，减压浓缩，得到黄绿色粉末，以少量95%医用酒精淋洗，抽干，60°C减压干燥24h至恒重，得紫花牡荆素黄色粉末。经动物试验，发现紫花牡荆素具有明显的镇痛作用，因而可用于制备治疗疼痛症状的药物。本发明为制备新的镇痛药物提供了一种药物来源。
具体实施方式
实施例I.紫花牡荆素的制备I、PAME药材75 %乙醇提取液的浓缩取PAME原药材(批号20081003) 100. 5克，置2000ml圆底烧瓶中，按照提取工艺要求，加75%乙醇1200ml，回流提取2h，放冷，过滤；滤渣继续加75%乙醇1000ml，回流提取2h，放冷，过滤；两次滤液合并，作为药材提取液，共2100ml。上述提取液置IOOOml圆底烧瓶中，分次减压浓缩，总体积浓缩至IOOml时，浓缩液呈浸膏状，放冷至室温待用。2、萃取2. I提取物的分散向上述浸膏中加入200ml去离子水，搅拌，稍加热，静置，放冷至室温，倾去水层；继以200ml X2次洗涤，倾去水层；最后，加入200ml去离子水分散提取物浸膏； 2. 2石油醚萃取上述浸膏混悬液中，含有部分色素，我们采取石油醚萃取的方法，去除部分色素及部分亲脂性成分。向上述混悬液中加入200ml石油醚，振摇，静置分层，分取石油醚层，TLC跟踪，水层继续以200ml石油醚萃取；经!1(跟踪验证，当石油醚萃取四次后，石油醚萃取层已无明显成分，故确定提取物石油醚萃取四次，每次200ml，即石油醚水层=I I萃取四次。2. 3 二氯甲烷萃取向上述石油醚萃取液中加入200ml 二氯甲烷，振摇，静置分层，分取二氯甲烷层，TLC跟踪，水层继续以200ml 二氯甲烷萃取；经TLC跟踪验证，当二氯甲烷萃取四次后，水层已无明显的黄酮类成分，故确定提取物二氯甲烷萃取四次，每次200ml，即二氯甲烷水层=I I萃取四次。弃去水层，合并二氯甲烷萃取液，共690ml。二氯甲烷萃取液的浓缩上述二氯甲烷萃取液置IOOOml圆底烧瓶中，分次减压浓缩，总体积浓缩至IOOml时，浓缩液呈浸膏状，得到蔓荆子二氯甲烷提取部位3. 5g，放冷至室温待用。3、纯化上述二氯甲烷部位3. 5g，缓缓加入95%医用酒精，边加热边溶解，至刚好全部溶解，共用溶剂18ml。放冷至室温，0. 45um滤膜过滤；滤液缓慢加入到已处理好的葡聚糖凝胶色谱柱中(S^hadex LH-20, 040X600mm)，95%医用酒精洗脱，流速lBV/h，收集3-8BV洗脱液，分别用TLC及HPLC检查，结果发现紫花牡荆素集中于5-6BV洗脱液，并与一种绿色色素一起被洗脱下来。合并5-6BV洗脱液，减压浓缩，得到黄绿色粉末，以少量95%医用酒精淋洗，抽干，60°C减压干燥24h至恒重，得到黄色粉末。用上述方法制备3批样品，以紫花牡荆素为指标考察纯度与转移率。结果显示，紫花牡荆素平均纯度为91. 22%，紫花牡荆素在纯化过程中的平均转移率为80. 57%。根据《药品注册管理办法》(试行)，中药有效单体成分作为新药注册，其有效成分总含量必须超过90%，故本发明制备方法所制得的干物质即为紫花牡荆素，符合新药申报要求。实施例2.紫花牡荆素镇痛试验(一 )化学物质刺激试验I、实验材料(I)药物
PAME :由实施例I制备，实验时用含0. 5% CMC的蒸馏水分别配制成0. 2%,0.4%,
0.8%的药液备用。药品及试剂甲醛(分析纯)、醋酸(分析纯)[上海国药集团化学试剂责任有限公司];吗啡、纳络酮、亚甲基蓝(由第二军医大学教保处代购)；乙酰水杨酸钠、曲马多、戊巴比妥钠(北京四环制药有限公司)。实验时配置值相应浓度备用。(2)动物ICR小鼠，体重20 22g，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2007003。由中国人民解放军第二军医大学实验动物研究中心提供。检疫后备用。2、实验方法(I)扭体试验 取昆明种小鼠50只，雌雄各半，随机分为模型对照组(N= 10)、阳性对照组(N =10) ,PAME高剂量组(N = 10)、中剂量组(N = 10)、低剂量组(N = 10)。按组分别灌胃蒸馏水、2%乙酰水杨酸药液、0. 8%,0. 4%,0. 2% PAME丸药液10ml/kg，给药I小时后腹腔注射0. 6%醋酸10ml/kg，记录15分钟内扭体次数。注射醋酸溶液后2 3min，小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高踐等行为反应，称为扭体反应(writhing response),该反应在腹腔注射后15min内出现频率最高。实验数据用SPSS11.0统计软件处理。各组间比较采用单因素方差分析，其中方差齐者用LSD法，方差不齐者用Dunnett’ st3法检验。(2)福尔马林试验在给小鼠足底皮下注射福尔马林溶液前40min，将化合物PAME的低、中、高剂量-20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg以灌胃的方式给已禁食15h的小鼠给药。40min后,用量程为50iU的微量注射器向受试组中每只小鼠右足底皮下注射5%的福尔马林溶液20 yl，立即置入一个悬挂在铁架台上容积为2000ml的大烧杯中，容器下方放置一个倾斜30°的镜子，从镜面观察小鼠对皮下注射5%福尔马林溶液的右足底反应。阳性对照药吗啡(IOmg/kgs. c.)在给小鼠右足底皮下注射福尔马林溶液前30min皮下注射给药。小鼠足底皮下注射福尔马林溶液后引发的反应可分为两个时相0 IOmin出现者为I相(早期相)、10 60min出现的反应为II相(迟发相)。I相反应主要是直接刺激c纤维所致，II相反应有炎性机制参与。注射5%福尔马林溶液90 120min后疼痛反应明显降低。我们将0 5min设定为I相(早期相)、15 25min设定为II相(迟发相)；在两个时间段中观察小鼠舔，抖动被注射足的持续时间长短作为疼痛指标。做组间t检验比较各给药组与空白组在I相和II相中小鼠舔，抖动被注射足的持续时间是否存在统计学差异。(3)小鼠辣椒素试验在给小鼠足底皮下注射辣椒素溶液前25min，将PAME低、中、高剂量20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg以腹腔注射的方式给已禁食15h的小鼠给药。25min后，用量程为50 yl的微量注射器向受试组中每只小鼠右足底皮下注射辣椒素溶液(I. g，20iU)，立即置入一个悬挂在铁架台上容积为2000ml的大烧杯中，容器下方放置一个倾斜30度的镜子，从镜面观察小鼠对皮下注射辣椒素溶液的右足底的反应。阳性对照药吗啡(10mg/kg s.c.)在给小鼠右足底皮下注射辣椒素溶液前30min皮下注射给药。小鼠足底皮下注射辣椒素溶液后，引发的疼痛反应是有外周神经元参与的炎性疼痛反应。注射辣椒素溶液8 IOmin后疼痛反应明显降低。我们将0 5min设定为观察时段；在这段时间内观察小鼠舔，抖动被注射足的持续时间长短作为疼痛指标。做组间t检验比较各给药组与空白组在0 5min内小鼠舔，抖动被注射足的持续时间是否存在统计学差异。3、实验结果(I)对醋酸所致小鼠扭体的影响模型组小鼠给予0. 6%醋酸后，疼痛症状明显，扭体动作多。化合物PAME20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg三个剂量对腹腔注射醋酸引发的小鼠扭体次数有显著的抑制作用，并呈一定的量效关系。ED(50)为39.07mg/kg。空白组、阳性对照药组、PAME低、中、高五个剂量组的醋酸扭体实验结果，见表I。表IPAME对醋酸所致小鼠扭体次数的影响(mean土SEM)
组别动物(只) 剂M(mg/kg )扭体次数(次/15min)
f 们对照10—45.9012.49 Pl 丨性对照100.529. 10+1. 77"
高剂M组108023.30+2. 17"
中剂104028.80+2.35"
低剂'M组102029. 10+3.65"
I-注与模型组比较，林P < 0. 01。(2)对福尔马林所致小鼠疼痛的影响在小鼠福尔马林实验中，与模型对照组相比,化合物PAME20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg三个剂量对足底皮下注射5%福尔马林溶液在I相和II相中所引发的小鼠舔，抖动被注射足的持续时间有显著的抑制作用，并呈一定的量效关系；抑制疼痛的效果类似麻醉性镇痛药吗啡的抑制效果。空白组、阳性对照药组、化合物PAME低、中、高剂量组的小鼠福尔马林实验结果，见表2。表2PAME对福尔马林所致小鼠疼痛的影响(mean土SEM)
组别动物剂MI相舔足时间 II相藤足时间
(只) (mg/kg)(0 5 min)(15 25 min)
税项对照 10—83.90±6.4150.40±6.23
Pl I 性对照10105.97±1.36tt0.00±0.00**
高剂 M 组108033.40±4.03**4.60±1.13**
中剂:W:组104037.40±3.18**13.20±3.22**
低剂—M 组102051.20±6.29*20.80±4.13*
注与模型组比较，*P < 0. 05，林P < 0. 01。(3)对小鼠辣椒素所致疼痛的影响在小鼠辣椒素实验中，与模型对照组相比，PAME20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg三个剂量对足底皮下注射辣椒素溶液(I. g，20iil)在0 5min内所引发的小鼠舔和抖动被注射足的持续时间有显著的抑制作用，并呈一定的量效关系。空白组、阳性对照药组、PAME低、中、高剂量组的小鼠辣椒素实验结果详见表3。表3PAME对辣椒素所致小鼠舔、抖足时间的影响(mean土SEM)
权利要求
1.紫花牡荆素在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是紫花牡荆素用于制备镇痛药物的新用途。经动物试验，发现紫花牡荆素具有明显的镇痛作用，因而可用于制备治疗疼痛症状的药物。本发明为制备新的镇痛药物提供了一种药物来源。
文档编号A61P29/00GK102743373SQ201110101590
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者冉霞, 张宏, 秦路平, 贾敏, 郑承剑, 韩婷, 魏艳洁, 黄宝康 申请人:中国人民解放军第二军医大学