一种用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供一种专用发酵培养基，尤其涉及一种用于异源表达埃博霉素基因的黄 色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基，属于抗肿瘤药物制备发酵培养基技术领域。
【背景技术】
[0002] 埃博霉素巧pothilones)是一类极具应用前景的抗肿瘤药物。埃博霉素类化合物 属于聚丽类的大环内脂化合物，对聚合微管有很强的稳定作用，作用机制和紫杉醇相似，并 且在水溶性、细胞毒性和耐药性等方面化于紫杉醇，被认为是紫杉醇的更新换代产品，是更 好的抗癌药物。
[0003]目前，埃博霉素的制备方法主要有化学合成法和生物合成法。化学全合成法由于 步骤繁多，得率较低，与生物发酵法相比不具备成本化势，因此生物合成法成为埃博霉素生 产制备的主流方向。
[0004] 通过生物合成法制备埃博霉素主要有两个类别的发酵菌株；一是埃博霉素的原始 产生菌纤维堆囊菌，主要存在的问题是菌株的生长代时较长巧-16h)而且遗传操作极为困 难；第二类是异源表达博霉素合成基因的黄色粘球菌，该类菌株具有代时短（4h左右），生 长旺盛，不易污染，并且遗传操作便利，有利于后续的工程化改造等化点。化lien等人利用 CMM培养基批次发酵异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌DZ1菌株，产物中埃博霉素A的产 量最高约为化05mg化，埃博霉素B的产量最高约为化33mg化巧巧an化lien,SanjaySh址. HeterologousexpressionofepothilonebiosyntheticgenesinMyxococcusxanthus. 《Antimicrobialagentsandchemotherapy》2002,第46卷（第9期））。但此发酵产量距 离工业化生产的要求还有相当距离。目前，对于黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基组 成和化化的相关文献报道较少，因此如何获得能够有效提高发酵产量与效率的、适用于异 源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基成为亟待解决的课题。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能够用于异源表达埃博霉 素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基，从而有效地提高埃博霉素的发酵产量与 效率。
[0006] 本发明所述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培 养基（简称为0CM培养基），其特征在于；所述培养基组分及含量为；酪蛋白腺lOg/L， M巧〇4? 7&0 1.Og化，3-(N-吗琳基）丙横酸钢盐2. 07g/L，顺式-9-十八締酸甲醋5-15血/ L，苏氨酸化8-1.6g化，甲硫氨酸化5-1. 2g化，丙酸钟1. 0-3.Og化，微量元素溶液1血化，大 孔吸附树脂XAD-16 20血化；其中，所述微量元素溶液配方是；MnCl2?地2〇lOOmg/L，C0CI2 20mg化，CuS〇410mg/L，Na2Mo〇4*2H2〇lOmg化，ZnCl220mg/L，LiCl5mg化，SnCl2*2H2〇 5mg/ L，H3BO3lOmg/L，邸r20mg/L，KI20mg化。
[0007] 上述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基中J顿 式-9-十八締酸甲醋的添加量化选为10血化。
[0008] 上述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基中，苏 氨酸的添加量化选为1. 2g化。
[0009] 上述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基中，甲 硫氨酸的添加量化选为0. 8g化。
[0010] 上述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基中，丙 酸钟的添加量化化选为2. Og化。
[0011] 上述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基最化 选的实施方式是；组分及含量为：酪蛋白腺lOg/L，M巧〇4 ? 7&0 1. Og化，3-的-吗琳基）丙 横酸钢盐2. 07g/L，顺式-9-十八締酸甲醋10血化，苏氨酸1. 2g化，甲硫氨酸化8g化，丙酸 钟2. Og化，微量元素溶液1血化，大孔吸附树脂XAD-16 20血化。
[0012] 上述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基中，所 述异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌化选是黄色粘球菌（Myxococcus xanthus)DZ。
[0013] 本发明公开的用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培 养基（0CM培养基）中，显著的特点是添加了5-15血化顺式-9-十八締酸甲醋（又名油酸甲 醋），化8-1. 6g化苏氨酸，0. 5-1. 2g/L甲硫氨酸和1. 0-3. Og化丙酸钟。进一步的化化实施 方式是顺式-9-十八締酸甲醋的添加量最化化为lOmlVL，苏氨酸的添加量最化化为1. 2g/ L，甲硫氨酸的添加量最化化为0. 8g化，丙酸钟的添加量最化化为2. Og化。实验证实，该种 组成和化化可W显著提高埃博霉素类化合物的发酵水平和效率。
[0014] 本发明所述0CM培养基在利用异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵生产埃 博霉素中的应用。
[0015] 其中，所述发酵生产埃博霉素的方法是：将活化后的黄色粘球菌在0CM液体发酵 培养基中，于地7.5、30±2^、200±10巧111的条件下发酵培养4±1天，获得含埃博霉素的发 酵液。
[0016] 进一步的，所述黄色粘球菌化选是黄色粘球菌（Myxococcus xanthus)DZ菌株。
[0017] 具体的，利用本发明所述0CM培养基在发酵生产埃博霉素中的应用方法是：
[0018] (1)发酵菌株的选择；粘细菌菌株中的黄色粘球菌（Myxococcus xanthus)DZ菌 株。
[0019] 似菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30°C培养3天，再接种至 液体培养基，30°C，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0020]其中，
[0021] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白腺1%，M巧〇4? 7&0 8mM，化is ? HC1(地 7.6)1〇1111，邸2口〇4化肥〇4师7.。11111，巧7.6。固体培养基加入1.5%的琼脂，121巧显热灭 菌30min。
[002引所述液体培养基的成分为；酪蛋白腺1%，酵母膏化5%，M巧04 ? 7&0 4mM，MOPS lOmM ;pH 7. 6。121°C湿热灭菌30min。
[0023] (3)发酵培养方式；取步骤（2)制得的菌液3血分别接种至对照培养基和OCM培 养基中，于地7. 5, 30 +2°C，200 + 10巧m的条件下发酵培养4 + 1天。
[0024]其中，
[0025] 所述对照培养基组分及含量为：酪蛋白腺1 %，酵母膏化5%，M巧〇4? 7&0 4mM， MOPSlOmM，微量元素溶液1血化，大孔吸附树脂XAD-16 20血化；其中，所述微量元素溶液 配方是；MnCl2?地2〇lOOmg/L，C0CI220mg/L，CuS〇4lOmg/L，化2M0O4?細2〇lOmg/L，ZnCl2 20mg/L，LiCl5mg/L，SnCl2? 2&0 5mg化，H3BO3lOmg/L，邸r20mg/L，KI20mg/L。
[0026] (4)埃博霉素的分离提取纯化；发酵4天后用80目筛网过滤收集检测量的树脂于 10ml离屯、管中，加入3ml甲醇过夜浸提。取1ml浸提液1200化pm,离屯、10分钟，过化22iim 有机相滤器，HPLC检测。
[0027] (5)色谱检测条件：
[0028]色谱柱；Shim-packMRC-孤S, 4. 6mmX250mm
[0029] 流动相：甲醇-水（体积比55: 4巧
[0030]流速；0. 7ml/min
[0031] 紫外检测波长；249nm;进样量；10iiL
[0032] 化）根据吸收峰面积与埃博霉素浓度的关系曲线计算埃博霉素的产量，王组结果 取平均值并计算误差。
[0033] 对比试验结果表明：
[0034] 与对照培养基相比，使用含有本发明所述的0CM液体发酵培养基，显著提高了埃 博霉素的产量。
[0035] 具体的，埃博霉素产生差别如表1所示。
[0036] 表1;不同培养基发酵埃博霉素的产量比较表
[0037]
[0038] 上表中结果显示利用0CM培养基发酵异源表达埃博霉素合成基因的黄色粘球菌 时，埃博霉素的发酵产量与效率得到了显著提高。与对照培养基相比，埃博霉素A的产量提 高了 30倍左右，与对比文献报道的结果相比，埃博霉素A的产量提高了 18倍左右；与对照 培养基相比，埃博霉素B的产量提高了 17.6倍左右，与对比文献报道的结果相比，埃博霉素 A的产量提高了 7倍左右。
[0039] 本发明提供的用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培 养基，通过向基本培养基中添加顺式-9-十八締酸甲醋、苏氨酸、甲硫氨酸和丙酸钟等组 分，实现了显著提高埃博霉素类化合物的发酵水平和效率。本发明的有益效果体现在；（1) 公开的0CM培养基成分廉价易得，水溶性好，配制简便。（2)利用本发明的0CM培养基进行埃 博霉素发酵，可W使埃博霉素异源表达水平大幅度提升；与对照培养基相比，埃博霉素A的 产量提高了 30倍左右，与对比文献报道的结果相比，埃博霉素A的产量提高了 18倍左右； 与对照培养基相比，埃博霉素B的产量提高了 17.6倍左右，与对比文献报道的结果相比，埃 博霉素A的产量提高了 7倍左右。基本满足了利用异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌工 业化发酵生产埃博霉素的要求，具有良好应用前景。
【附图说明】
[0040] 图1 ;发酵产物HPLC检测示意图
[0041] 其中；实线为OCM培养基发酵产物，虚线为对照培养基发酵产物。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合本发明提供了一种用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备 埃博霉素的培养基（OCM培养基），进一步描述其在利用异源表达埃博霉素基因的黄色粘球 菌发酵生产埃博霉素中的应用。所述内容是对本发明的解释而不是限定。
[0043] 实施例1 :
[0044] (1)发酵菌株的选择；粘细菌菌株中的黄色粘球菌（Myxococcusxanthus)DZ菌 株。
[0045] 似菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，30°C培养3天，再接种至 液体培养基，30°C，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0046]其中，
[0047] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白腺1%，M巧〇4?7&08mM，化is? HC1 (地 7.6)1〇1111，邸2口〇4化肥〇4师7.。11111，巧7.6。固体培养基