一种生物法合成(r)-(-)-扁桃酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法。
【背景技术】
[0002] 扁桃酸是极其重要的手性药物中间体，具有消炎和杀菌的双重作用。目前，在国际 市场上，对扁桃酸的需求约以年均10%左右的速度增长，尤其是（R)-扁桃酸早已成 为国内外急需的产品。
[0003] (R)-(-)-扁桃酸及其衍生物是合成环扁桃酯、羟苄唑、匹莫林等血管扩张剂、杀 菌剂、镇痉剂的重要药物中间体，且具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆 分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如止咳 药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由（R)-扁桃酸拆分。
[0004] 目前，常见的制备扁桃酸旋光性单体的方法大致有：（1)物理化学法，其中包括不 对称合成法、光学异构体拆分法和层析法等，不对称合成法可直接化学合成扁桃酸的异构 体，拆分法先合成外消旋体扁桃酸，再拆分获得手性扁桃酸；(2)生物合成法，国外文献报 道制备手性扁桃酸大致有3种方法：
[0005] 1、以苯甲醛和氢氰酸为原料，先制得扁桃腈，后在腈水解酶的作用下，得到（R)- (-)-扁桃酸，但是该方法仅是（R)-(-)-扁桃酸生产的一种研宄方向，由于受限于已知 的腈水解酶活力较低，目前还达不到工业化生产的要求。
[0006] 2、先合成扁桃酸外消旋体，而后酯化或氨解获得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺，再在酯 化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到单一对映体扁桃酸，但是该方法同样仅是（R)- 扁桃酸生产的一种研宄方向，目前受限于已知的酯化水解酶及酰胺水解酶活力较低，立体 选择型较差，得到的（R)-(-)-扁桃酸纯度低，目前也达不到工业应用的要求。
[0007] 3、以苯乙酮酸为底物直接利用具有氧化还原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，但 是该方法也仅是一种研宄方向，同样受限于目前已报道的酶活力低等问题，工业化应用困 难。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于提供一种生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法，该方法的 反应条件温和，并且原料扁桃腈具有较高的转化率。
[0009] 为达到上述目的，本发明的解决方案是：
[0010] 一种生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法，其包括如下步骤：将扁桃腈流加入转 化液中，在pH为6. 0 - 9. 0和温度为20 - 40°C的条件下反应20 - 24h，停止流加并继续反 应2 - 6h，得到（R)-(-)-扁桃酸；其中，上述的转化液含有用于分泌J2315腈水解酶的 E. co Ii工程菌。
[0011] 其中，整个流加反应过程（20 -24h)可以分为若干个不同的阶段，每个阶段采用不 同的流加速度，但要确保前一个阶段的流加速度大于后一个阶段的流加速度。在本发明的 优选实施例中，整个流加反应过程（20 - 24h)可以分为两个阶段，在第一个阶段（10 - 12h) 将扁桃腈以第一流加速度进行流加，在第二个阶段（即剩余的流加反应时间）以第二流加 速度进行流加，但要保证第一流加速度大于第二流加速度。
[0012] 进一步地，第一流加速度可以为10 - 第二流加速度可以为 5 - 20gL 1Ii %另外，第一流加速度还可以优选为15 - 35gL 1IiΛ第二流加速度还可以优选 为7. 5 - 17. 5gL_ 1IT%进一步地，第一流加速度还可以优选为20 - 30gL IΛ第二流加速度 还可以优选为10 - ISgIZ1IT%更进一步地，第一流加速度还可以优选为24gL "IT1，第二流 加速度还可以优选为12gL 1I1入
[0013] 在本发明的优选实施例中，pH可以优选为7 -8. 5,还可以进一步优选为7. 9 -8. 1。
[0014] 在本发明的优选实施例中，温度可以优选为25 -37°C，还可以进一步优选为30°C。
[0015] 在上述步骤中，转化液的制备方法包括如下步骤：
[0016] (1)、将E. coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；
[0017] (2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6. 0 - 9. 0的缓冲液中，得到转化液。
[0018] 其中，在步骤（1)中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16-eogL1、蛋白胨 12 - SOgL - 1、甘油 I - 500mlL -^K2HPOJt 75gL -^KH2PO4S. dTgL - ^MgSOJgL - 1。
[0019] 在步骤（2)中的转化液中，静息细胞的浓度大于IOgL S可以优选为10 -100gLΛ 还可以更优选为10 - 50gL Λ可以最优选为10 - 。
[0020] 步骤（2)中的缓冲液为 NaH2P04/Na2HP04缓冲液、KH 2Ρ04/Κ2ΗΡ04缓冲液、Tris - HCl 缓冲液或其他任何常用PH缓冲液中的任意一种；步骤（2)中还可以添加扁桃腈的助溶剂， 助溶剂为体积分数为1%_25%的甲醇、体积分数为1%-25%的乙醇、体积分数为1%-25% 的异丙醇、体积分数为1% - 25%的正己烷或其他任何常用有机溶剂中的任意一种或几种。
[0021] 进一步地，步骤（2)中的缓冲液的浓度还可以为20 - 200mM，助溶剂的体积分数还 可以为5% - 10%。
[0022] 由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0023] 本发明的方法以扁桃腈为起始原料，利用高密度发酵获得的静息细胞（用于分泌 J2315腈水解酶）为生物催化剂，并采用具有较高水解活性的J2315腈水解酶和扁桃腈的 流加工艺相结合来生产（R)-扁桃酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污 染，而且能够通过不断控制扁桃腈的加入来实现（R)-扁桃酸的高浓度积累，使单批 次反应（R)-(-)-扁桃酸积累浓度高达2. 9M，ee值大于97 %，扁桃腈转化率大于99 %，， 从而具有良好的工业化应用前景。另外，本发明的方法成本低廉，能耗也较低。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明的静息细胞催化水解扁桃腈合成（R)-(-)-扁桃酸反应进程曲线 图。
【具体实施方式】
[0025] 本发明公开了一种生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法，该方法包括如下步骤：
[0026] (1)、将用于分泌J2315腈水解酶的E. coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养， 离心以得到静息细胞；
[0027] (2)、收集步骤（1)所得的静息细胞，将该静息细胞悬浮于pH为6. 0 - 9. 0的缓冲 液中，得到转化液；
[0028] (3)、将扁桃腈流加入步骤⑵所得的转化液中，在pH为6.0-9.0和温度为 20 - 40°C的条件下反应20 - 24h (即流加反应阶段），然后停止流加，继续反应2 - 6h (即非 流加反应阶段），得到（R)-(-)-扁桃酸。
[0029] 其中，在步骤（1)中，J2315腈水解酶（BCJ2315)是伯克霍尔德氏菌J2315菌 株（Burkholderiacenocepacia J2315)分泌的。用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工 程菌是通过在Escherichia coli M15中克隆BCJ2315基因并且过表达从而构建而成的 E.coli M15/BCJ2315 重组体（Recombinant E.coli M15/BCJ2315)。关于该 E.coli 工程 菌，请详见Wang等人在BMC Biotechnology 2013, 13:14公开的非专利文献《Discovery and characterization of a highly efficient enantioselective mandelonitrile hydrolase from BurkholderiacenocepaciaJ2315by phylogeny - based enzymatic substrate specificity prediction〉〉的记载。
[0030] 步骤（I)中的发酵培养基含有以下组分并且每种组分的含量如下：酵母膏 16 - 60g/L、蛋白胨 12 - 80gL -\ 甘油 I - 500mlL -\ Κ2ΗΡ0424· 75gL -\ ΚΗ2Ρ043· 47gL -\ MgSO4IgL 1O
[0031] 在步骤⑴中，还可以根据实际情况添加发酵补料培养基。
[0032] 在步骤⑵所得的转化液中，静息细胞的浓度应大于IOgL \优选为10 -100gL S 更优选为10 - SOgL1，最优选为10 - ZOgL1。催化反应所需的J2315腈水解酶是通过静息 细胞分泌的，所以静息细胞的浓度影响的是J2315腈水解酶的浓度。而J2315腈水解酶的 浓度越高则相对的催化效率越高，即单位时间内扁桃腈的转化量越高。理论上随着静息细 胞的浓度的提高，第一流加速度是可以成比例增加的，即第一流加速度所需静息细胞的浓 度等于在15 - 20min内能够完全转化IOOmM扁桃腈的静息细胞的浓度。
[0033] 步骤⑵中的缓冲液为NaH2P04/Na2HP0jl冲液、KH 2Ρ04/Κ2ΗΡ04缓冲液中、Tris - HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。
[0034] 步骤（2)中除了添加缓冲液外，还可以添加扁桃腈的助溶剂，助溶剂为体积分数 为1% -25%的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。该缓冲液的浓度可以为 20 - 200mM，助溶剂添加量可以为5% - 10% (v/v)。
[0035] 在步骤（3)中，扁桃腈在整个流加反应过程的不同阶段可以以不同的流加速度进 行流加。在流加反应初始的10 - 12h，扁桃腈可以以第一流加速度进行流加，在剩余的流加 反应时间内，扁桃腈可以以第二流加速度进行流加，但第一流加速度应大于第二流加速度， 并且优选为第二流加速度的两倍。本发明在整个流加反应过程（20 -24h)的不同阶段采用 不同的流加速度进行流加的原因如下：扁桃腈对J2315腈水解酶具有一定的毒性，随着流 加反应的进行，J2315腈水解酶的催化效率会逐渐降低。第一流加速度采用较大的数值能 够充分利用J2315腈水解酶的最高催化效率，而当J2315腈水解酶的催化效率降低至一定 程度，则采用第二流加速度从而保证扁桃腈被充分转化。如果整个流加反应的全过程只采 用第一流加速度则会导致扁桃腈转化效率降低，而整个流加反应的全过程均采用第二流加 速度则会导致J2315腈水解酶的催化效率的浪费。
[0036] 整个反应过程中J2315腈水解酶的催化效率由于受到扁桃腈毒性的影响是逐渐 降低的，从而导致在每小时中能够转化的扁桃腈的量是逐渐降低的。第一流加速度可以认 为是在J2315腈水解酶的催化效率最高的情况下每小时可以转化的扁桃腈的量，当J2315 腈水解酶的催化效率降低时，为保证扁桃腈能够完全转化则需要降低扁桃腈的流加速度。 若从整个反应的全局考虑，则只需保证反应结束时扁桃腈能够达到理论上1