用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，首先利用第一维色谱单元将待测对映体过量值的手性化合物与其他杂质分离并收集至定量环中，再通过两个十通阀的切换，将收集在定量环中的手性对映体转移至配备有手性色谱柱的第二维色谱单元中，利用第二维色谱单元测定得到定量环中的手性化合物的对映体过量值。本发明能够实现混合样品中手性化合物对映体过量值的直接测定，而不需要经过前期复杂的样品纯化过程，从而大大降低了生产成本，缩短了分析时间，同时提高了色谱系统分离能力，应用范围广，尤其适合于不对称合成粗产物中手性药物对映体过量值的测定。
【专利说明】用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及高效液相色谱和手性化合物的分析，具体地说是一种实现混合样品中手性药物对映体过量值的直接测定的二维高效液相色谱方法。
【背景技术】
[0002]在人体中作为生命活动重要基础的生物大分子，如蛋白质、多糖、核酸和酶等，几乎全是手性的，而手性药物要在人体中发挥药效，就必须与生物大分子作用。而含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异:往往一个对映体能很好地与生物手性大分子相互作用从而发挥预期的药理作用，另一个对映体则往往不能很好地相互作用，不但本身没有药效，还会部分抵消药效，甚至还会产生有毒的代谢产物或引起严重的副作用。1992年美国食品与药物监管局(FDA)的药物评价与研发中心(CDER)颁布了手性药物指导原则，要求所有在美国上市的外消旋新药，其生产者均需说明药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性和临床效果，并且当两种异构体有明显的药效和毒理作用差异时，必须以单一异构体的药品形式上市。欧共体国家及日本、加拿大等国随后也制订了类似的法规。
[0003]因此，单一构型的药物对于医药研发极为重要，从而大大促进了不对称合成的发展。而在不对称合成中，最为重要的就是不对称合成产物中目标手性药物的对映体过量值的测定，因此迫切需要寻找高通量快速测定对映体过量值的方法，以缩短不对称合成中不对称催化剂的筛选时间及不对称药物的研发周期，促进不对称合成的发展。现有的测定方法是将复杂混合样品溶液预处理后，再进行一维高效液相色谱分析，步骤一般包括:首先通过传统的柱层析色谱进行分离纯化，去除反应物、副产物、中间产物、溶剂、催化剂等杂质，再将纯化后的待测样品进行高效液相色谱、气相色谱等常规对映体过量值的测定。该测定对映体过量值的传统方法步骤繁琐耗时，且耗费的溶剂量大、对环境影响较大。
[0004]对比常规测定所采用的一维高效液相色谱，在线二维色谱技术具有高效、准确、快速等优点，在中草药成分分析、复杂样品的分析检测等方面应用广泛。同时由于可以实现从混合溶液到色谱分析一步式对映体过量值的测定，在线二维色谱测定方法具有更高的准确性。因此利用在线二维色谱技术用于混合样品中手性药物对映体过量值的测定能够大大提高不对称合成的效率，缩短手性新药的研发周期。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、高通量快速测定的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，包括第一维色谱单元、第二维色谱单元和两个十通阀，所述的第一维色谱单元包括第一维输液泵、第一维色谱柱、自动进样器及DAD检测器；所述的第二维色谱单元包括第二维输液泵、第二维色谱柱；定量环以及两个十通阀作为第一维液相和第二维液相的转换接口，其中:第一维色谱柱的进口端及出口端分别与自动进样器及第一十通阀的I号接口相连，自动进样器与第一维输液泵连接；第二维色谱柱的进口端及出口端分别与第一十通阀的5号接口及9号接口相连；定量环的两端接口分别与第二十通阀的9号和6号接口相连；DAD检测器与第二十通阀的7号接口相连；第二维输液泵与第一十通阀的4号接口相连；第一十通阀的2号接口与废液缸相连；第一十通阀的10号接口与第二十通阀的8号接口相连；第一十通阀的3号接口与第二十通阀的10号接口相连；第一十通阀的6号接口与第二十通阀的5号接口相连；所述的第一十通阀和第二十通阀的其他接口无连接；在线测定步骤如下:
[0007](I)将第一维色谱柱及第二维色谱柱安装于高效液相色谱仪上；
[0008](2)将需测定对映体过量值的混合溶液加入至色谱进样瓶中；
[0009](3)通过自动进样器进样，此时第一十通阀位置为10-1即10号接口与I号接口连通，第二十通阀位置为1-2即I号接口与2号接口连通；
[0010](4)待极性较小的杂质经过DAD检测器，而待检测的手性对映体即将从第一维色谱柱上洗脱下来时，第一十通阀位置保持为10-1，第二十通阀位置切换至10-1，此时待检测的手性对映体被收集至定量环中；
[0011](5)当待检测的手性对映体已完全从第一维色谱柱上洗脱下来并进入定量环后，第一十通阀位置保持为10-1，第二十通阀位置切换至1-2，继续第一维分离，将极性较大的杂质从第一维色谱柱上洗脱下来；
[0012](6)待第一维色谱柱中极性较大的杂质被洗脱完全后，第一十通阀位置切换至1-2，第二十通阀位置保持为1-2，以进行第二维色谱的分离；在第二维色谱的分离中，待检测手性化合物的(R)，(S)构型的在第二维色谱柱上被分离，并依次经过DAD检测器、获得色谱图，通过计算色谱图中(R)，(S)构型的峰面积得到对映体过量值。
[0013]所述的第一维色谱柱为正相氨基柱。
[0014]所述的第二维色谱柱为正相手性柱。
[0015]所用的高效液相色谱仪为Dionex Ultimate3000系统。
[0016]上述步骤(2)中将需测定对映体过量值的混合溶液经过液相过膜处理后直接加入至色谱进样瓶中，膜的滤孔为0.45 μ m。
[0017]采用上述技术方案的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，选择使用在线二维高效液相色谱代替传统的一维高效液相色谱，该在线二维高效液相色谱系统包含了第一维色谱单元、第二维色谱单元、定量环和两个十通阀。该第一维高效液相色谱等效于传统对映体过量值测定方法中手性药物的层析柱分离纯化过程，即利用无手性分离能力的氨基柱将反应物、副产物、催化剂、溶剂等杂质与目标手性药物分离，并通过两个十通阀的切换实现目标手性药物的收集(收集于定量环中)。该第二维高效液相色谱等效于传统测定方法中利用一维手性色谱测定对映体过量值的步骤，即采用合适的手性柱对目标手性药物进行手性分离分析，通过色谱图上的(R)，(S)构型对应的色谱峰计算得到对映体过量值。
[0018]本发明能够对包含有手性药物对映体的混合溶液直接进行高效液相色谱分析，无需测定手性药物对映体过量值常规方法中所必须的样品预分离、纯化步骤，可以直接获得混合溶液中手性药物的对映体过量值。对比常规测定方法，本发明能节省溶剂，无需样品进样前的纯化分离，大大节约分析时间。同时，本发明操作简单，易于实现自动化，进样过程中十通阀均可自动切换，设定好条件后即可大批量、连续地进行混合溶液中手性化合物对映体过量值的测定。
[0019]综上所述，本发明是一种操作简单、高通量快速测定的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明第一维色谱单元、第二维色谱单元、定量环以及两个十通阀的连接示意图。
[0021]图2为本发明测定混合样品中手性化合物对映体过量值的在线二维色谱方法的一般分析步骤，以及不同分析步骤过程中阀的切换与管路的连接。
[0022]图3为实施例中不对称合成反应方程式。
[0023]图4为实施例中在线二维色谱分析的一般色谱图及三维色谱图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0025]实施例1:
[0026]液相的部件连接请参照图1，用于测定的在线二维色谱系统包括第一维色谱单元、第二维色谱单元和两个十通阀，其连接如下:第一维色谱单元包括第一维输液泵11、第一维色谱柱13、自动进样器12及D`AD检测器20 ;第二维色谱单元包括第二维输液泵16、第二维色谱柱14 ;定量环18以及两个十通阀作为第一维液相和第二维液相的转换接口，其中:第一维色谱柱13的进口端及出口端分别与自动进样器12及第一十通阀15的I号接口相连，自动进样器12与第一维输液泵11连接；第二维色谱柱14的进口端及出口端分别与第一^h通阀15的5号接口及9号接口相连；定量环18的两端接口分别与第二十通阀19的9号和6号接口相连；DAD检测器20与第二十通阀19的7号接口相连；第二维输液泵16与第一十通阀15的4号接口相连；第一十通阀15的2号接口与废液缸17相连；第一十通阀15的10号接口与第二十通阀19的8号接口相连；第一^h通阀15的3号接口与第二十通阀19的10号接口相连；第一^h通阀15的6号接口与第二十通阀19的5号接口相连；所述的第一^h通阀15和第二十通阀19的其他接口无连接；
[0027]本实施例中，用于测试的混合样品来自于不对称合成的粗产物，其合成反应步骤如下:将1.0mmol2_氨基苯乙酮、1.5mmol苯甲醒及0.1mmol手性催化剂Hua Cat加入到
1.0mL甲醇中，常温下磁力搅拌48h，反应生成具有手性碳原子的2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮(反应方程式如图3所示)，反应溶液即为本实施例中所需测定(R，S)-2-苯基-2，3-二氢喹诺酮对映体过量值的混合溶液。
[0028]本实施例中，第一维色谱柱13为正相氨基柱(150mmX4.6mm, 5 μ m),第二维色谱柱14为大赛猫正相手性Chiralpak 0D-H柱(250_X4.6mm, 5 μ m)。定量环的体积为5.0mL。第一维色谱和第二维色谱均使用色谱纯的正己烷和色谱纯的异丙醇作为流动相，第一维液相使用梯度洗脱(0_7min:正己烷与异丙醇的体积比为98:2 ;7_7.9min:正己烷与异丙醇的体积比从98:2到70:30 ；7.9_12min:正己烷与异丙醇的体积比为70:30)，第二维液相使用等度洗脱(正己烷与异丙醇的体积比为70:30)，流速为1.0mL/min，检测波长为365nm，紫外扫描范围为200-400nm。
[0029]本实施例中，混合溶液中(R，S)-2-苯基-2，3-二氢喹诺酮的对映体过量值在线二维色谱测定的操作步骤如下:
[0030](I)将作为第一维色谱柱13的氨基柱及第二维色谱手性Chiralpak OD-H柱分别安装于高效液相色谱系统上。直接从不对称合成反应溶液中取样，将含(R，S)-2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮的混合溶液经过膜(滤孔为0.45 μ m的膜)处理后加入至色谱进样瓶中。
[0031](2)将第一^h通阀15位置设定为10-1,第二十通阀19位置为1_2，并开启第一维输液泵11(1.0mL/min)、DAD检测器20 (365nm)、柱温箱(恒温25°C )。待检测器的基线平稳后，将准备好的样品通过自动进样器进样。
[0032](3)由于第一维色谱柱13为正相氨基柱，因此极性小的物质保留能力差，首先被洗脱下来，待极性较小的杂质经过DAD检测器20，而待检测的(R，S) -2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮即将从第一维正相氨基柱上洗脱下来时(保留时间为7.9min时)，第一十通阀15位置保持为10-1，第二十通阀19位置切换至10-1，此时，(R, S)-2-苯基-2，3-二氢喹诺酮被收集至5.0mL的定量环18中。
[0033](4)待(R，S)-2-苯基-2，3-二氢喹诺酮已完全从第一维正相氨基柱上洗脱下来并进入定量环18后(保留时间为10.0min时)，第一十通阀15位置保持为10_1，第二十通阀19位置切换至1-2，继续第一维分离，此时将极性较大的杂质从第一维色谱柱13上洗脱下来。
[0034](5)待第一维色谱柱13中极性较大的杂质被洗脱完全后(保留时间为12.0min时)，第一十通阀15位置切换至1-2，第二十通阀19位置保持为1-2，并开启第二维输液泵16 (1.0mL/min)，关闭第一维输液泵11，以进行第二维色谱的分离。在第二维色谱的分离中，(R) -2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮与(S) -2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮在ChiralpakOD-H柱上被分离，并依次经过DAD检测器20，通过计算色谱图中(R) -2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮与
(S)-2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮的色谱峰面积得到对映体过量值为35.83%。
[0035]其365nm检测波长下的色谱图及200_400nm扫描的三维色谱图如图3所示，从图中可以看出7.9-10.0min时的洗脱液被收集至定量环中，因此检测器的响应为0，而当进行二维分析时(保留时间为12.0-35.0min)，之前被收集在定量环中的(R)_2_苯基-2，3-二氢喹诺酮与(S) -2-苯基-2，3- 二氢喹诺酮被Chiralpak OD-H柱分离并依次经过检测器,并呈现良好的分离度，本实施例很好地说明了本测定方法的可行性。
[0036]与传统测定不对称合成粗产物中对映体过量值的方法相比，本发明不需要进样前复杂费时的柱层析纯化步骤，可以实现包含有反应物底液在内的混合溶液中手性化合物对映体过量值的直接测定。同时由于可以直接从反应溶液中取样进行测定，因此可以实现不对称合成反应中对映体过量值及产率的实时监测。
[0037]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.一种用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，包括第一维色谱单元、第二维色谱单元和两个十通阀，所述的第一维色谱单元包括第一维输液泵(11)、第一维色谱柱(13)、自动进样器(12)及DAD检测器(20);所述的第二维色谱单元包括第二维输液泵(16)、第二维色谱柱(14);定量环(18)以及两个十通阀作为第一维液相和第二维液相的转换接口，其中:第一维色谱柱(13)的进口端及出口端分别与自动进样器(12)及第一十通阀(15)的I号接口相连，自动进样器(12)与第一维输液泵(11)连接；第二维色谱柱(14)的进口端及出口端分别与第一^h通阀(15)的5号接口及9号接口相连；定量环(18)的两端接口分别与第二十通阀(19)的9号和6号接口相连；DAD检测器(20)与第二十通阀(19)的7号接口相连；第二维输液泵(16)与第一十通阀(15)的4号接口相连；第一十通阀(15)的2号接口与废液缸(17)相连；第一^h通阀(15)的10号接口与第二十通阀(19)的8号接口相连；第一十通阀(15)的3号接口与第二十通阀(19)的10号接口相连；第一十通阀(15)的6号接口与第二十通阀(19)的5号接口相连；所述的第一十通阀(15)和第二十通阀(19)的其他接口无连接；其特征在于:在线测定步骤如下: (1)将第一维色谱柱(13)及第二维色谱柱(14)安装于高效液相色谱仪上； (2)将需测定对映体过量值的混合溶液加入至色谱进样瓶中； (3)通过自动进样器(12)进样，此时第一十通阀(15)位置为10-1即10号接口与I号接口连通，第二十通阀(19)位置为1-2即I号接口与2号接口连通； (4)待极性较小的杂质经过DAD检测器(20)，而待检测的手性对映体即将从第一维色谱柱(13)上洗脱下来时，第一十通阀(15)位置保持为10-1，第二十通阀(19)位置切换至10-1，此时待检测的手性对映体被收集至定量环(18)中； (5)当待检测的手性对映体已完全从第一维色谱柱(13)上洗脱下来并进入定量环(18)后，第一十通阀(15)位置保持为10-1，第二十通阀(19)位置切换至1-2，继续第一维分离，将极性较大的杂质从第一维色谱柱(13)上洗脱下来； (6)待第一维色谱柱(13)中极性较大的杂质被洗脱完全后，第一十通阀(15)位置切换至1-2，第二十通阀(19)位置保持为1-2，以进行第二维色谱的分离；在第二维色谱的分离中，待检测手性化合物的(R)，(S)构型的在第二维色谱柱(14)上被分离，并依次经过DAD检测器(20)、获得色谱图，通过计算色谱图中(R)，(S)构型的峰面积得到对映体过量值。
2.根据权利要求1所述的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，其特征在于:所述的第一维色谱柱(13)为正相氨基柱。
3.根据权利要求1或2所述的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，其特征在于:所述的第二维色谱柱(14)为正相手性柱。
4.根据权利要求1或2所述的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，其特征在于:所用的高效液相色谱仪为Dionex Ultimate3000系统。
5.根据权利要求1或2所述的用于混合样品中手性化合物对映体过量值直接测定的方法，其特征在于:上述步骤(2)中将需测定对映体过量值的混合溶液经过液相过膜处理后直接加入至色谱进样瓶中，膜的滤孔为0.45 μ m。
【文档编号】G01N30/88GK103558325SQ201310532913
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】陈晓青, 刘琦, 阳华, 蒋新宇 申请人:中南大学