乙型脑炎减毒活疫苗株sa14-14-2在人二倍体细胞2bs上的适应株及其疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒疫苗领域，特别是W生物学技术选育高度减毒而且免疫原性良好 的乙型脑炎活疫苗株。将乙型脑炎减毒活疫苗株SA14-14-2通过单层、混悬的方式接种2BS 细胞，传代适应后蚀斑法测定病毒滴度，确定病毒最佳收获时间和接种量。选取病毒滴度较 高的=代建立原始毒种、主代毒种和工作毒种库，对毒种库病毒按照《中国药典》=部中进 行无菌检查、支原体检查、免疫原性检查，小鼠脑内致病力试验，皮下感染入脑试验、乳鼠传 代返祖试验、免疫保护性试验等项目的全面检定。另外还对其进行全基因序列测定并与已 上市的原代地鼠肾细胞(PHK)传代的疫苗株SA14-14-2疫苗株的序列进行比对。
【背景技术】
[0002] 流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,乙脑）是亚洲最常见的一种病毒性脑 炎，是一种经蚊虫传播的人兽共患病。乙脑病毒属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA有包 膜病毒，全长11化左右。乙脑病毒有5个基因型，目前我国的乙脑流行病毒为基因虹型和基 因 I型。据估计，乙脑病毒每年至少造成50,000例临床病例，其中多数为10岁W下儿童，导致 约10,000人死亡，另有约15,000例病例留有长期的神经-精神性后遗症。乙脑几乎在所有的 亚洲国家都有发生，无论其位于溫带、亚热带或热带。近几十年来，乙脑在一些W前无地方 性流行的地区出现了爆发。全球有近30亿人口生活在乙脑流行区，运些流行区每年新生儿 约7千万。乙脑病毒感染通过蚊子传播，而蚊子从有病毒血症的动物、人获得感染。目前还没 有针对乙脑的特异性抗病毒治疗方法，疫苗接种仍是唯一最重要的控制措施。
[0003] 目前，大规模使用的乙脑疫苗有S种：（1)化kayama株或北京株纯化鼠脑灭活疫 苗，主要日本等几个亚洲国家生产；（2)Vero细胞培养的北京P3株乙脑灭活疫苗；（3)原代地 鼠肾细胞培养的SA14-14-2株减毒活疫苗。纯化鼠脑乙脑疫苗的缺点有:诱导保护性免疫力 的持续时间过短，需多剂次接种;对多数国家来说，每剂疫苗的价格相对较高。细胞培养的 疫苗上世纪90年代前曾经在中国生产并广泛使用。1989年，SA14-14-2株减毒活疫苗上市 后，因其安全、有效、免疫接种次数少、保护时间长的优点，在国内大面积接种，市场占有率 已达到90% W上，并出口韩国、印度、泰国、尼泊尔等十多个国家。
[0004] 人二倍体细胞是指正常人体组织在体外培养的细胞，其来源于正常人胚胎，在传 代过程中保持二倍体核型，无外源因子污染，无致瘤性，没有传代细胞和原代动物细胞的缺 点，在培养病毒和制备病毒类疫苗方面价值很大，是WHO倡导用于人用疫苗生产的理想细 胞。60年代初人二倍体细胞问世，70年代用于多种疫苗生产。近来年成为甲肝疫苗、水痘疫 苗、风疹减毒活疫苗、脊髓灰质炎疫苗、成纤维细胞干扰素等产品的生产用细胞。WHO认为疫 苗的生产应首先考虑采用人源性二倍体细胞，因其与其他动物传代细胞相比，在理论上不 存在致肿瘤的危险性，其生产疫苗的安全性及有效性远优于其他细胞基质制备的疫苗。
[0005] 乙型脑炎减毒活疫苗是我国自主知识产权疫苗，自1989年经卫生部批准生产上市 W来，迄今为止已经使用超过6亿剂次，显著降低了流行区乙脑的发病率和病死率，为儿童 的健康提供了有效的免疫保护作用。2013年10月9日，乙型脑炎减毒活疫苗通过世界卫生组 织疫苗预认证，成为中国通过世界卫生组织预认证的首个疫苗产品。但是，Vero细胞和原代 地鼠肾细胞都是动物源性细胞，Vero细胞的优点在于其质量和外源因子可W高度控制，繁 殖速度快，持续时间长，易于标化，但疫苗中残余的Vero细胞DNA对接种者潜在的致癌性风 险，因此在疫苗制备过程中必须严格控制残余含量。而原代地鼠肾细胞来源于地鼠，地鼠种 群不仅难于控制，对生产工艺要求比较高，而且容易受到细菌、病毒、寄生虫等外源物质污 染，目前中国成都生物制品研究所有限公司生产的乙型脑炎减毒活疫苗采用SPF地鼠肾细 胞作为疫苗生产细胞基质，能较好解决上述人们担屯、的外源因子污染的问题，但是增加了 疫苗成本。因此，现在许多疫苗企业也在积极应用人二倍体细胞研究开发人用疫苗。本申请 拟采用人二倍体细胞研发乙型脑炎减毒活疫苗，进一步提高疫苗质量。
【发明内容】
[0006] 人二倍体细胞2BS细胞株是由1973年中国一个流产的3月龄女性胎儿肺组织建立 的一株人胚肺二倍体细胞，有限生命为63-65代，具有来源清晰、传代历史清楚、无外源因子 污染的特点，也是我国目前批准可用于人用疫苗生产的两个人二倍体细胞株之一。人二倍 体细胞2BS细胞株已经用于人风疹疫苗、水痘疫苗等疫苗的生产，经过几十年和大量人体接 种使用，证明了该细胞是安全、良好的细胞基质。
[0007] 目前国内市场上使用的乙脑疫苗主要是原代地鼠肾(PHK)细胞疫苗和Vero细胞疫 苗。P皿细胞容易受细菌、病毒、寄生虫等外源物质污染，比较难W控制，Vero细胞对接种人 群有潜在的致癌性。为了进一步提高乙脑疫苗的质量，能够出口到更多国际市场，让更多受 到乙脑病毒威胁的人群特别是儿童能健康的成长，我们将流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2 适应到人二倍体细胞2BS，使病毒能在人二倍体细胞上很好的适应和增值，并研究该疫苗生 产的稳定工艺，W便提高了乙脑疫苗的安全性和有效性，为全世界的人民特别是受到乙型 脑炎的危害人群的健康服务。
[0008] 本发明的目的在于提供能够达到W册标准的高度减毒、免疫原性好、遗传稳定性高 的乙型脑炎病毒株及其培育方法，提供疫苗生产用毒种，制备乙型脑炎减毒人二倍体细胞 活疫苗。
[0009] 本发明的目的是运样实现的：乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS上的适 应株的选育方法，其特征在于:选用我国流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2毒株作为亲 本株，培育步骤至少包含：
[0010] (1)乙脑病毒SA14-14-2在人二倍体细胞2BS上的适应性传代；
[0011] (2)对收获的每一代病毒株滴定；
[0012] (3)筛选出滴度最高的病毒株建立病毒的=级毒种库，=级毒种库分别为原始毒 种库：病毒株为SA14-14-2-2BS P34，病毒滴度是7 . OOlgPFU/mU主代毒种库：病毒株为 SA14-14-2-2BS P36,病毒滴度是 7.251gPFU/mL;工作毒种库：病毒株为 SA14-14-2-2BS P38，病毒滴度是7.151评即/mL
[0013] (4)对S级毒种库进行全基因组序列测定，获得全基因组序列；SA14-14-2-2BS P：M株、SA14-14-2-2BS P36株、SA14-14-2-2BS P38株全基因序列如沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3所示。
[0014] (5)对=级毒种库进行安全性检定和免疫检定。
[0015] 乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS上的适应株的选育方法，还可W运样 实现:通过单层、混悬的方式接种2BS细胞，传代适应后蚀斑法测定病毒滴度，确定病毒最佳 收获时间和接种量。
[0016] 具体接种传代方法是：
[0017] SA14-14-2-P服C5按0.2M0I接种于2BS细胞悬液中，获得Pl;
[0018] 培养5天后收获病毒，带毒细胞连续传代至第5代，获得P2-P5;
[0019]继续培养5天，将带毒细胞悬液和正常细胞悬液等量混合连续传代至第10代，获得 P6-P10；
[0020]第10代病毒按MOIO. 1混悬于2BS细胞悬液中，获得Pll;
[0021 ]再培养4天，将带毒细胞悬液和正常细胞悬液等量混合传代至第50代，获得P12-P50；
[0022] 筛选出滴度最高的P34、P36、P38病毒分别建立原始毒种库、主代毒种库和工作毒 种库。
[0023] 所述的乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS上的适应株的选育方法获得的 S级毒种库，包括原始毒种库:病毒株SA14-14-2-2BS P34全基因序列如SEQ ID N0:1;主代 毒种库:病毒株5414-14-2-288?36，全基因序列如569 10^:2;工作毒种库:病毒株5414-14-2-2BS P38,全基因序列如沈Q ID N0:3所示。
[0024] 本发明所述的乙型脑炎减毒活疫苗株在人二倍体细胞2BS上的适应株的选育方法 获得的S级毒种库用于制备出的乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2-2BS。
[00巧]本发明通过将流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2(巧V SA14-14-2-PHKC)接种于人二 倍体细胞上，通过不同的方式连续传代，使病毒能够在细胞上很好的适应和稳定的增殖，获 得较高滴度的病毒。按照《中国药典》=部(2010版），对病毒进行有效性和安全性检查，符合 规定的乙型脑炎减毒活疫苗的标准。同时，研究了已适应于人二倍体细胞的乙脑病毒的生 物学特性，包括免疫原性、免疫保护力和弱毒力稳定性等，最终获得安全有效质量可控的人 二倍体细胞乙型脑炎减毒活疫苗。
[00%]本发明的优点和显著效益：人二倍体细胞为正常核型细胞，在传代过程中保持二 倍体核型，无外源因子污染，无致癌性，没有传代细胞和原代动物细胞的缺点，具有的高免 疫原性和良好的耐受性，是Wffi)倡导的用于人用疫苗生产的理想细胞，目前已经成功应用于 多种疫苗的生产，如甲肝疫苗、水痘、脊髓灰质炎疫苗等。中国作为乙型脑炎的流行区，乙脑 疫苗的研发走在前列，虽然乙脑减毒活疫苗的安全性和有效性已经得W证实，但是原代地 鼠肾细胞疫苗存在动物容易受细菌、病毒、寄生虫等外源物质污染，难于控制。虽然中国采 用SPF地鼠肾细胞作为乙型脑炎减毒活疫苗生产用细胞基质，且2013年9月WHO已宣布中国 成都