专利名称：一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于酶工程技术领域，涉及一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其发酵生产 α-葡萄糖苷酶的方法。
背景技术：
α -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 20)，又名α -D-葡萄糖苷水解酶，可以催化水解低聚 糖类生成葡萄糖。α-葡萄糖苷酶在自然界中广泛分布，种类繁多，性质各异。来源于曲霉、 酿酒酵母、芽孢杆菌的α-葡萄糖苷酶不仅能够水解糖苷，还可以通过转苷反应合成某些 低聚糖。其中，黑曲霉(A niger) α _葡萄糖苷酶由于其优良的转苷能力，在工业上具有 巨大的应用前景。A. niger α -葡萄糖苷酶能够切割开麦芽糖的α-1，4糖苷键，并将游离出来的 葡萄糖残基以α-1，6形式转移到其他糖底物上，形成低聚异麦芽糖(IMOs)。IMOs能够促 进人体内有益细菌的生长繁殖，具有防龋齿、降低胆固醇、改善肠道功能、增强肌体免疫力 等功能，在食品和医药行业应用广泛。作为制备IMOs的关键用酶，A niger α -葡萄糖苷酶受到国内外研究人员的广 泛关注。我国对此酶的研究主要集中在天然α-葡萄糖苷酶酶学性质及产酶菌株的筛选培 养方面。然而，由于天然A niger α _葡萄糖苷酶表达量低，依靠单纯的筛菌和发酵条件 优化较难实现产酶量的较大突破，而传统的诱变育种存在着一定的随机性，且开发周期长， 表达量在短时间内较难快速提高。目前，α-葡萄糖苷酶在我国尚未实现自主生产，完全依 赖进口，且价格昂贵(约30万元/吨)，导致IMOs的生产成本居高不下。为了克服野生A菌株α-葡萄糖苷酶产量低，运用基因工程的方法实现 α-葡萄糖苷酶的高效表达已成为当今研究的热点。Nakamura等(Nakamura A, Nishimura I, Yokoyama A, et al. Cloning and sequencing of an alpha—glucosidase gene from Aspergillus niger and its expression in A. nidulans. J. Biotechnol. , 1997, 53: 75-84)议Asperigilius Waas为宿主构建了基因工程菌，最高比酶活为0. 04 U/ mg0 Lee 等(Lee D G, Nishimura-Masuda I, Nakamura A, et al. Overproduction of aphla-glucosidase in Aspergillus niger transformed with the cloned gene aglA. J. Gen. App 1. Microbiol. , 1998，44: 177-181)通过基因重组的方法在 A /？细,染色 体上引入多拷贝的α-葡萄糖苷酶基因提高α-葡萄糖苷酶产量，通过筛选纯合子得到高 产量的重组菌，最高比酶活达到0. 24 U/mg。Ogawa等(Ogawa M, Nishio T, Minoura K, et al. Recombinant alpha-glucosidase from Aspergillus niger. Overexpression by Emericella nidulans, purification and Characterizatioa J. Appl. Glycosci., 2006，53: 以Eniericell nidulans为宿生轰达A. 巩ir来源的α -葡萄糖苷酶基 因，最高比酶活为0.96 U/mg，酶活为0.65 U/mL。于岚等(于岚，张云开，苏艳等.黑曲 霉？ -葡萄糖苷酶cDNA的克隆及表达.生物技术，2006，16(2): 5_8)通过RT-PCR方法 扩增得到A niger α -葡萄糖苷酶cDNA，构建重组质粒在大肠杆菌中表达，然而所表达的重组蛋白是胞内酶，分离纯化的成本相对较高；同时酶活偏低。本实验室前期工作中，童星 等(童星，唐秋嵩，吴玉飞等.黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的 表达.微生物学报，2009，49(2): 262-268)通过overlap PCR获得A niger α -葡萄糖 苷酶cDNA，在A pastor is KM71中表达，然而生化活性较低。陈董力等(Dongli Chen, Xing Tong, Shangwei Chen, Sheng Chen, Dan ffu, Shuguang Fang, Jing Wu and Jian Chen. Heterologous expression and biochemical characterization of α -glucosidase from Aspergillus niger by Pichia pastroris, J. Agric. Food Chem. , 2010, 58, 4819-4824)通过 RT-PCR 获得 A niger α -葡萄糖苷酶 CDNA，在 A oris KM71 中表 达，终酶活达到2. 07 U/mL。虽然本实验室前期开发的工程菌在产量上已经一定的进步，但是α -葡萄糖苷酶 产量依然偏低。在前期研究的基础上，本实验室成功构建重组菌株A pastoris GS115/ mC^-aglu,实现了 α -葡萄糖苷酶的高效胞外表达。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌，该菌种可以 高效分泌表达重组α-葡萄糖苷酶，解决了现有菌株分泌α-葡萄糖苷酶活性不高的问题。所述α -葡萄糖苷酶基因工程菌是将来源于黑曲霉J5T^rgiBM niger α -葡萄 糖苷酶基因导入毕赤酵母/iZcAa pastoris GS115获得的重组菌。其中，黑曲霉Asper识7ΛΛ5 niger来源于黑曲霉No. CICIM F0620，其核苷酸序列 与GeneBank登陆号4991096的黑曲霉α -葡萄糖苷酶基因相同。本发明还要解决的技术问题是提供一种采用所述重组菌生产α “葡萄糖苷酶的 方法。为解决上述问题，所述重组菌发酵方法如下
(1)菌株α-葡萄糖苷酶基因工程菌A pastorisQSllh/ pPIC9K-a^7w ；
(2)种子培养阶段从甘油管中吸取200PL菌液接种于种子培养基中，使用回转恒 温调速摇床进行培养，控制转速200 rpm,培养温度30° C，培养20 h左右；
(3)发酵培养将种子培养液按10%的接种量接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速 使溶氧维持20 30%，控制温度为28.5 ° C，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0，培养 18 20小时；
(4)甘油补料发酵培养进行到If20小时后，溶氧开始反弹，通过补加甘油补料培养 基，使OD600达到100 ；
(5)甲醇诱导发酵培养24-26小时后，通过补加甲醇诱导培养基，诱导重组α-葡萄 糖苷酶表达，发酵液剩余甲醇浓度控制在0. 2^0. 4% (ν/ν)。所述种子培养基的组成为酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10 g/L，生物素 4X IO"4 g/L，磷酸钾缓冲液 0. lmol/L (pH6. 0)。所述发酵培养基的组成为=CaSO40. 93 g/L, K2SO4 18. 2 g/L，MgSO4 ·7Η20 14.9 g/ L, KOH 4. 13 g/L，甘油 30. 0 g/L，85% 磷酸 26. 7 mL/L, PTM1 4. 35 mL/L。PTM1 溶液的组成为=CuSO4 · 5H20 6 g/L, KI 0. 08 g/L, MnSO4 · H2O 3 g/L, Na2MoO3 · 2H20 0. 2 g/L, H3BO3 0. 02 g/L, CoCl2 0. 5 g/L, ZnCl2 20 g/L, FeSO4 · 7H20 65 g/L,生物素 0. 2 g/L，H2SO4 5. 0 mL/L。所述甘油补料培养基500 g/L甘油，5 mL/L PTM10所述甲醇诱导培养基100%甲醇，12 mL/L PTM10本发明的有益效果
(1)本发明成功构建了一种高效分泌表达重组α-葡萄糖苷酶的基因工程菌A pas tor is GS115/pPIC9K_a^A/，首次实现了利用 A pas tor is GSl 15 表达免 fliger 来源的
α-葡萄糖苷酶；
(2)本发明解决了现有发酵工艺中α-葡萄糖苷酶活性不高的问题；
(3)本发明采用价格低廉的无机盐和甘油等原料进行生产，适于大规模生产。
具体实施例方式实施例1 基因工程菌 A pasiorisGSllS/pPICgK-a^·/"的构建
(1) A. niger总RNA的提取收集A niger菌丝体离心，用0. 1%的DEPC处理过的缓冲 液冲洗数次，将菌丝体放入液氮中速冻，在研钵中快速研磨。取研磨好的样品100 mg放入 1.5 mL EP管中，加入1 mL TRI REAGENT (Sigma T9424)，用移液枪反复吹吸以裂解细胞； 12，OOOXf 4° C离心10 min0将上清液转移到一个干净的离心管，将样品在室温下放置 5 min。加入0.2 mL氯仿，剧烈摇晃15 s，在室温下放置10 min，4° C离心12，000 Xg，15 min。取上层无色水相置于一干净的离心管，加入500 μ L异丙醇，混勻，在室温下放置10 min。4° C，12，000Xg 离心 10 min，弃上清。加入 1 mL 75% 乙醇，漩涡混勻，12，OOOXg， 4° C离心5 min。弃上清，让RNA自然干燥10 min。加40 μ L DEPC水溶解沉淀，得A fliger 总RNA样品。(2)引物设计根据NCBI数据库中ACBS 513. 88的α -葡萄糖苷 酶序列(登录号4991096)，采用Primer Premier软件方法设计引物如下所示OVoi I酶切位点由下划线标出)
上引物5，-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3‘ 下引物5’ - AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3， (3) cDNA第一链的合成 ①在一 PCR管中添加下列物质
权利要求
一种α 葡萄糖苷酶基因工程菌，是将黑曲霉 α 葡萄糖苷酶基因导入毕赤酵母GS115获得的重组菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因来源于 黑曲霉No. CICIM F0620，其核苷酸序列与GeneBank登陆号4991096的黑曲霉α -葡萄糖 苷酶基因相同。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，表达载体采用PPIC9K。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其构建方法为1)提取黑曲霉总RNA;2)设计引物，通过RT-PCR，获得PCR产物；3)将PCR产物克隆到质粒pPIC9K，构建表达载体pPIC9K-a^A/；4)将pPIC9K-a^A/线性化后，电击转化毕赤酵母GS115宿主菌得到重组菌株毕赤酵母 GS115/pPIC9K-a^7w0
5.一种应用权利要求1所述基因工程菌生产α-葡萄糖苷酶的方法，包括如下步骤 (1)种子培养种子培养阶段从甘油管中吸取200 μ L菌液接种于种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养，控制转速200 rpm，培养温度30° C，培养20 h左右；(2)发酵培养将种子培养液按10%的接种量接入发酵培养基中，通过控制搅拌转速 使溶氧维持20 30%，控制温度为28.5° C，流加质量浓度为25%的氨水控制pH 5.0，培养 18 20小时；(3)甘油补料通过补加甘油补料培养基，使OD6tltl达到100，停止流加甘油；(4)甲醇诱导待溶氧反弹后，维持基质缺乏状态广2h，添加甲醇诱导培养基，使甲醇 终浓度为0. 5%，待溶氧下降后，开始流加甲醇诱导培养基，诱导重组α -葡萄糖苷酶表达， 发酵液剩余甲醇浓度控制在0. 2^0. 4%。
6.根据权利要求5所述的方法，所述种子培养基的组成为酵母膏10g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10 g/L，生物素4X10-4 g/L，磷酸钾缓冲液0. lmol/L。
7.根据权利要求5所述的方法，所述发酵培养基为=CaSO40.93 g/L, K2SO4 18.2 g/L, MgSO4 · 7H20 14. 9 g/L, KOH 4. 13 g/L，甘油 30. 0 g/L，85% 磷酸 26. 7 mL/L, PTM1 4. 35 mL/ L0
8.根据权利要求7所述的方法，PTM1溶液的组成为=CuSO4·5Η20 6 g/L, KI 0. 08 g/L, MnSO4 · H2O 3 g/L, Na2MoO3 · 2H20 0. 2 g/L, H3BO3 0. 02 g/L, CoCl2 0. 5 g/L, ZnCl2 20 g/L, FeSO4 · 7H20 65 g/L,生物素 0. 2 g/L, H2SO4 5. 0 mL/L。
9.根据权利要求5所述的方法，诱导初始阶段0D_为100。
10.根据权利要求5所述的方法，诱导初始阶段的甲醇添加浓度为0.5%。
全文摘要
本发明公开了一种α-葡萄糖苷酶基因工程菌及其应用，属于酶工程技术领域。该基因工程菌是携带一种重组质粒的毕赤酵母PichapastorisGS115，重组质粒为含有黑曲霉Aspergillusnigerα-葡萄糖苷酶cDNA的质粒pPIC9K-aglu，利用P.pastorisGS115表达A.niger来源的α-葡萄糖苷酶。用所构建的重组P.pastorisGS115/pPIC9K-aglu作为生产菌种，溶氧反馈调控补料流加策略高密度培养P.pastoris生产重组α-葡萄糖苷酶，通过在发酵18~20h后连续补加甘油实现P.pastoris的高密度培养，发酵24~26h后连续补加甲醇控制一定残余甲醇浓度，发酵培养120h后，重组α-葡萄糖苷酶的酶活达到3.5U/mL以上。本发明采用价格低廉的无机盐和甘油为原料进行生产，发酵工艺简单易行，适于大规模生产。
文档编号C12N15/81GK101974441SQ20101057085
公开日2011年2月16日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者吴丹, 吴敬, 陈坚, 陈晟, 陈董力 申请人:江南大学