一种β-葡萄糖苷酶基因的重组表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和发酵领域。具体而言，本发明涉及一种采用基因工程方法 重组表达里氏木霉目-葡萄糖巧酶基因的方法、用于该方法中的菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素是植物细胞壁的主要成份，是地球上最大量的可再生碳源物质。利用纤维 素进行生物转化生产燃料己醇等化学品，对于解决人类面临的能源危机、粮食短缺、环境污 染等问题具有极其重要的现实意义。
[0003] 降解纤维素的纤维素酶是一个多酶复合体系，包含内切葡聚糖酶、外切纤维二糖 水解酶和目-葡萄糖巧酶。送H种酶协同作用将纤维素降解成葡萄糖。其中目-葡萄糖巧 酶巧C3.2. 1.21)，其英文名为目-glucosidase (缩写BGL)，在纤维素酶水解纤维素的过程 中可W水解纤维二糖从而释放出葡萄糖，成为纤维素彻底水解的关键步骤。
[0004] 在纤维素水解过程中主要存在W下几方面问题：首先，目-葡萄糖巧酶活性受水 解产物葡萄糖的抑制，而纤维二糖又是纤维素酶系中其它酶的抑制剂，从而使整个纤维素 的水解过程受到抑制；其次，在产纤维素酶的菌株中，目-葡萄糖巧酶含量都很低（除黑曲 霉外），如里氏木霉分泌的纤维素酶中目-葡萄糖巧酶含量还不到1%，远达不到实际应用 的水平；再次，在反应过程中，由于热抑制作用，大量的目-葡萄糖巧酶活性消失。因此， 目-葡萄糖巧酶的活力一般比内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶低一个数量级W上，成为纤维 素降解的限速酶（王振宇等，高温厌氧菌产纤维素内切酶和目-葡萄糖巧酶的活性，大连轻 工业学院学报，2005, 24 (2)，110~114)。
[0005] 目前应用最广泛的纤维素酶生产菌株大多是里氏木霉（Trichoderma reesei) 的优良突变株，它能分泌产生内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和目-葡萄糖巧酶，包含了 完整的纤维素水解酶系（Penttila ME 等，Expression of two Trichoderma reesei Elndoglucanase in 1:he Yeast Saccharomyces cereviae (两种里氏木霉内切葡聚糖酶在酿 酒酵母中的表达），化ast. Vol. 3,1987 (3) ; 175 - 185)。
[0006] 由于天然里氏木霉菌株中的目-葡萄糖巧酶产量低，造成了纤维素的水解过程受 限。因此，提高纤维素酶系中目-葡萄糖巧酶的活力，是提高纤维素酶水解得率和葡萄糖产 量的关键措施之一。
[0007] 有研究者使里氏木霉目-葡萄糖巧酶基因在毕赤酵母中重组表达，其酶活力随诱 导时间的增加而提高，但其发酵周期达8天W上（"里氏木霉目-葡萄糖巧酶基因BGLl的 重组载体、重组菌及在重组菌中的表达"，授权公告号CN102220369B)。也有研究者通过融 合表达的方式在里氏木霉中过量表达目-葡萄糖巧酶，可得到酶活力几倍于原始菌株的产 量，但其发酵周期长达6天W上（"提高具有生物学活性之多肤的分泌的方法"，授权公告号 CN 101516906B)。现有技术中的送些方法普遍存在发酵周期过长的不足。
[0008] 因此，本领域迫切需要开发出一种能在提高酶活力的同时缩短发酵周期的纤维素 降解微生物（例如基因工程化的里氏木霉），W大大降低生产成本，提高纤维素酶的竞争 力。
【发明内容】
[0009] 本发明的方法能在提高目-葡萄糖巧酶产量的同时提前产酶周期，克服现有技术 里氏木霉中目-葡萄糖巧酶发酵周期长，产酶量低等不足，对提高纤维素的降解效率、高效 的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。
[0010] 在本发明的第一方面中，提供了一种融合蛋白或其编码序列，所述融合蛋白包 含：
[0011] (a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段；
[0012] 化）目-葡萄糖巧酶或其活性片段；和
[001引 （C)任选位于（a)和化）之间的连接序列，例如由SEQ ID N0:4所示序列编码。
[0014] 在本发明的第二方面中，提供了一种重组表达载体，其包含：
[0015] (a)天冬氨酸蛋白酶或其活性片段的编码序列；
[0016] 化）目-葡萄糖巧酶或其活性片段的编码序列；和
[0017] (C)任选位于（a)和化）之间的连接序列的编码序列（例如SEQ ID NO:4所示的 序列）。
[0018] 在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体还包含选自下组的一种或多种元 件：
[0019] (i)启动子，如里氏木霉纤维二糖水解酶I (CbhI)启动子（例如沈Q ID NO: 1所示 序列的启动子）、里氏木霉纤维二糖水解酶II (CbhII)、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉 内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡 聚糖酶V、里氏木霉目-木聚糖酶里氏木霉目-葡糖巧酶启动子、米曲霉TATA淀粉酶启动 子、米曲霉碱性蛋白酶启动子、米曲霉丙糖磯酸异构酶、黑曲霉中性a-淀粉酶启动子、黑 曲霉糖化酶启动子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶启动子；在酵母中，有用的启动子包括：酿 酒酵母帰醇化酶启动子巧N0-1)，酿酒酵母半乳糖激酶启动子、酿酒酵母醇脱氨酶启动子/ 甘油醒-3-磯酸脱氨酶启动子、酿酒酵母3-磯酸甘油酸激酶启动子；
[0020] (ii)信号肤编码序列，如里氏木霉纤维二糖水解酶I (CbhI)信号肤（例如SEQ ID N0:2所示序列的编码序列）、米曲霉淀粉酶信号肤，黑曲霉糖化酶信号肤，米赫根毛霉天冬 氨酸蛋白酶信号肤的编码序列；
[0021] (iii)前导序列编码序列；
[002引 （iv)终止子，如里氏木霉纤维二糖水解酶I仰111)终止子（例如SEQ ID N0:6所 示序列的终止子）、米曲霉淀粉酶终止子、黑曲霉糖化酶终止子、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合 酶终止子；
[0023] (V)标记基因，如乳清酸核巧-5-磯酸脱駿酶（pyrG)、潮霉素磯酸转移酶基 因化地），构巢曲霉己醜胺酶基因（amdS)、鸟氨酸氨甲醜基转移酶（ar浊）、硝酸还原酶 (niaD)、邻氨基苯甲酸和酶（付pC);
[0024] (Vi)聚腺巧酸化序列，例如其获自选自下组的酶的基因的聚腺巧酸化序列；米曲 霉TAKA淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉a -葡糖巧酶；W 及CCAAT增强子结合蛋白（C/EB巧类似因子，GATA转录因子等；（VU)转录激活因子。
[00巧]在本发明的一些实施方式中，所述重组表达载体的基本骨架来自；pCAmbial300 质粒、pCAmbia2300质粒、pCAmbial301质粒或地IN19质粒；优选地，所述重组表达载体是 PAZ193。
[0026] 在本发明的一些实施方式中，上述方面中的所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段 编码序列选自：源自纤维素降解细菌的天冬氨酸蛋白酶或其它活性片段的编码序列，例如 源自木霉（如哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、里氏木霉（Trichoderma reesei))、 青霉、曲霉、毛霉、葡萄抱霉度otrytis)、纤维单胞菌属（Cellulomonas)、纤维弧菌属 (Cellvibrio)、瞻胞菌属（切tophaga)、产玻巧酸拟杆菌度acteroides succinogenes)、牛 黄瘤胃球菌（Ruminococcus f lave化ciens)、白色瘤胃球菌巧.a化US)、溶纤维了酸弧菌 度Utyrivibrio fibrisolvens);优选所述天冬氨酸蛋白酶或其活性片段包含SEQ ID N0:3 或7所示的序列或其同源序列编码的氨基酸序列或所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加 至少一个氨基酸后得到的序列，优选经过保守性取代至少一个氨基酸后得到的序列。
[0027] 在本发明的一些实施方式中，上述方面中的所述目-葡萄糖巧酶或其活性片段 的编码序列选自：源自纤维素降解细菌的目-葡萄糖巧酶或其活性片段的编码序列，例如 源自木霉（如哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、里氏木霉（Trichoderma reesei))、 青霉、曲霉（如黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、毛霉、 葡萄抱霉度Ot巧tis)、纤维单胞菌属（Cellulomonas)、纤维弧菌属（Cellvibrio)、瞻 胞菌属（切tophaga)、产玻巧酸拟杆菌度acteroides succinogenes)、牛黄瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌巧.a化US)、溶纤维了酸弧菌度Utyrivibrio 円brisolvens);优选所述目-葡萄糖巧酶或其活性片段包含SEQ ID NO:5所示的序列编码 的氨基酸序列或所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，优 选经过保守性取代至少一个氨基酸后得到的序列，优选的所述目-葡萄糖巧酶或其活性片 段的编码序列是Bgll基因，更优选所述基因是里氏木霉目-葡萄糖巧酶Bgll基因，例如具 有SEQ ID NO:5所示的序列。
[0028] 在本发明的第H方面中，提供了一种重组宿主细胞，其包含本发明所述的编码 序列或本发明所述的重组表达载体，优选所述宿主细胞是大肠杆菌、酵母菌（如酿酒酵 母、毕赤酵母）、农杆菌（如根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)。
[0029] 在本发明的第四方面中，提供了一种重组纤维素降解菌，其特征在于，所述重组纤 维素降解菌用本发明所述的重组表达载体或用本发明所述的重组宿主细胞转化从而重组 表达天冬氨酸蛋白酶或其活性片段和目-葡萄糖巧酶或其活性片段的编码序列，优选所述 纤维素降解菌源自木霉（如哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、里氏木霉（Trichoderma reesei))、曲霉（如黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus Oiyzae))、青霉， 更优选所述纤维素降解菌源自AT(X56765的里氏木霉或为ATCC56765的里氏木霉。
[0030] 在本发明的一些实施方式中，所述重组纤维素降解菌的目-葡萄糖巧酶活性是未 经过基因工程化操作的纤维素降解菌的2~20倍，优选3~10倍；和/或，所述重组纤维 素降解菌的纤维素降解发酵周期较未经过基因工程化操作的纤维素降解菌的发酵周期缩 短，优选仅为1~3天。
[0031] 在本发明的第五方面中，提供了 一种制备本发明所述重组纤维素降解菌的方法， 所述方法包括步骤：
[0032] (i)提供本发明所述的重组表达载体或重组宿主细胞；
[0033] (ii)在适合转化的条件下，用所述的重组表达载体或重组宿主细胞转化纤维素降 解菌，W获得本发明所述重组纤维素降解菌。
[0034] 在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括（iii)筛选、分离、收集、培养、扩增 和/或使用被转化的纤维素降解菌。
[0035] 在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括针对所述重组表达载体中的标记基 因对重组宿主细胞和/或重组纤维素降解菌进行筛选。
[0036] 在本发明的一些实施方式中，所述步骤（ii)中的转化通过选自下组的方法进行： 农杆菌介导转化法（例如利用根癌农杆菌和发根农杆菌）、基因枪介导转化法、电致孔转化 法、超声波辅助转化法、原位转化法、核显微注射法。
[0037] 在本发明的一些实施方式中，所述重组纤维素降解菌经分离、收集、培养和/或扩 增后用于纤维素降解、或不