专利名称：利用hplc测定手性液液萃取水相布洛芬对映体浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用HPLC法测定手性液液萃取体系水相溶液中布洛芬对映体浓度的方法。
背景技术：
布洛芬(ibuprofen) [(R, S)-2-(_4-异丁基苯基)_丙酸]是一种重要的非甾体药物，因为其镇痛、消炎和退热的作用远比阿司匹林、保泰松和扑热息痛强而备受消费者青睐，多年来一直占据消炎镇痛类药物销售额的榜首。布洛芬分子α位是手性碳原子，存在一对光学活性异构体，化学结构式为
现代药理实验证明，其药理活性主要是S-型布洛芬产生的，S-型布洛芬的疗效比R-型布洛芬高约160倍，且主要的毒副作用都是由R-型布洛芬引起的。因此制备单一的S-布洛芬给药可以显著减小剂量、提高疗效、减少对人体的毒副作用。液液萃取分离布洛芬对映体技术由于在生产过程中易于实现自动化的连续生产以及能耗低的优点，被认为是一项具有开发前景的拆分技术。故建立一种准确测定布洛芬两种对映体浓度的方法，对其生产有重大指导意义，也能够推进手性药物开发技术健康有序的发展。迄今为止，仅有少量文献报道了布洛芬的色谱分析方法，主要由手性流动相添加法和正相色谱直接分析法两大类分析方法，前者比较有代表性的是李成平等(药物分析杂志，2005，25 (4) =426-428)以 Agilent Eclipse XDB-C8 柱作为分析柱，以水甲醇乙腈
=78 17 5，其中羟丙基-β-环糊精的浓度是80mmol/L，0. 2%磷酸，pH=4. 50的
液作为流动相，流速I. Oml/min，分离度约为I. 42，两种对映体的保留时间分别为48min和56min,尽管该方法拆分效果尚可，但是分析时间过长，进行液液萃取实验时往往需要分析的样品较多，该分析方法不利于提高实验效率。关于正相色谱直接法，Crowther等研究者(Anal. Chem.，1984，56，2921-2926)以Pirkle型手性固定相附着于硅胶颗粒上作为手性填
P|Hg:254nm检测波长下，以正己烧异丙醇=97 3(体积比)作为流动相,在2ml/min的流
速下实现了对布洛芬外消旋体的色谱拆分；宋少芳等(药物分析杂质，2002，22(1) :50-52)以Chiral OD-H柱作为分析柱，以正己烷醋酸=99 I作为流动相，成功的对布洛芬对映体实现了分离，该分析方法虽成功实现了布洛芬对映体的分离，但是存在的问题是作为流动相的色谱正己烷价格昂贵，另外该分析方法比较苛刻，溶解样品的溶液需为有机溶剂，且其极性不能大于流动相的极性，否则会降低分离度直至无法达到基线分离，不能满足手性液液萃取体系水相布洛芬对映体浓度的分析要求。因此迫切需要开发一种能够分析手性液液萃取体系水相溶液布洛芬对映体浓度的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用HPLC测定手性液液萃取水相布洛芬对映体浓度的方法，准确测定手性液液萃取水相布洛芬两种对映体的浓度。申请人:发现，以α「酸性糖蛋白类手性柱作为分析柱，以含有甲醇的磷酸钠-磷酸缓冲溶液作为流动相，在适当的检测波长和流速下可以将液液萃取体系水相溶液中的布洛芬对映体进行有效色谱分离，同时对于手性液液萃取体系，由于水相和油相经充分混合振荡，水相溶液中容易混入痕量有机溶剂，此时取样分析会引起色谱峰偏离基线，影响峰面积积分准确性，无法正确分离分析布洛芬对映体，加入甲醇能够显著改善这一状况。本发明采用的检测波长为220nm±3nm时，其中检测波长为220nm时， 紫外吸收强度适中，故检测波长优先选择220nm。本发明采用的缓冲盐溶液的pH值范围6. 5-7. O,使用pH值为7. O时，分离度最高，故选择pH值为7.0。本发明的方法的流动相中，缓冲盐-甲醇混合溶液中甲醇的体积分数是O. 5%-2%，选择甲醇体积分数为2%，原因在于保证达到基线分离的前提下，使用甲醇体积分数2%的流动相进行样品测试可以使分析时间最短，提高分析效率。本发明所述的分离分析方法，可按照以下方法实现(I)待测样品溶液的制备主要分为两种样品溶液的制备①将布洛芬外消旋体用磷酸盐/磷酸溶液溶解，配制成浓度为O. 0006g/L-0. 08g/L的溶液，通过色谱分析，得到布洛芬两种对映体浓度随峰面积的变化关系。②以布洛芬外消旋体溶于磷酸盐/磷酸溶液得到O. 08g/L的布洛芬外消旋体溶液作为水相，以L-酒石酸正戊酯的正辛烷溶液作为油相完成手性液液萃取实验，分液之后取水相布洛芬溶液过滤通过色谱分析得到水相中未知样品的峰面积。(2)样品检测采用以a r酸性糖蛋白作为填料的手性色谱柱，流动相为甲醇-磷酸盐/磷酸缓冲盐溶液，流速为O. 3-0. 5ml/min，检测波长为210_230nm，取步骤(I)制备好的待测样品溶液①和②分别注入HPLC，检测后得到谱图并进行分析，通过对样品溶液①进行分析得到浓度随峰面积变化的标准曲线，将样品溶液②的未知峰面积代入样品溶液①的标准曲线，得到手性液液萃取水相布洛芬两种对映体的浓度。进一步，步骤(2)所述的甲醇的体积分数为O. 5%-2. 0%。进一步，所述的甲醇的体积分数为2%。进一步，所述的磷酸盐为磷酸钠。进一步，步骤(2)使用甲醇-磷酸盐/磷酸缓冲盐溶液的pH值范围为6. 5-7. O。进一步，甲醇-磷酸盐/磷酸缓冲盐溶液的pH值为7. O。进一步,步骤(2)所述的流动相的流速为O. 5ml/min。进一步，步骤(2)所述的检测波长为220nm±3nm。
其中HPLC仪岛津输液单元为LC-20AT，检测器为SPD-20A，脱气机为D⑶_A5s色谱柱AGP(日本 DAICEL 公司，IOOmmX4. 6mm, 5 μ m)手性柱流动相磷酸钠/磷酸缓冲盐甲醇=98 2 (体积比)检测波长220nm流速0.5ml/min
柱温室温由上述技术方案可知，本发明采用以a i-酸性糖蛋白类作为填料的Chiral-AGP(DAICEL公司，IOOmmX 4. 6mm, 5 μ m)手性色谱柱，能够有效的分析分离布洛芬对映体；选择磷酸钠/磷酸缓冲盐溶解样品，确保了溶液的稳定性；加入体积分数2%的甲醇，能够避免液 液萃取体系水相溶液混入的痕量有机溶剂导致的基线偏移，提高了分离分析的准确性；选择进样体积20 μ L，提高了色谱峰的对称性；表明该方法简单、快速、准确、有效，精密度高，重现性良好，为S-布洛芬质量标准的制定建立了基础。
图I实施例1，甲醇(2%)-磷酸钠/磷酸(ρΗ=7· 0)，流速O. 5ml/min的HPLC谱图，测定手性液液萃取实验水相布洛芬溶液两种对映体的浓度，检测波长220nm图2实施例2，甲醇(O. 5%)-磷酸钠/磷酸(pH=6. 5)，流速O. 5ml/min的HPLC谱图，测定布洛芬外消旋体样品浓度为O. 02g/L，检测波长220nm图3实施例3，甲醇(2%)-磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 3ml/min的HPLC谱图，测定布洛芬外消旋体样品浓度为O. 0006g/L，检测波长230nm图4实施例3，甲醇(2%)-磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min的HPLC谱图，测定布洛芬外消旋体样品浓度为O. 08g/L，检测波长210nm图5对比例1，异丙醇(1%)-磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min的HPLC谱图，测定手性液液萃取实验水相布洛芬溶液两种对映体的浓度，检测波长220nm图6对比例2，磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min的HPLC谱图，测定手性液液萃取实验水相布洛芬溶液两种对映体的浓度，检测波长220nm图7对比例3，甲醇(2%)-磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 9ml/min的HPLC谱图，测定手性液液萃取实验水相布洛芬溶液两种对映体的浓度，检测波长220nm
具体实施例方式以下通过具体实例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施实例。以下实施实例中所使用的仪器和药品如下HPLC仪为岛津LC-20AT，紫外检测器SPD-20A，LC-solution色谱工作站，a r酸性糖蛋白类为固定相的AGP色谱柱(DAICEL公司，IOOmmX 4. 6mm, 5 μ m),电子分析天平(美国OHAUS (奥豪斯)公司，十万分之一)，精密离子计(上海大浦化工有限公司)，数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，超纯水系统(美国PALL Corporation) R-布洛芬和S-布洛芬，布洛芬外消旋体，磷酸钠，磷酸，色谱甲醇，色谱异丙醇，色谱乙腈，正辛烷、1，2_ 二氯乙烷，正辛醇为分析纯实施例I配制O. 08g/L布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液和L-酒石酸正戊酯的正辛烷溶液，完成手性液液萃取实验，分液之后取水相布洛芬溶液，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤。采用a i-酸性糖蛋白类作为填料的手性色谱柱，流动相为甲醇(2%)_磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min，检测波长为220nm，进样量为20 μ L。得到样品分析谱图。布洛芬两种对映体的分离度为I. 512，达到基线分离，峰形良好，实现了手性液液萃取实验水相溶液布洛芬两种对映体的分析。实施例2
配制O. 02g/L的布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤。采用a r酸性糖蛋白类AGP手性色谱柱，流动相为甲醇(O. 5%)-磷酸钠/磷酸(pH=6. 5)，流速O. 5ml/min，检测波长为220nm，进样量为20 μ L。得到样品分析谱图。相比较实施例1，布洛芬两种对映体的保留时间分别变为13. 752min和18. 762min，较之甲醇体积分数为2%的保留时间变大，分离度增大为I. 825，能够达到基线分离。实施例3配制O. 0006g/L的布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤。采用a r酸性糖蛋白类AGP手性色谱柱，流动相为甲醇(2%)-磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 3ml/min，检测波长为230nm，进样量为20 μ L。得到样品分析谱图。布洛芬两种对映体的分离度为I. 822，能够达到基线分离。实施例4配制O. 08g/L的布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤。采用a r酸性糖蛋白类AGP手性色谱柱，流动相为甲醇(2%)-磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min，检测波长为210nm，进样量为20 μ L。得到样品分析谱图。布洛芬两种对映体的分离度为I. 508，能够达到基线分离。对比例I采用Ci1-酸性糖蛋白类AGP手性色谱柱，流动相为异丙醇(1%)-磷酸钠/磷酸(ρΗ=7. 0)，流速O. 5ml/min，检测波长为220nm，进样量为20 μ L。以实施例I样品溶液进行分析得到样品分析谱图。相比较实施例1，布洛芬两种对映体的保留时间边为6. 425min和
8.012min，较之甲醇的保留时间明显变短，但是分离度下降为I. 026，不能达到基线分离，布洛芬两种对映体的峰面积有一定比例的重叠，不能满足分析要求。对比例2采用a r酸性糖蛋白类AGP手性色谱柱，流动相为磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速O. 5ml/min，检测波长为220nm，以实施例I样品溶液进行分析得到样品分析谱图。在分析样品时发现，色谱峰容易偏离基线，不能满足定量分析测试布洛芬对映体浓度的要求。对比例3采用a r酸性糖蛋白类AGP手性色谱柱，流动相为甲醇(2%)-磷酸钠/磷酸(pH=7. 0)，流速0. 9ml/min，检测波长为220nm，进样量为20 μ L。以实施例I样品溶液进行分析得到样品分析谱图。较之实施例1，增大流动相流速，分离度降低为I. 075，两种对映体峰面积重叠部分较大，不能满足分析要求。实施例5对本发明测定液液萃取体系水相溶液中布洛芬对映体浓度的方法学考
察I.专属性考察配制O. 01g/L布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤，按照实施例I的色谱条件进行检测，进样量为20 μ L。结果发现R-布洛芬和S-布洛芬分离度为I. 512，能够达到完全的基线分离。2.线性关系考察
分别精确配置O. 0006g/L、0. 001g/L、0. 002g/L、0. 004g/L、0. 006g/L、0. 01g/L、0. 02g/L、0. 04g/L、0. 06g/L和0. 08g/L的布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤，按照实施例I的色谱条件进行检测，进样量为20 μ L。R-布洛芬浓度与峰面积在O. 0003-0. 04g/L浓度范围内呈现良好的线性关系，相关度系数为R2=O. 99975 ；S-布洛芬浓度与峰面积在O. 0003-0. 04g/L浓度范围内呈现良好的线性关系，相关度系数为 R2=O. 99926。3.色谱系统精密度考察配制O. 01g/L布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤，按照实施例I的色谱条件进行检测，进样量为20 μ L，重复进样9次，测定两种对映体浓度，计算相对标准偏差分别为I. 30%和I. 08%。说明该分析方法精密度良好。4.分析方法重现性考察分别配制O. 006g/L布洛芬外消旋体的磷酸钠-磷酸溶液7份，用O. 45 μ m的微孔滤膜过滤，按照实施例I的色谱条件进行检测，进样量为20 μ L，测定两种对映体浓度，计算相对标准偏差分别为I. 58%和I. 60%。表明该方法重现性良好。综上所述，本发明方法能够有效的分析分离布洛芬对映体，能够准确测定手性液液萃取体系水相溶液中布洛芬两种对映异构体的浓度，该方法简单、快速、准确、有效，精密度高，重现性好，是测定手性液液萃取体系水相溶液布洛芬两种对映异构体浓度的理想方法。
权利要求
1.一种利用HPLC测定手性液液萃取水相布洛芬对映体浓度的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)待测样品溶液的制备 制备以下两种样品溶液 ①将布洛芬外消旋体用磷酸盐/磷酸溶液溶解，配制成浓度为O.0006g/L-0. 08g/L的溶液，通过色谱分析，得到布洛芬两种对映体浓度随峰面积的变化关系； ②以布洛芬外消旋体溶于磷酸盐/磷酸溶液得到O.08g/L的布洛芬外消旋体溶液作为水相，以L-酒石酸正戊酯的正辛烷溶液作为油相完成手性液液萃取实验，分液之后取水相布洛芬溶液过滤通过色谱分析得到水相中未知样品的峰面积； (2)样品检测 采用以α「酸性糖蛋白作为填料的手性色谱柱，流动相为甲醇-磷酸盐/磷酸缓冲盐溶液，流速为O. 3-0. 5ml/min，检测波长为210_230nm，取步骤(I)制备好的待测样品溶液①和②分别注入HPLC，检测后得到谱图并进行分析，通过对样品溶液①进行分析得到浓度随峰面积变化的标准曲线，将样品溶液②的未知峰面积代入样品溶液①的标准曲线，得到手性液液萃取水相布洛芬两种对映体的浓度。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的甲醇的体积分数为O. 5%-2. 0%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的甲醇的体积分数为2%。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的磷酸盐为磷酸钠。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)使用甲醇-磷酸盐/磷酸缓冲盐溶液的PH值范围为6. 5-7.0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于甲醇-磷酸盐/磷酸缓冲盐溶液的pH值为7. O。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的流动相的流速为O.5ml/min0
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的检测波长为220nm±3nm。
全文摘要
利用HPLC测定手性液液萃取水相布洛芬对映体浓度的方法，是一种手性液液萃取体系水相中布洛芬两种对映体的浓度的测定方法。该方法采用α1-酸性糖蛋白类手性柱，以甲醇-磷酸盐/磷酸缓冲盐作为流动相，在适当的紫外检测波长和流速下，通过校正曲线法测定手性液液萃取体系水相溶液中布洛芬两种对映体的浓度。该方法能够使布洛芬两种对映体达到基线分离，能够准确测定布洛芬对映体的浓度，该方法简单、快速、准确、有效，精密度高，重现性好，为S-布洛芬质量标准的制定建立了基础。
文档编号G01N30/88GK102890134SQ20121016073
公开日2013年1月23日 申请日期2012年5月22日 优先权日2012年5月22日
发明者任钟旗, 程永琪, 赵丹, 郭志敏, 张卫东, 刘君腾 申请人:北京化工大学