加入1.5%的琼脂，121巧显热灭 菌 30min。
[0048] 所述液体培养基的成分为；酪蛋白腺1%，酵母膏化5%，M巧〇4?7&0 4mM，MOPS lOmM;pH7.6。121°C湿热灭菌 30min。
[0049] (3)发酵培养方式；取步骤（2)制得的菌液3血分别接种至对液体培养基（OCM培 养基）中，于地7. 5, 32°C，210巧m的条件下发酵培养3天。
[0050]其中，
[0化1] 所述液体培养基的组分及含量为；酪蛋白腺lOg/L，MgS〇4? 7&0 1.Og化，3- (N-吗 琳基）丙横酸钢盐2. 07g/L，顺式-9-十八締酸甲醋5血化，苏氨酸化8g化，甲硫氨酸化5g/L，丙酸钟1.Og化，微量元素溶液1血化，大孔吸附树脂XAD-16 20血化；其中，所述微量元素 溶液配方是；MnCl2?地2〇lOOmg/L，C0CI220mg/L，CuS〇4lOmg/L，Na2Mo〇4? 2&0lOmg/L， ZnCl220mg/L，LiCl5mg/L，SnCl2? 2&0 5mg/L，H3BO3lOmg/L，邸r20mg/L，KI20mg/L。 [0化2] (4)埃博霉素的分离提取纯化；发酵4天后用80目筛网过滤收集检测量的树脂于 10ml离屯、管中，加入3ml甲醇过夜浸提。取1ml浸提液1200化pm,离屯、10分钟，过化22iim有机相滤器，HPLC检测。
[0化3] (5)色谱检测条件：
[0化4]色谱柱；Shim-packMRC-孤S, 4. 6mmX250mm
[OO5引流动相：甲醇-水（体积比55: 4巧
[0化6]流速；0. 7ml/min
[0057]紫外检测波长；249nm;进样量；10U L
[0化8] 化）根据吸收峰面积与埃博霉素浓度的关系曲线计算埃博霉素的产量，王组结果 取平均值并计算误差。
[0059] 经检测，埃博霉素的产生情况如表2所示：
[0060] 表2
[0061]
[0062] 实施例2:
[0063] (1)发酵菌株的选择；粘细菌菌株中的黄色粘球菌（Myxococcusxanthus)DZ菌 株。
[0064] 似菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，3CTC培养3天，再接种至 液体培养基，30°C，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0065] 其中，
[0066] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白腺1%，MgS〇4? 7&08mM，his?HC1(pH 7.6)1〇1111，邸2口〇4化肥〇4(地7.&11111，地7.6。固体培养基加入1.5%的琼脂，121巧显热灭 菌 30min。
[0067] 所述液体培养基的成分为；酪蛋白腺1%，酵母膏化5%，M巧〇4?7&0 4mM，MOPS 10mM;pH7.6。12rC湿热灭菌 30min。
[0068] (3)发酵培养方式；取步骤（2)制得的菌液3血分别接种至对液体培养基（OCM培 养基）中，于地7. 5, 30°C，200巧m的条件下发酵培养4天。
[0069]其中，
[0070] 液体培养基的组分及含量为：酪蛋白腺lOg/L，M巧〇4? 7&0 1.Og化，3-的-吗琳 基）丙横酸钢盐2. 07g/L，顺式-9-十八締酸甲醋10血化，苏氨酸化8g化，甲硫氨酸化8g/ L，丙酸钟2.Og化，微量元溶液1血化，大孔吸附树脂XAD-16 20血化；其中，所述微量元素溶 液配方是；MnCl2*4H2〇lOOmg化，C0CI220mg化，CuS〇4 10mg/L，Na2Mo〇4*2H2〇lOmg化，ZnCl2 20mg/L，LiCl5mg/L，SnCl2? 2&0 5mg化，H3BO3lOmg/L，邸r20mg/L，KI20mg/L。
[0071] (4)埃博霉素的分离提取纯化；发酵4天后用80目筛网过滤收集检测量的树脂于 10ml离屯、管中，加入3ml甲醇过夜浸提。取1ml浸提液1200化pm,离屯、10分钟，过化22iim 有机相滤器，HPLC检测。
[0072] (5)色谱检测条件：
[007引 色谱柱；Shim-packMRC-孤S，4. 6mmX250mm
[0074] 流动相：甲醇-水（体积比55: 4巧
[007引 流速；0. 7ml/min
[0076] 紫外检测波长；249nm;进样量；10iiL
[0077] 化）根据吸收峰面积与埃博霉素浓度的关系曲线计算埃博霉素的产量，王组结果 取平均值并计算误差。
[0078] 经检测，埃博霉素的产生情况如表3所示：
[0079] 表 3
[0080]
[0081] 实施例3;
[0082] (1)发酵菌株的选择；粘细菌菌株中的黄色粘球菌（Myxococcusxanthus)DZ菌 株。
[008引似菌株的活化：将上述菌株接种在固体平板培养基上，3CTC培养3天，再接种至 液体培养基，30°C，200rpm培养2天。然后，收集菌液备用。
[0084]其中，
[0085] 所述固体平板培养基的成分为：酪蛋白腺1%，M巧〇4?7电0 8mM，Tris? HC1 (地 7.6)1〇1111，邸2口〇4化肥〇4(地7.&11111，地7.6。固体培养基加入1.5%的琼脂，121巧显热灭 菌 30min。
[0086] 所述液体培养基的成分为；酪蛋白腺1%，酵母膏0. 5%，MgS〇4? 7电0 4mM，MOPS 10mM;pH7.6。12rC湿热灭菌 30min。
[0087] (3)发酵培养方式；取步骤（2)制得的菌液3mL分别接种至对液体培养基（OCM培 养基）中，于地7. 5, 28°C，190巧m的条件下发酵培养5天。
[0088]其中，
[0089] 液体培养基的组分及含量为：酪蛋白腺lOg/L，M巧〇4?7电0 1.Og化，3-的-吗琳 基）丙横酸钢盐2. 07g/L，顺式-9-十八締酸甲醋15血化，苏氨酸1.6g化，甲硫氨酸1. 2g/ L，丙酸钟3.Og化，微量元溶液1血化，大孔吸附树脂XAD-16 20血化；其中，所述微量元素溶 液配方是；MnCl2*4H2〇lOOmg化，C0CI220mg化，CuS〇410mg/L，Na2Mo〇4*2H2〇lOmg化，ZnCl2 20mg/L,LiCl5mg/L,SnCl] ? 2电0 5mg//L,H3BO3lOmg/L,邸r20mg/L,KI20mg/L。
[0090] (4)埃博霉素的分离提取纯化；发酵4天后用80目筛网过滤收集检测量的树脂于 10ml离屯、管中，加入3ml甲醇过夜浸提。取1ml浸提液1200化pm,离屯、10分钟，过化22iim 有机相滤器，HPLC检测。
[0091] (5)色谱检测条件：
[009引 色谱柱；Shim-packMRC-孤S，4. 6mmX250mm
[0093] 流动相：甲醇-水（体积比55:45)
[0094]流速；0. 7ml/min
[00巧]紫外检测波长；249nm;进样量；10iiL
[0096] 化）根据吸收峰面积与埃博霉素浓度的关系曲线计算埃博霉素的产量，王组结果 取平均值并计算误差。
[0097] 经检测，埃博霉素的产生情况如表4所示：
[009引 表4
[0099]
【主权项】
1. 一种用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基，其 特征在于：所述培养基组分及含量为：酪蛋白胨10g/L，MgSO 4 ? 7H20 1.0 g/L，3-(N-吗啉 基）丙磺酸钠盐2. 07g/L，顺式-9-十八烯酸甲酯5_15mL/L，苏氨酸0. 8-1. 6g/L，甲硫氨 酸0. 5-1. 2g/L，丙酸钾I. 0-3. Og/L，微量元素溶液lmL/L，大孔吸附树脂XAD-16 20mL/ L ;其中，所述微量元素溶液配方是：MnCl2 ? 4H20 100mg/L，CoCl220mg/L，CuS0410mg/L， Na2MoO 4 ? 2H20 lOmg/L, ZnCl220mg/L, LiCl 5mg/L, SnCl2 ? 2H20 5mg/L, H3B0310mg/L, KBr 20mg/L，KI 20mg/L。2. 如权利要求I所述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的 培养基，其特征在于：所述培养基中，顺式-9-十八烯酸甲酯的添加量为10mL/L。3. 如权利要求1所述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的 培养基，其特征在于：所述培养基中，苏氨酸的添加量为I. 2g/L。4. 如权利要求1所述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的 培养基，其特征在于：所述培养基中，甲硫氨酸的添加量为0. 8g/L。5. 如权利要求1所述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的 培养基，其特征在于：所述培养基中，丙酸钾的添加量化为2. 0g/L。6. 如权利要求1所述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素 的培养基，其特征在于：所述培养基组分及含量为：酪蛋白胨l〇g/L，MgSO4 ? 7H20I. 0g/L， 3- (N-吗啉基）丙磺酸钠盐2. 07g/L，顺式-9-十八烯酸甲酯10mL/L，苏氨酸I. 2g/L，甲硫 氨酸0. 8g/L，丙酸钾2. 0g/L，微量元素溶液lmL/L，大孔吸附树脂XAD-16 20mL/L。7. 如权利要求1或6所述用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃 博霉素的培养基，其特征在于：所述异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌是黄色粘球菌 (Myxococcus xanthus)DZ〇
【专利摘要】本发明公开了一种用于异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌发酵制备埃博霉素的培养基，该培养基组分及含量为：酪蛋白胨10g/L，MgSO4·7H2O？1.0g/L，3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐2.07g/L，顺式-9-十八烯酸甲酯5-15mL/L，苏氨酸0.8-1.6g/L，甲硫氨酸0.5-1.2g/L，丙酸钾1.0-3.0g/L，微量元素溶液1mL/L，大孔吸附树脂XAD-16？20mL/L。其显著的特点是添加了顺式-9-十八烯酸甲酯，L苏氨酸，甲硫氨酸和丙酸钾。实验证实，这种组成和优化显著提高了埃博霉素类化合物的发酵水平和效率，在利用异源表达埃博霉素基因的黄色粘球菌工业化发酵生产埃博霉素中具有良好应用前景。
【IPC分类】C12R1/01, C12P17/16
【公开号】CN105200090
【申请号】CN201510772281
【发明人】胡玮, 李越中, 郑连帅
【申请人】山东大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月12日