一种长效的重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物疫苗技术领域，具体设及一种长效的重组狂犬病病毒疫苗株及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 狂犬病是最古老的传染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种 人畜共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率几乎 达100%。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，位居传染病死亡人数前=位， 多数是由于被动物咬伤或者抓伤而被感染。而在暴露前和暴露后及时接种疫苗可W有很好 的保护作用，当前广泛应用的狂犬病疫苗主要是原代细胞培养疫苗和传代细胞纯化疫苗等 灭活疫苗，运些疫苗虽然具有安全、有效等优点，但狂犬病暴露人群通常需要在较长时间 (21天）内进行多次免疫注射(至少4次）。此外，此种疫苗价格昂贵，进一步阻止了其在发展 中国家的使用。运样对于一些流浪动物及野生动物的免疫接种则很难实现。在我国，街头的 流浪狗、猫等动物为当前主要的传染源，将流浪的动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关 键。因此，当前狂犬病毒研究的主要目标之一是发展低毒、可简化免疫程序及长期有效的狂 犬病疫苗。
[0003] 重组狂犬病病毒疫苗是一种利用反向遗传技术对狂犬病毒进行改造，有目的性地 改变病毒的基因组结构，从而改变病毒的生物学特性，W增加安全性和免疫原性。欧美许多 国家已经将重组狂犬病病毒疫苗应用于野生动物的狂犬病防控。1994年Schnell等第一次 运用反向遗传技术成功的改造并捶救出狂犬病毒SAD B19株(Schnell MJl ,Mebatsion T, Conzelmann KK.Infectious rabies viruses from cloned cDNA.EMBO J 1994,13(18): 4195-203.)，目前应用的重组狂犬病病毒疫苗包括SAD B19株、RC-HL株（Ito H,Minamoto N,Watanabe T,Goto H,Rong LI,Sugiyama M,Kinjo T,Mannen K,Mifune K,Konobe T,et al.(A unique mutation of glycoprotein gene of the attenuated RC-HL strain of r曰bies virus,曰 seed virus used for production of 曰nim曰I v曰ccine in Japan.Microbiol Immunol.1994,38:479-482.)、皿P-Fluiy株（Inoue Ki,Shoji Y,Kurane !,Iijima T,Sakai T,Morimoto K.An improved method for recovering rabies virus from cloned cDNA. J Virol Methods.2003Feb; 107(2) :229-36.)等。随后基于W运些病毒 为母本，通过反向遗传学系统基础上构建了表达各种细胞因子，如MIP-lalpha(Zhao L, Toriumi H,Wang H,Kuang Y,Guo X,et al.Expression of MIP-lalpha(CCL3)by a recombinant rabies virus enhances its immunogenicity by inducing innate immunity and recruiting dendritic cells and B cells.J Virol.2010,84:9642-9648.)、GM-CSF(Ming Zhou,Lei Wang,Ling Zhao,Zhen F.Pu,et al.Recombinant rabies virus expressing dog GM-CSF is an efficacious oral rabies vaccine for dogs.0ncotarget.2015Nov 17;6(36) :38504-16.),缺失相关结构蛋白，如缺失M基因、P基 因或G基因的重组病毒疫苗（McGettigan JP,David F,Schnell MJ,et al.Safety and serological response to a matrix gene-deleted rabies virus-based vaccine vector in dogs.Vaccine.2014Mar26;32(15):1716-9.Cenna Jl,Hunter M,,McGettigan JP，et al.民eplication-deficient rabies virus-based vaccines are safe and immunogenic in mice and nonhuman primates.J Infect Dis.20090ct 15；200(8): 1251-60.Sato S,Ohara S,Tsutsui K,Iijima !.Effects of G-gene Deletion and 民eplacement on 民abies Virus Vector Gene Expression.PLoS One.2015May 29:10(5): e0128020.)、过表达相关结构蛋白（Hosokawa-Muto J，Ito N，Yamada K，et al.Characterization of recombinant rabies virus carrying double glycoprotein genes.Microbiol Immunol，2006，50(3):187-196.Tao LI,Ge J，Bu Z，et al.Generation of recombinant rabies Flury LEP virus carrying an additional G gene ere ates an improved seed virusfor inactivated vaccine production.Virol J.2011Sep25;8: 454.)等重组病毒疫苗株。但这些疫苗均存在许多不足，其中很重要的一点是中和抗体滴度 不能维持长期有效的水平上。例如，HEP-dG在第21天时中和抗体滴度达至顶峰后便下降 (Xiaohui Liu,Youtian Yang,Xiaofeng Guo，et al.A Recombinant 民abies Virus Encoding Two Copies of the Glycoprotein Gene Confers Protection in Dogs against a Virulent Challenge.PLoS 0ne.2014;9(2):e87105.)D因此，当前狂犬疫苗研 究的主要目标之一是发展长期有效的狂犬病疫苗。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株重组狂犬病病毒疫苗株，该病毒疫苗可^促进狂犬病毒 免疫记忆性，维持机体长久体液免疫反应。
[0005] 本发明W我们之前报道的狂犬病疫苗株LBN沈为母本(Wen Y，Wang H，Wu HJang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination.J Virol 85:1634-1.)，将赢源IL-7基因插入到LBN沈毒株基因组中，通过反向遗传操作技术 捶救出可W表达鼠 IL-7基因的重组狂犬病毒rLBNSE-IL7,该病毒株具有较高的病毒滴度， 致病性低，并且能维持机体长久体液免疫反应，长期诱导产生显著高水平的中和抗体，尤其 是再次免疫后，中和抗体水平显著快速升高。
[0006] 本发明的上述目的通过W下技术方案来实现：
[0007] 所用的LBNSE毒株来源于用于欧洲野生动物免疫用的疫苗株SAD-B19,但在SAD-B19病毒G蛋白上将194位的天冬氨酸(AAT)突变为丝氨酸(TCC)，将333位的精氨酸(AGA)突 变为谷氨酸(GAA)，相当于另一株疫苗株SAG2(在欧洲广泛用于野生动物口服免疫的疫苗 株），大大减弱了病毒的致病性(Wen Y，Wang H，Wu H，Yang F，Tripp RA，et al.(2011) Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination.J Virol 85:1634- 1.Rasalingam P,Rossiter JP,Mebatsion T,Jackson AC.Comparative pathogenesis of the SAD-L16strain of rabies virus and a mutant modifying the dynein light chain binding site of the rabies virus phosphoprotein in young mice. Virus Res . 2005,111: 55-60.Conzelmann KK,Cox JH,Schneider LG, Thiel HJ.Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD 819.￥1万〇1〇容7.1990，175:485-499.)。另夕^，还将5六0-819毒株基因组中6和1基因之间的假 基因敲除，在G基因和L基因之间加入两个酶切位点BsiWI和化el作为插入外源基因的位点。 [000引狂犬病病毒疫苗株SAD-B19的基因，其核巧酸序列如SEQ