专利名称：手性单体扁桃酸的获得方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体的说，是关于手性单体扁桃酸的获得方法。
背景技术：
扁桃酸(Mandelic acid, ΜΑ)，又名苦杏仁酸、苯羟乙酸、α -羟基苯乙酸。在有机 合成和药物生产中有着广泛的用途，是尿路杀菌剂扁桃酸乌洛托品、末稍血管扩张剂环扁 桃酯、滴眼药羟苄唑及乌托品类解痉剂的重要中间体。扁桃酸为手性分子，有R-扁桃酸和 S-扁桃酸两种构型，其中结构式如下
权利要求
1.一种S-扁桃酸的制备方法，其特征在于，所述方法以苯丙酮酸为底物，使用对羟基 扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化获得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于体内或体外制备S-扁桃酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体内制备S-扁桃酸为向产生苯丙酮酸 的菌株或重组菌株内导入表达对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶的序列。
4.如权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于 Amycolatopsis orientalis 或 Streptomyces coelicolor。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株体 内具有L-苯丙氨酸代谢途径。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的L-苯丙氨酸代谢途径经过人工改造， 不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株 存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反应 途径。
8.如权利要求3或5所述的方法，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为大肠杆菌。
9.如权利要求8所述的方法，所述的大肠杆菌为tyrBaspC tyrA三突变体菌株或 tyrA, tyrB, aspC, trpE 四突变体菌株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的菌株中MoFfto,PheAfbr过表达。
11.如权利要求3-1任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株或重组菌株利用葡萄糖 发酵。
12.一种用于发酵生产S-扁桃酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株产生苯丙酮 酸，且所述重组菌株表达对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶。
13.如权利要求12所述的重组菌株，其特征在于，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于 Amycolatopsis orientalis 或 Streptomyces coelicolor。
14.如权利要求12所述的重组菌株，其特征在于，所述苯丙酮酸通过重组菌株人工改 造的L-苯丙氨酸途径代谢获得。
15.如权利要求14所述的重组菌株，其特征在于，所述人工改造的L-苯丙氨酸代谢途 径是指不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
16.如权利要求15所述的重组菌株，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影 响菌株存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸 的酶反应途径。
17.如权利要求12-16所述的重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为大肠杆菌重组 菌株。
18.如权利要求17所述的重组菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体菌株或tyrA，tyrB, aspC, trpE四突变体菌株。
19.如权利要求18所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株中MoFfto,PheAfto过表达。
20.一种R-扁桃酸的制备方法，其特征在于，所述方法以苯丙酮酸为底物，依次使用A)对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸生成S-扁桃酸；B)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮 酸；和OD-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法用于体内或体外制备R-扁桃酸。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述体内制备R-扁桃酸为向产生苯丙酮 酸的菌株或重组菌株内导入表达A)对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶；B)对羟基扁桃 酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶；和C) D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶的序 列。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸合成酶来源于 Amycolatopsis orientalis 或 Streptomyces coelicolor。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于 Streptomyces coelicolor 禾口 Amycolatopsis orientalis。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于Iihodotorula graminis0
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株 体内具有L-苯丙氨酸代谢途径。
27.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，所述的L-苯丙氨酸代谢途径经过人工改 造，不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影响菌 株存活的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的反 应途径。
29.如权利要求22或沈所述的方法，所述的产生苯丙酮酸的菌株或重组菌株为大肠杆 菌。
30.如权利要求四所述的方法，所述的大肠杆菌为tyrBaspC tyrA三突变体菌株或 tyrA, tyrB, aspC, trpE 四突变体菌株。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述的菌株中MoFfto,PheAfbr过表达。
32.如权利要求22、26、四、30、31任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株或重组菌 株利用葡萄糖发酵。
33.一种用于发酵生产R-扁桃酸的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株产生苯丙酮 酸，且所述重组菌株表达A)催化苯丙酮酸转变为S-扁桃酸的酶；B)催化扁桃酸转变为苯乙酮酸的酶；和C)催化苯乙酮酸转变为R-扁桃酸的酶。
34.如权利要33所述的重组菌株，其特征在于，所述苯丙酮酸通过重组菌株人工改造 的L-苯丙氨酸途径代谢获得。
35.如权利要求34所述的重组菌株，其特征在于，所述人工改造的L-苯丙氨酸代谢途 径是指不利于苯丙酮酸积累且不影响菌株存活的代谢支路被部分或全部切断。
36.如权利要求35所述的重组菌株，其特征在于，所述的不利于苯丙酮酸积累且不影 响菌株存活的的代谢支路包括L-色氨酸途径、L-酪氨酸途径和/或苯丙酮酸到L-苯丙氨酸的酶反应途径。
37.如权利要求33-36任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株为大肠杆菌重组菌株。
38.如权利要求37所述的重组菌株，其特征在于，所述的大肠杆菌重组菌株为tyrB aspC tyrA三突变体菌株或tyrA，tyrB, aspC, trpE四突变体菌株。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述的菌株中MoFfto,PheAfbr过表达。
40.一种将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸的方法，其特征在于，所述方法向S-扁桃酸中依 次加入A)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮 酸；和B)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于 Streptomyces coelicolor 禾口 Amycolatopsis Orientalis0
42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于Iihodotorula graminis0
43.一种手性拆分对映消旋体扁桃酸的方法，其特征在于，向对映消旋体扁桃酸中依次 加入A)对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶催化S-扁桃酸生成苯乙酮 酸；和B)D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化苯乙酮酸生成R-扁桃酸。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述对羟基扁桃酸氧化酶来源于 Streptomyces coelicolor 禾口 Amycolatopsis Orientalis0
45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述D-扁桃酸脱氢酶来源于 Rhodotorula graminis。
全文摘要
本发明提供了制备S-扁桃酸或R-扁桃酸的方法以及将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸的方法。本发明提供的方法，使用对羟基扁桃酸合成酶或扁桃酸合成酶催化苯丙酮酸获得S-扁桃酸，使用对羟基扁桃酸氧化酶或扁桃酸氧化酶或扁桃酸脱氢酶和D-扁桃酸脱氢酶或D-扁桃酸还原酶催化S-扁桃酸获得R-扁桃酸。本发明提供的方法可用于体外制备单一构型的S-扁桃酸或R-扁桃酸，同时将这些酶组合过表达可以发酵葡萄糖获得S-扁桃酸或R-扁桃酸，还可以用于手性拆分混旋扁桃酸生成R-扁桃酸或将S-扁桃酸转化为R-扁桃酸。用于发酵培养合成S-扁桃酸或R-扁桃酸时，可实现方法的可持续性并能降低成本，并且方法温和，对环境和人友好。
文档编号C12R1/19GK102086462SQ20101057088
公开日2011年6月8日 申请日期2010年12月2日 优先权日2009年12月2日
发明者姜卫红, 孙周通, 杨晟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院