重组人生长激素的生产方法

专利名称：重组人生长激素的生产方法
技术领域：
本发明涉及了基因工程领域。更具体地，本发明涉及一种高效生产重组人生长激素(recombinant human Growth Hormone，rhGH)的方法，以及有关的工程细胞的构建、rhGH的表达和纯化的工艺。
背景技术：
人生长激素是人内源性激素，由人脑垂体前叶合成分泌，在人体生长发育方面起着极其重要的作用。儿童期生长激素的缺乏可导致儿童矮小症(侏儒症)；青春期生长激素缺乏导致生长迟缓；成人生长激素缺乏可导致超重、机体组成异常(脂肪过多和胞外水份下降)、骨矿物密度下降、脂质构成恶化、胰岛素敏感性下降等，与骨折、心血管疾病、糖尿病等发病率及运动能力和精神状况下降有一定的关联。
人生长激素能通过促生长素介质(又称胰岛素样生长因子)的合成而促进骨骼、内脏和全身生长，促进蛋白质合成，加快脂肪和矿物质代谢等，故在人体生长发育过程中起着重要作用。人生长激素原来仅用于生长激素缺乏儿童矮小症，后因基因重组产品问世，临床用量足以保证，所以随着临床研究的深入，现适应症已逐渐扩大到Turner氏综合症(性腺功能不全综合症)、肾功能不全和其它病因所致儿童和青春期矮小症、成人生长激素缺乏症、艾滋病相关消瘦综合症等。
根据最新的医学文献报道，世界各国医生根据生长激素的作用机理在广泛的临床领域对其进行了深入的研究，结果提示人生长激素在很多疾病的治疗中都有显著效果，例如中度和重度烧伤、术后疲劳综合症的恢复、急性肾功能衰竭等。这些目前可视为潜在的临床适应症。此外，科学家们还在探索人生长激素在抗衰老保健与美容方面的用途，大量实验结果表明，它具有增强机体免疫功能和大脑记忆力、促进新陈代谢和体内(特别是腹部)脂肪氧化、提高骨密度、降低血压、减轻疲劳、改善睡眠等等作用，是延缓人体衰老、保持青春的有效药物。1996年，美国FDA批准hGH成为唯一的抗衰老激素治疗药物。可以预计，在抗衰老保健上的应用将成为hGH项目极具市场潜力的领域。
生长激素前体蛋白全长217个氨基酸，氨基端1-26个氨基酸为信号肽。成熟人生长激素是一种由191个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，分子量为22KD。hGH含有两个分子内二硫键，4个半胱氨酸，这两个分子内次级键对于形成正确的球性构象起了重要作用。成年人血浆hGH水平为1-5ng/ml，半衰期为15-20分钟。
基因工程表达rhGH始于1979年，Goeddel等人将hGH基因置于乳糖操纵子的调控下，在大肠杆菌系统中表达获得2.4mg/L的产量。Gray和他的同事在1985年实现了人rhGH的分泌性表达(rhGH基因接上大肠杆菌碱性磷酸酶的信号肽序列)—--分泌到大肠杆菌的周质空间，但产量太低；此后，Becker和Chang等人分别利用不同的信号肽序列将hGH的分泌表达水平(分泌到周质空间)提高到大约15mg/L。1987年，Kato等人将hGH基因和细菌的杀手基因(kill gene)藕联，获得hGH的分泌表达水平达到20.5mg/L，其中直接分泌到培养基中的水平达11.2mg/L，滞留在周质空间的约8.6mg/L。Hsiung等人在1989年，利用细菌素释放蛋白的表达和外膜蛋白(outer membrane protein)的信号肽，进一步提高了hGH的表达水平，使其分泌至大肠杆菌培养基中的表达水平提高到69.6mg/L。
目前，上市的rhGH均用大肠杆菌表达系统生产，虽然采用高密度发酵，但表达水平低，约占菌体蛋白的10％左右，加上由此带来的复杂的纯化工艺(需要反相层析)，产率约30mg/L。此低产率不能满足市场需求。目前，美国食品与药品管理局(FDA)批准rhGH可用于身材异常矮小但身体健康的儿童，适应症得到开拓，市场容量进一步增大，使对提升产业化价值的工艺研究更有意义。
除了应用大肠杆菌表达系统外，人们也试图利用芽孢杆菌、啤酒酵母以及哺乳动物细胞等表达系统生产rhGH。人生长激素分子上没有糖激化位点，与原核系统比较，采用真核表达系统不会增加糖链。遗憾的是，因为表达水平低、成本高等因素，目前几乎没有人采用这些表达系统来生产rhGH。而对毕赤酵母表达系统的研究是其中最重要的趋势。
与大肠杆菌相比，毕赤酵母细胞环境内更加适合所表达的人蛋白质分子的正确折叠和修饰，它表达的基因工程产物都是可溶性、构象正确的产物，其表达的hGH和天然hGH具有完全相同的分子构象和生物活性；同时，与大肠杆菌系统相比，毕赤酵母分泌表达的内源性蛋白很少，分泌表达的外源蛋白可以达到相当高的纯度，因而后续的纯化工艺要简单得多。而即使是分泌性表达的大肠杆菌系统，在产物初品中还是含有许多大肠杆菌有害成分(如内毒素)，为了彻底去除这些成分，必须经过复杂的纯化步骤，使得产品的最终得率很低，目前最高也只能做到20-25％。
1997年，Olazaran等人首次采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统表达rhGH，但表达水平偏低，经优化后表达水平也只有13mg/L，没有产业化生产的意义。
本发明系统优化、改变了获得rhGH的毕赤酵母工程细胞的方法，并通过发酵工艺的改进，同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、极具产业化价值的一种rhGH生产方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种高效表达和生产rhGH的方法。
本发明的另一目的是提供相应的rhGH编码序列、载体、工程细胞以及rhGH的表达和纯化的工艺。
在本发明的第一方面，提供了一种编码人生长激素的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的生长激素编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一优选例中，所述的核酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，它含有本发明上述的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，它是通过权利要求3所述的表达载体或本发明上述的序列转化宿主细胞后同源重组而得的，且染色体中整合有人生长激素编码序列。
在另一优选例中，所述的工程细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)。
在本发明的第四方面，提供了一种生产人生长激素的方法，包括以下步骤(a)在适合表达条件下，培养本发明上述的宿主细胞，从而分泌表达人生长激素；较佳地，所述的宿主细胞是毕赤酵母；(b)分离纯化出表达的人生长激素。
在另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的人生长激素编码序列。
在另一优选例中，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在另一优选例中，步骤(a)中的培养条件包括培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600为40-200，诱导期时间为24-120hr，发酵及诱导温度保持在28-30℃，微量元素PTM1量为1-20ml/L，诱导期的pH值为3-9，诱导期甲醇浓度控制在0.5-5％。
在另一优选例中，诱导过程中还可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、奶粉、精氨酸等作为保护剂。
在另一优选例中，步骤(b)的分离条件包括(a)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除菌体，获得发酵清液，(b)通过盐析和/或超滤进行初步纯化后，或直接通过阴离子交换、疏水层析方法，获得纯度达到95％以上(如95-99.9％)的纯品。
在另一优选例中，样品经5KD膜包超滤浓缩置换缓冲液、Q Sepharose F.F.以及phenyl sepharose F.F.层析以后得到纯度大于95％、得率在50％以上的纯品。


图1是本发明的一种表达质粒pPIC9K-rhGH的构建示意图。图中，Ampicillin表示氨苄青霉素抗性基因，Kanamycin表示卡那霉素抗性基因。
图2是摇瓶不同pH条件下rhGH的表达电泳图。各泳道如下1、诱导前；2、蛋白质标准物(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)3、4、5、6、7依次为pH7.0、6.0、5.0、4.0和3.0条件下诱导48小时取样；图3是在6.5L发酵罐中对发酵工艺优化前的表达电泳图。各泳道如下1.蛋白质标准物(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)；2、诱导前菌液上清；3-9、依次为不同诱导期的发酵液上清(4小时、8小时、16小时、24小时32小时、40小时和48小时)。
图4是在6.5L发酵罐中对发酵工艺优化后的表达电泳图，可看出经优化后rhGH的表达水平得到大幅提高。各泳道如下
1、蛋白质标准物(从上到下分子量为97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)；2、诱导前菌液上清；3-8、依次为诱导不同期的发酵液上清(8小时、16小时、24小时、32小时、40小时和44小时)。
图5是摇瓶补料优化电泳图，可看出使用Yeast extract效果较好。各泳道如下1诱导前摇瓶上清液；2空白对照诱导48hr；4Marker3、5、6、7依次为添加Yeast extract诱导24hr和48hr摇瓶上清液(6和7为重复)8、9、10、11依次为添加CA诱导24hr和48hr摇瓶上清液(10和11为重复)12、13、14、15依次为添加Peptone诱导24hr和48hr摇瓶上清液(14和15为重复)。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，发现现有的生产技术中人生长激素的表达量低的主要原因之一是基因序列未经优化。本发明人通过基因编码序列的优化设计，将优化后的人生长激素编码序列(SEQ ID NO1)转入甲醇利用型毕赤酵母(P.pastoris)，从而实现了rhGH的高水平分泌表达rhGH，在此基础上完成了本发明。
在另一优选例中，本发明还通过发酵工艺优化，进一步大幅度地提高rhGH的表达水平。由于表达水平高，达到1000mg/L以上，且为可溶性表达，给纯化工艺带来极大便利，通过二步层析工艺，大幅度提高产品得率，得到了表达量高、比活性高、提纯方便、得率高和性状稳定的rhGH产品，大大降低生产成本，非常适合大规模生产。
本发明提供了一种优化的，特别适合在酵母细胞中表达的人生长激素编码序列。该序列是根据毕赤酵母密码子偏爱性等原则而设计出的。设计出的rhGH的编码序列用常规方法进行全基因合成，或在通过PCR方法获得的cDNA上进行点突变。
在优化基因的5′端与3′端分别引进特异性酶切位点，用分子克隆的常规方法，将优化基因克隆入表达载体(如pPIC9、pPIC9K等)。然后，转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体，利用常规方法(如G418抗性或Southern印迹法)选出高拷贝转化株，摇瓶表达选出高表达工程细胞。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut+)或慢速利用甲醇型(Muts)。
整合入毕赤酵母染色体(或基因组)中的rhGH编码序列的拷贝数没有特别限制，可以为1-50个或更高，通常为2-30个。
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于毕赤酵母生长、表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括(但并不限于)以下培养基

一种优选的摇瓶培养条件是挑取YPD平板上的单克隆，以BMGY为摇瓶培养液，培养至OD600为1-40，以BMMY培养液诱导表达，诱导1至7天后，培养液上清的rhGH产量可达50-200mg/L。
为了大规模生产rhGH，需要在发酵罐上培养工程细胞，表达rhGH，因此对P.pastoris工程细胞的中试表达条件进行优化，发酵规模从1L到300L，发酵能力呈线性放大。优化后表达量大于1000mg/L发酵液。
经过本发明的反复实验，表达条件进行优化如下1.对于培养基的选择而言，发酵罐发酵时可选择无机盐培养基，也可在无机盐培养基基础上进行一定更改，但所含离子成份宜与无机盐培养基相似。

2.就温度的控制而言，rhGH的发酵及诱导温度保持在28-30℃。
3.就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；4.就溶氧(DO)的控制而言，DO控制在20-90％。溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决。
5.就补料的流加而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料。
6.就PTM1(混合微量元素)的量起始培养阶段PTM1的量为1-12ml/L培液，在补料阶段加入量为2-20ml/L补料。
7.就诱导期甲醇浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常甲醇浓度控制在0.5-5％。
8.保护剂可以是酪蛋白水解物(CA)，蛋白胨(peptone)，奶粉等，浓度0.1-10mg/mL；或0.1-1M精氨酸。
9.就诱导时间而言，没有特别限制，通常为12-160小时，较佳地为24-120小时。
表达的rhGH存在于培液上清，表达水平占发酵液上清总蛋白50％以上，使纯化复杂度大大下降。通常，发酵样品先以离心、过滤等方式去除细胞，发酵清液含目的蛋白质rhGH。发酵清液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。经不同层析技术、层析过程比较，优化的层析方法包括1.阴离子交换层析阴离子交换层析介质包括(但不限于)Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。
2.疏水层析疏水层析介质包括(但不限于)Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH4)2SO4等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
3.凝胶过滤层析疏水层析介质包括(但不限于)Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
经过上述纯化可得到rhGH纯品，纯化得率通常为40％以上，纯度95％以上，纯品得率约500mg/L培液。而目前成熟的通过大肠杆菌表达、纯化rhGH，其纯品得率约30mg/L，可见，本发明将大大提升rhGH的产业化价值。
纯化后的hGH可用常规方法制成各种剂型，如冻干粉针剂。选择一定的稳定剂，同时还可添加表面活性剂、抗氧化剂等保护剂，及适当缓冲液进行冷冻干燥。得到的制品具有活性损失小、水分含量低、稳定性好、易于长期保存等特点。
rhGH还可做成水针剂、喷雾剂、微球缓释剂，以及经PEG修饰制成长效制剂等。
在本发明的一个实例中，构建了rhGH的P.pastoris酵母表达工程细胞，甲醇诱导，高水平分泌表达rhGH，不需复性。
在本发明的另一个实例中，经过发酵参数优化，提高rhGH的表达水平。
因表达蛋白属于胞外分泌型，发酵上清可直接进行纯化。在本发明的另一个实例中，经过纯化，得到rhGH纯品，纯化得率50％以上，纯度95％以上，纯品得率约500mg/L培液。
在本发明另一实例中，纯化后原液加入适当辅料，制成rhGH的注射用粉针剂。稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
本发明的主要优点在于(1)优化后的生长激素基因非常适合酵母表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。
(2)含有优化的生长激素基因的宿主P.pastoris具有高密度生长的特性，非常适于基因工程药物大规模高密度的发酵生产。P.pastoris表达的hGH直接以可溶性、具活性形式分泌到胞外；产物不须复性，可以直接进行纯化；同时由于表达水平高，纯化工艺复杂程度大大简化，得率得到大幅度提高。
(3)与原核系统表达相比，产业化价值得到大幅度提升。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)；Jan-Christer Janson等人，Proteinpurification(John Wiley & Sonss，Inc.，1998)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.hGH毕赤酵母表达系统的构建1.目的基因的获得根据天然人生长激素的氨基酸序列，按毕赤酵母密码子偏爱性等原则，设计目的基因并全基因合成，其序列如SEQ ID NO1所示的DNA片段。同时在其5′端与3′端分别引入XhoI、EcoRI酶切位点。
用全合成方法获得人生长激素基因(SEQ ID NO1)，该基因编码人生长激素氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.表达质粒pPIC9K/rhGH的构建及高表达工程细胞的获得构建过程如图1所示。合成的全基因rhGH用XhoI+EcoRI部分酶切(因基因中间有一XhoI位点)，先克隆入pPIC9(Invitrogen公司)中，得到pPIC9/rhGH，测序确证DNA序列正确无误。然后，pPIC9K质粒(Invitrogen公司)用Bpu1102I+EcoRI酶解后回收大片段，与同样酶切的pPIC9/rhGH回收的小片段连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选转化子，获得插入rhGH基因的pPIC9K质粒把构建好的重组质粒pPIC9K/rhGH线性化，电穿孔转化宿主细胞P.pastoris，涂布MD平板，然后在不同浓度G418(如1、2、3、4、5mg/L)的YPD平板上筛选，得到一批高抗性工程株，在试管中表达筛选获得多个高效表达株，诱导48小时后表达产量约50-200mg/L培液(附图2)。
实施例2 pH对表达水平的影响培养基pH可能影响毕赤酵母工程细胞表达rhGH的水平。取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于50ml培养基的500ml三角烧瓶中，培养24hr左右，1％甲醇诱导，诱导阶段的pH需按下表调节，SDS-PAGE检测表达情况。

实验结果表明，在摇瓶中表达rhGH在pH在3.0-4.0表达较好(附图3)。
实施例3 保护剂对表达水平的影响保护剂可以防止目的蛋白的降解。取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于50ml培养基的500ml三角烧瓶中，培养24hr左右，1％甲醇诱导，按下表添加不同的保护剂，SDS-PAGE检测表达情况。

实验结果表明，三种保护剂中Yeast extract效果较好，1％浓度也比0.5％浓度好(附图4)。
实施例4.PTM1量对表达水平的影响在实施例2的基础上，比较以下二种方法方法一
基础培养基中PTM1量2ml/L诱导阶段补料中PTM1量2ml/L补料方法二基础培养基中PTM1量2ml/L诱导阶段补料中PTM1量10ml/L补料结果如下表所示，表明在诱导阶段补料时，PTM1的量以较高为好(3-20ml/L补料)。

实施例5.中试发酵条件选择及优化NBS BioFlo 3000发酵罐(6.5L)

经过上述优化后，rhGH表达量占发酵上清液总蛋白60％，表达量达1500mg/L以上(附图4和图5)。
实施例6.rhGH纯化实施例4的发酵液4℃下5000rpm离心10分钟，得上清。
使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为5KD，超滤时留取回流液。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右，加入以10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平和10mM PB(pH7.4)缓冲液的电导水平接近。
层析1层析介质Q Sepharose F.F.(Phamarcia)缓冲液溶液A10mM PB(pH7.4)溶液B10mM PB+1M NaCl(pH7.4)上样将超滤浓缩的rhGH溶液(1L左右，电导为4000us/cm左右)上样清洗上样后用6CV(柱体积，下同)的溶液A清洗层析柱梯度清洗后直接用30％溶液B洗脱目标蛋白收集收集30％B洗脱下的蛋白层析2层析介质phenyl-sepharose(Phamarcia)缓冲液溶液A10mM PB(pH7.4)溶液C10mM PB+3M NaCl(pH7.4)上样将层析1得到的样品加入固体NaCl至3.0M，上样梯度100％A直接清洗收集收集100％A洗下的目的蛋白样品经过此2步层析，即阴离子交换层析、疏水层析以后，纯度提高至95％、得率在50％以上的rhGH纯品，纯品得率500mg/L培液上清。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源医药研究有限公司<120>重组人生长激素的生产方法<130>035472<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>576<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(576)<223>优化的人生长激素编码序列<400>1ttcccaacta taccactaag tcgactattc gataacgcta tgcttcgggc ccatcgtctt60catcagctag cctttgacac ctaccaggag tttgaagagg cctatatccc caaggaacag 120aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt tctcagaatc gattccgaca 180ccctccaatc gcgaggaaac acaacagaaa tccaacctag agctcctccg cataagcttg 240ctgctcatcc agtcgtggct cgagcccgtg cagttcctga ggagtgtctt cgccaacagc 300ctggtctacg gcgcctctga ttcgaacgtg tacgacctgc tgaaggacct agaggaaggg 360atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagcccgc ggactgggca gatcttcaag 420cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg acgcactact caagaactac 480gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg agacattcct gcgcatcgtg 540cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctag 576<210>2<211>191<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190
权利要求
1.一种编码人生长激素的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的生长激素编码区与SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.如权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种工程细胞，其特征在于，它是通过权利要求3所述的表达载体或权利要求1所述的序列转化宿主细胞后同源重组而得的，且染色体中整合有人生长激素编码序列。
5.如权利要求4所述的工程细胞，其特征在于，它是毕赤酵母(PichiaPastoris)。
6.一种生产人生长激素的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)在适合表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而分泌表达人生长激素，所述的宿主细胞是毕赤酵母；(b)分离纯化出表达的人生长激素。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的人生长激素编码序列。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中的培养条件包括培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600为40-200，诱导期时间为24-120hr，发酵及诱导温度保持在28-30℃，微量元素PTM1量为1-20ml/L，诱导期的pH值为3-9，诱导期甲醇浓度控制在0.5-5％。
10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)的分离条件包括(a)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除菌体，获得发酵清液，(b)通过盐析和/或超滤进行初步纯化后，或直接通过阴离子交换、疏水层析方法，从而获得纯度达到95-99.9％的纯品。
全文摘要
本发明提供一种优化的适合酵母表达的重组人生长激素(recombinant human Growth Hormone，rhGH)的编码序列，高效生产rhGH的方法，以及有关的工程细胞的构建、rhGH的表达和纯化的工艺。优化后的生长激素基因非常适合酵母表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。本发明可高效、简便、低成本地获得rhGH纯品。
文档编号C12N15/18GK1618968SQ200310108760
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月21日 优先权日2003年11月21日
发明者黄阳滨, 叶建明, 杜碧金, 杨津 申请人:上海新生源医药研究有限公司