一株埃博霉素高产菌及其在发酵产埃博霉素中的应用的制作方法
【专利摘要】一株埃博霉素高产菌及其在发酵产埃博霉素中的应用，分类命名为溶纤维素粘细菌（Sporangiumcellulosum）YU-970，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC?NO：M2014144。在5L发酵罐中，本发明菌株发酵埃博霉素a的效价有出发菌的2.37mg/L提升到315.95mg/L，相比原始出发菌提高了132倍，发酵埃博霉素b的效价有出发菌的1.02mg/L提升到290.37mg/L，相比原始出发菌提高了283倍。本发明菌株完全符合工业化埃博霉素生产的技术指标，可用于工业化发酵生产，有重大的社会科研意义和经济价值。
【专利说明】一株埃博霉素高产菌及其在发酵产埃博霉素中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株埃博霉素高产菌及在发酵生产埃博霉素中的应用，属于微生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]埃博霉素具有很强的抗肿瘤活性，能在较低的浓度杀死癌细胞。为此选择合适的产埃博霉素菌种价值重大。它与紫杉醇具有相同的抑制肿瘤细胞生长的作用机制，并且对多重耐药肿瘤细胞和耐紫杉醇的肿瘤细胞均表现强大的抗癌活性。除具有活性方面的优势之外，埃博霉素具有较紫杉醇简单的化学结构和良好的水溶性，而且可以发酵法生产。因此从1995年发现Epothilone的微管解聚抑制活性以来,其相关研究已引起全球的极大的热情和关注。紫杉醇现有资源破坏严重，后续资源严重不足，埃博霉素作为紫杉醇的优质替代品，不仅是一种优质的产品，更是一种宝贵的资源，被越来越多的学者认为是抗癌药物的一次新的革命。
[0003]埃博霉素不仅可以应用化学法合成，同时也可以通过生物合成。但化学合成埃博霉素步骤过长，杂质片段过多，产率较低，合成方法正在逐步完善。生物合成主要是通过粘细菌发酵来生产埃博霉素，生物发酵主要产生埃博霉素a和埃博霉素b，在相关人体细胞系中研究后发现，埃博霉素a抗癌效果弱于紫杉醇，而埃博霉素b抗癌效果强于紫杉醇，目前主要以埃博霉素b的效价来衡量产量。但目前埃博霉素在粘细菌中产量较少，美国BMS已能达到228mg/L的埃博霉素产量(a:b=l.6)，国内山东大学已经能达到最高180mg/L的埃博霉素产量(a:b=2)(李越中，胡玮，刘红.一株耐碱纤维堆囊菌及其在制备埃博霉素中的应用:CN101402929A[P]，2009-4-8)，埃博霉素的发酵提升仍有很大潜力。
[0004]自然界中产埃博霉素能力强，并且可以用于工业生产的理想菌种只有溶纤维素粘细菌。为了提高发酵产埃博霉素的产量，降低生产成本，提高生产质量，国内外对其进行了大量研究，例如:优良生产菌种的诱变筛选、原料成本的优化、生产工艺的改良等方面。由于埃博霉素在粘细菌中产量较少，所以目前研究热点则主要集中在埃博霉素生产菌种的诱变筛选上。本发明菌株采用的离子束诱变育种是一种交叉物理学和生物学的新型诱变方式，和经典诱变方法相比，在遗传稳定性，诱变频率性上有巨大优势。经过相关文献、专利的检索，国内外利用这一思路筛选埃博霉素高产菌的相关技术和方法尚无报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株埃博霉素高产菌及在发酵生产埃博霉素中的应用，诱变方法简单、高效、安全，得到的埃博霉素高产菌能大幅度提高发酵产生埃博霉素效价。
[0006]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一株埃博霉素高产菌株，分类命名为溶纤维素粘细菌iSporangium cellulosum)YU-970,已于2014年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M 2014144。
[0007]本发明所述的埃博霉素高产菌的筛选方法是:将从江苏高淳游子山国家公园腐败树枝周围的土壤中分离纯化出的溶纤维素粘细菌做出发菌种，经低能氮离子注入诱变后，通过初筛、摇瓶发酵复筛获取埃博霉素高产菌作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出埃博霉素产量高的作为目标菌株。
[0008]本发明菌株溶纤维素粘细菌YU-970的形态学及生理化学特征如下:
菌落颜色:淡黄色；
需氧方式:兼性厌氧；
菌落大小:3~8 μ m ；
适宜生长温度:3(T35°C ；
适宜生长ρΗ:6.0~7.0 ;
菌落形态:圆柱形；
革兰氏染色:阴性。
[0009]本发明所提供的埃博霉素高产菌诱变方法，具体步骤如下:
(a)、单细胞悬浮液制备:将出发菌株溶纤维素粘细菌YU-1制成细胞悬液，调整浓度为16/毫升。
[0010](b)、低能氮离子注入诱变:取0.1mL的步骤(a)中细胞悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在2(T30KeV注入剂量为140X 10131ns/cm3下，对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用ImL无菌水洗脱，涂布到M26培养基上，在30~35°C下倒置培养5~7d。
[0011](C)、诱变菌株的筛选:
初筛:将步骤(b)诱变得到的单菌落接种至斜面培养基上，培养温度为3(T35°C，培养时间为5~7d，再将斜面培养基上的单菌落转接与96孔板中，每个孔中加有250-300 μ L发酵培养基和沉降体积1%的XAD-16大孔吸附树脂，之后在3(T35°C，12(T200rpm摇床转速下培养5~7d，发酵结束后，烘箱烘干孔中培养基后加入200 μ L丙酮，浸泡树脂6h解析，并收集两次解析液，酶标仪测249nm下的吸收峰。取吸光度相对最高的20-40株为复筛的菌株。
[0012]复筛:将初筛筛选到的菌株经过斜面培养后接入种子培养基扩大培养后，用玻璃转子打碎后按5%~15% (v/v)的接种量接入发酵培养基，加入沉降体积5%的XAD-16大孔吸附树脂，在3(T35°C，16(T240rpm摇床转速下培养75~100h。发酵结束后，过滤掉滤液，取树脂放于烘箱内烘干，并加入5ml丙酮浸泡，浸泡过夜后，HPLC检测产量，筛选产量最高的5~10株突变菌株，重复步骤a~c，直至筛选出目标菌株
步骤(b)中低能氮离子注入，优选诱变能量为25KeV。
[0013]在上述筛选方法中:步骤(b)所采用的M26平板培养基包含如下质量百分数成分:氮源4%~6%，碳源5%~10%，无机盐0.039Π).1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C;其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0014] 步骤(C)所采用的斜面培养基包含如下质量分数成分:氮源4%飞％，碳源1%~3%，无机盐0.03%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C ;其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0015]步骤(c)所采用的种子液包含如下质量分数成分:氮源5%~8%，碳源59TlO%，无机盐0.03%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C ;其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为马铃薯淀粉，葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0016]步骤(c)所采用的发酵培养基包含如下质量分数成分:氮源59TlO%，碳源10%~20%，无机盐0.03%~0.1%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C;其中所述氮源为豆饼粉，玉米粉，或者酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为马铃薯淀粉，葡萄糖，或者蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0017]上述筛选出的埃博霉素高产菌在发酵生产埃博霉素中的应用。具体步骤如下:
(I)、平板培养:将埃博霉素高产菌接种到M26平板培养基，培养温度为3(T35°C，培养时间5~7d。
[0018](2)、斜面培养:将步骤(1)平板培养的埃博霉素高产菌接种到斜面培养基上，培养温度为30~35°C，培养时间为5~7d。
[0019](3)、种子培养:将步骤(2)斜面培养的埃博霉素高产菌接种到种子培养基中，培养温度为30~35°C，摇瓶装液量10%~30%，培养时间为25~30h。
[0020](4)、发酵培养:将步骤(3)中的种子培养液接种至发酵培养基，以59Tl5% (V/V)接种量接种于250mL发酵培养基中，培养温度为3(T35°C，培养时间为75~100h。
[0021]其中，所述平板培养基包含如下质量分数的组分:氮源4%飞％，碳源59TlO%，无机盐0.03%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C ;其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖，蔗糖、马铃薯淀粉中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0022]所述斜面培养基包含如下质量分数的组分:氮源4%飞％，碳源1%~3%，无机盐0.03%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C;其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0023]所述种子液培养基包含如下质量分数组分:氮源5%~8%，碳源59TlO%，无机盐0.03%~0.1%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C ;其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为马铃薯淀粉，葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0024]所述发酵培养基包含如下质量分数组分:氮源59TlO%，碳源5%~20%，无机盐
0.03%~0.1%，其余为水，pH调至6~7，培养温度为3(T35°C ;其中所述氮源为豆饼粉，玉米粉或者酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为马铃薯淀粉，葡萄糖或者蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
[0025]有益效果:
本发明采用低能氮离子注入诱变埃博霉素高产菌出发菌种，经过96孔板初筛，发酵复筛后挑选出诱变后的埃博霉素高产菌，可大幅度提高发酵产物中埃博霉素的产量，并且遗传稳定性好，连续传代5次后效价并无明显改变。在5L发酵罐中，发酵埃博霉素a的效价有出发菌的2.37mg/L提升到315.95mg/L,相比原始出发菌提高了 132倍，发酵埃博霉素b的效价有出发菌的1.02mg/L提升到290.37mg/L，相比原始出发菌提高了 283倍。本发明菌株完全符合工业化埃博霉素生产的技术指标，可用于工业化发酵生产，有重大的社会科研意义和经济价值。
【具体实施方式】
[0026]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0027]实施例1
本实施例说明将埃博霉素高产菌原始菌株进行低能氮离子注入诱变筛选的方法。
[0028]进行第一步低能氮离子注入诱变筛选的具体步骤如下:
(a)、单细胞悬浮液制备:取30°C恒温培养2d的溶纤维素粘细菌YU-1新鲜斜面加无菌水10ml，刮洗下粘孢子倾于带有一定玻璃珠的250ml三角瓶内震荡混匀20min (250rpm),打散粘孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整粘孢子浓度16个/毫升。
[0029](b)、低能氮离子注入诱变:取0.1ml步骤(a)中的粘孢子悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程装置。在25KeV，注入剂量为160X10131nS/Cm3下对其进行氮离子注入，靶室真空度为10_3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15S，靶室内放置不接受注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用Iml无菌水洗脱，涂布到M26平板上，在35°C下倒置培养2d。
[0030](C)、诱变菌株的筛选:取步骤(b)中的单菌落接种至斜面培养基上，培养温度为30°C，培养时间为6d，再将斜面培养基上的单菌落转接与96孔板中，每个孔中加有250 μ L发酵培养基和沉降体积1%的XAD-16大孔吸附树脂，之后30°C，180rpm摇床转速下培养6d，发酵结束后，烘箱烘干孔中培养基后加入200 μ L丙酮，浸泡树脂6h解析并收集两次解析液，酶标仪测249nm下的吸收峰。取吸光度相对最高的40株为摇瓶发酵的菌株。
[0031](d)、菌种扩大培养:将步骤(C)中筛选出的埃博霉素高产菌接种至种子培养基培养，培养温度为30°C，摇瓶装液量10%，培养时间25h。
[0032](e)、发酵复筛:将扩大培养后的菌种经磁力搅拌打散后，以10% (V/V)接种量接种于250mL发酵培养基中，转速为180rpm下发酵90h，发酵培养基中加入沉降体积为10%的XAD-16大孔吸附树脂，发酵结束后，过滤掉滤液，取树脂于38°C烘箱内烘干，并加入5ml丙酮浸泡每株突变菌株发酵的树脂，浸泡树脂6h解析并收集两次解析液，HPLC检测产量，并筛选产量最高的突变菌株。
[0033]其中步骤(b)中的M26培养基为:酵母膏5%，马铃薯5%，葡萄糖5%，硫酸镁0.01%,氯化钙0.01%,氯化铁0.01%,琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为32°C ；
所述斜面培养基包含如下质量分数的组分:新鲜酵母膏5%，葡萄糖5%，硫酸镁0.01%,氯化钙0.01%,氯化铁0.01%,琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为32°C ；
所述种子液培养基包含如下质量分数组分:酵母膏2%，马铃薯淀粉8%，大豆蛋白胨2%，葡萄糖5%，硫酸镁0.01%,氯化钙0.01%,氯化铁0.01%,其余为水，pH调至6.8，培养温度为32 0C ；
所述发酵培养基包含如下质量分数组分:玉米粉20mg/l，豆饼粉5%，马铃薯淀粉5%，葡萄糖5%，硫酸镁0.01%,氯化钙0.01%, EDTA-铁钠0.01%,其余为水，pH调至6.8，培养温度为 32。。；
发酵结束后检测各菌株埃博霉素产量如表一所示表一___
【权利要求】
1.一株埃博霉素高产菌株，分类命名为溶纤维素粘细菌celIulosum)YU-970,已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO:M 2014144。
2.权利要求1所述的埃博霉素高产菌株在发酵产埃博霉素中的应用。
3.权利要求2所述的埃博霉素高产菌株在发酵产埃博霉素中的应用，其特征在于包括如下步骤: 平板培养:将溶纤维素粘细菌YU-970接种至M26平板培养基上培养，培养温度为30~35°C，培养时间为5~7d ； 斜面培养:将步骤I)平板培养基培养的溶纤维素粘细菌YU-970接种至斜面培养基培养，培养温度为3(T35°C，培养时间为5~7d ； 种子培养:将步骤2)中斜面培养的溶纤维素粘细菌YU-970接种至种子培养基培养，培养温度为30~35°C，培养时间25~30h ； 发酵培养:将步骤3)中种子培养的溶纤维素粘细菌YU-970接种至发酵培养基培养，接种量5%~15% (V/V)，发酵温度30~35°C，发酵时间75~100h。
4.根据权利要求3所述的埃博霉素高产菌株在发酵产埃博霉素中的应用，其特征在于:所述步骤I)中M26平板培养基中包含如下质量百分数的组分:氮源4%飞％，碳源5%~?Ο%，无机盐0.03%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖，蔗糖、马铃薯淀粉中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
5.根据权利要求3所述的埃博霉素高产菌株在发酵产埃博霉素中的应用，其特征在于:所述步骤2)中的斜面培养基包含如下质量百分数的组分:氮源4%飞％，碳源1%~3%，无机盐0.03%~0.1%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
6.根据权利要求3所述的埃博霉素高产菌株在发酵产埃博霉素中的应用，其特征在于:所述步骤3)中的种子培养基包含如下质量百分数的组分:氮源5%~8%，碳源59TlO%，无机盐0.039Π).1%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为大豆蛋白胨，牛肉膏，酵母膏中的一种或几种混合物；碳源为马铃薯淀粉，葡萄糖，蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
7.根据权利要求3所述的埃博霉素高产菌株在发酵产埃博霉素中的应用，其特征在于:所述步骤4)中的发酵培养基中包含如下质量分数的组分:氮源59TlO%，碳源5%~20%，无机盐0.039Π).1%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为豆饼粉，玉米粉，或者酵母膏中的至少一种；碳源为马铃薯淀粉，葡萄糖，或者蔗糖中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐，钠盐，钙盐，或者镁盐中的一种或几种混合。
【文档编号】C12N1/20GK104046579SQ201410206348
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】虞龙, 李玉燕, 姚驰亚, 李市场, 楼干兵 申请人:虞龙