专利名称：水稻钾、钠离子转运基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物学领域，具体地说，本发明涉及新的水稻(Oryza sativa)的K+/Na+转运蛋白基因及其编码蛋白。本发明还公开了编码这种K+/Na+转运蛋白的基因的用途，尤其是在植物品种改良和杂交育种中用于改变植物的耐盐性。
背景技术：
钾(K)是植物最重要的三大大量必需元素之一。钾离子(K+)是植物细胞中含量最高的阳离子之一，其能调节植物体的许多重要生理功能，如提高植物耐盐性、增强植物的光合作用、增强植物体内物质合成和转运等。因此研究控制植物K+离子吸收的分子机制显得十分重要，也是近年来研究的热点。
植物K+离子吸收主要由通道蛋白基因和转运蛋白基因控制，前者基本上为被动运输，而后者为主动运输。通道蛋白基因主要是二大类AKT和KAT，而转运蛋白基因主要有HKT(High-Affinity K+transporter，高亲和性钾离子转运蛋白)和HAK(High-Affinity K+uptake，高亲和性钾离子摄取蛋白)二大类。
近年来的研究表明，有些转运蛋白基因还具有运输Na+的功能，从而与植物耐盐性密切相关。目前，在水稻中克隆并功能分析了OsHKT1和OsHKT4基因。结果表明OsHKT1仅高亲和运输Na+，而OsHKT4却是对K+/Na+同时运输。由于植物的长期进化的结果，形成了复杂的离子吸收机制，涉及的基因较多。
由于K+/Na+转运基因与植物的耐盐性密切相关，因此，为了有效地、针对性地改变植物品种的耐盐性，本领域迫切需要开发与耐盐性有关的蛋白及其编码基因。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的K+/Na+转运蛋白(即水稻K+/Na+转运蛋白)及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在改变植物耐盐性方面的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的水稻K+/Na+转运蛋白，该多肽源自水稻，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进植物K+/Na+转运功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述水稻K+/Na+转运蛋白的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1665位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1662位的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-3999位的核苷酸序列。。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备水稻K+/Na+转运蛋白的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出水稻K+/Na+转运蛋白。
在本发明的第五方面，提供了与上述的水稻K+/Na+转运蛋白特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1500个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了抗本发明蛋白的抗体以及一种检测样品中是否存在水稻K+/Na+转运蛋白的方法，它包括将样品与水稻K+/Na+转运蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻K+/Na+转运蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种改变植物耐盐性的方法，它包括步骤
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有水稻K+/Na+转运蛋白DNA编码序列，所述的水稻K+/Na+转运蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进植物K+/Na+转运功能的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使水稻K+/Na+转运蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入水稻K+/Na+转运蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了控制水稻盐胁迫下K+/Na+转运基因SKc1的氨基酸序列及其与HKT基因家族成员的同源性比较。
图2显示了盐胁迫下(140mM NaCl)水稻SKc1的近等基因系(SKc-NIL)和轮回亲本“越光”的Na+浓度。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从水稻(Oryza sativa.L)中，利用图位克隆方法结合生物信息学方法从高度耐盐水稻品种中克隆到在盐胁迫下控制水稻K+/Na+离子吸收新基因，并对其进行功能研究，显示该基因在盐胁迫下明显增加K+吸收、而降低Na+，减少离子毒害，进而能增强水稻的耐盐性，因此在农作物抗逆性育种中具有应用前景。
在本发明中，术语“水稻K+/Na+转运蛋白”、“水稻K+/Na+转运多肽”、“SKc1蛋白”、“SKc1多肽”等可互换使用，都指具有水稻K+/Na+转运蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。
在未特别指出时，术语“K+/Na+转运蛋白”包括野生型和突变型K+/Na+转运蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的水稻K+/Na+转运蛋白或多肽”是指水稻K+/Na+转运蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化水稻K+/Na+转运蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括水稻K+/Na+转运蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然水稻K+/Na+转运蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“水稻K+/Na+转运蛋白”指具有水稻K+/Na+转运蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与水稻K+/Na+转运蛋白相同功能的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻K+/Na+转运蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与水稻K+/Na+转运蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗水稻K+/Na+转运蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含水稻K+/Na+转运蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了水稻K+/Na+转运蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有水稻K+/Na+转运蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供水稻K+/Na+转运蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻K+/Na+转运蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“水稻K+/Na+转运蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码水稻K+/Na+转运蛋白的多聚核苷酸。
本发明的水稻K+/Na+转运蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或水稻K+/Na+转运蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的水稻K+/Na+转运蛋白。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码水稻K+/Na+转运蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，水稻K+/Na+转运蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含水稻K+/Na+转运蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐盐性改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于；常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的水稻K+/Na+转运蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗水稻K+/Na+转运蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组水稻K+/Na+转运蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激水稻K+/Na+转运蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对水稻K+/Na+转运蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的水稻K+/Na+转运蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达水稻K+/Na+转运蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用水稻K+/Na+转运蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与水稻K+/Na+转运蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗水稻K+/Na+转运蛋白的抗体可用于检测样品中的水稻K+/Na+转运蛋白。
本发明还涉及定量和定位检测水稻K+/Na+转运蛋白水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的水稻K+/Na+转运蛋白水平，可用于解释水稻K+/Na+转运蛋白在耐盐性方面重要性。
一种检测样品中是否存在水稻K+/Na+转运蛋白的方法是利用水稻K+/Na+转运蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与水稻K+/Na+转运蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻K+/Na+转运蛋白。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用水稻K+/Na+转运蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测水稻K+/Na+转运蛋白的转录产物。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从水稻cDNA文库中分离出的，其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1665个碱基，其开放读框位于1-1662位，编码全长为554个氨基酸的水稻K+/Na+转运蛋白(SEQ ID NO2)，其是一种具有10个跨膜区的膜蛋白。
水稻K+/Na+转运蛋白具有明确的控制植物K+/Na+转运的功能。因此，水稻K+/Na+转运蛋白为改变植物的耐盐性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以导入K+/Na+转运基因，可改变现有优良农作物品种的耐盐性，获得高耐盐性的小麦、水稻等农作物或其他品种如林草、果树、花木等，解决农林业生产中存在的实际问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1水稻K+/Na+转运蛋白基因的基因定位和连锁分析利用以高度耐盐水稻品种“Nona Bokra”(可购自国际水稻研究所等的水稻品种资源库)与感盐水稻品种“越光”(可购自从国际水稻研究所等的水稻品种资源库)构建的遗传群体和分子标记，对盐胁迫下控制水稻K+离子吸收的基因如下进行基因组定位。按Haruhhina Y，etal，Genetics，148，479-497，1998中所述的方法，首先构建一张覆盖水稻基因组的F2代分子标记连锁图，利用相应的F3株系测定水稻K+离子浓度，然后通过常规的区间作图法进行全基因组扫描，定位相关基因。结果发现一个控制盐胁迫下水稻K+离子吸收的主效基因SKc1，位于第1号染色体上。
进一步通过如下高代回交分析方法即将高度耐盐品种“NonaBokra”与感盐品种“越光”杂交获得F1，再以感盐品种“越光”作为轮回亲本与F1进行3-4次回交，获得只有携带高度耐盐品种SKc1基因的染色体区间为杂合分离状况的大规模群体，在遗传背景一致下，利用已知分子标记对该基因进行高精确度连锁分析。结果表明，该基因被定位在一个PAC克隆上。
实施例2水稻K+/Na+转运蛋白基因的克隆
(a)基因组序列在高精确度连锁分析的基础上，用以下方法从高度耐盐水稻品种“NonaBokra”基因组中克隆到SKc1基因。根据水稻基因组的碱基序列设计高密度的分子标记(如CAPS，SSR，STS)筛选大规模遗传群体(约7000株)中的交换个体，测定这些交换个体的K+浓度，将该基因锁定，然后通过PCR技术(引物分别对应于SEQ ID NO3第1-28位，以及3969-3999位)从高度耐盐水稻品种“Nona Bokra”基因组中克隆到SKc1基因。基因组片断长度为3.999Kb(SEQID NO3)，包含有3个外显子(exon)和2个内含子(intron)。其中外显子1位于1-1238，外显子2位于2888-3115，外显子3位于3801-3999，内含子1位于1239-2887，内含子2位于3116-3800。
(b)cDNA序列用常规方法构建高度耐盐水稻品种Nona Bokra的cDNA文库。以cDNA文库为模板，用PCR方法(正向引物5’-ATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO4)；反向引物5’-TTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO5))，获得扩增产物，构建到T载体(Promega公司)上进行测序，从而获得SKc1基因的全长ORF(openreading-frame)(SEQ ID NO1)，其碱基长度为1.665Kb，编码554个氨基酸(SEQ ID NO2)，蛋白产物分子量估计为60.1KD，推测其是具有10个跨膜区的膜蛋白。
与其他蛋白的氨基酸序列比较表明(图1)，其与大麦基因TaHKT1的相似性(Similarity)和一致性(Identity)分别为52.3％和43.7％；与拟南芥基因AtHKT1的相似性和一致性分别为56.1％和47.9％；与水稻基因OsHKT1的相似性和一致性分别为54.4％和43.7％；与水稻另一基因OsHKT4的相似性和一致性分别是48.3％和41.2％。这提示SKc1是K+/Na+转运蛋白基因，为HKT基因家族的一个新基因成员。
实施例3RT-PCR法获得水稻K+/Na+转运蛋白的编码序列为了验证序列的正确性，根据SEQ ID NO1的序列，设计和合成了如下引物正向引物5’-ATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO4)
反向引物5’-TTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO5)。
以用常规方法抽提的Nona Bokra水稻(购自国际水稻研究所水稻品种资源库)Poly A+RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃5分钟，随后94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，回收，连接到T-Easy载体上采用终止物荧光标记(Bi g-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果验证了水稻K+/Na+转运蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO2)的正确性。
实施例4水稻K+/Na+转运蛋白的点突变对高度耐盐水稻品种“Nona Bokra”与感盐水稻品种“越光”的K+/Na+转运基因进行再次测序和比较。结果发现，SKc1基因在高度耐盐水稻品种“NonaBokra”与感盐水稻品种“越光”之间存在6个碱基突变，其中第418、551、994和1183的碱基变化造成4个氨基酸替换(表2)。这些位点的变化可能是引起该二品种的基因功能有差异的原因。
表2两种K+/Na+转运基因的比较
实施例5水稻K+/Na+转运蛋白基因的功能分析实验高度耐盐品种“Nona Bokra”与感盐品种“越光”杂交获得F1，再以感盐品种“越光”作为轮回亲本与F1进行4次回交获得BC4F1(4次回交的F1代)，在每次回交过程中利用分子标记进行选择，获得遗传背景均恢复为轮回亲本“越光”的植株。最后利用分子标记辅助选择方法从BC4F2(4次回交的F2代)中选育到SKc1的近等基因系SKc1-NIL(Nearly Isogenic Line)，即通过分子标记跟踪将高度耐盐水稻品种的SKc1基因组片段(短片段)导入轮回亲本“越光”的遗传背景中。利用水稻基因组数据库的碱基序列进行基因预测，结果显示在所导入的该基因组片段内有关离子转运蛋白基因只有SKc1基因而没有其它基因，因此在近等基因系SKc1-NIL中来自高度耐盐品种“Nona Bokra”基因组的有关离子转运蛋白基因只有SKc1基因导入感盐品种“越光”中。利用SKc1-NIL与轮回亲本“越光”进行非盐胁迫与盐胁迫下(140mMNaCl)K+浓度的测定。
结果显示，在非盐胁迫下SKc1-NIL与“越光”的K+浓度没有差别，而在盐胁迫下SKc1-NIL的地上部的K+浓度显著高于越光(增加27.28％)，表明耐盐品种SKc1基因位点具有明显增加K+吸收的功能并且该基因还受到盐胁迫的诱导；另外测定了Na+浓度，结果显示在SKc1-NIL的叶、茎中的Na+浓度显著低于“越光”，而SKc1-NIL的根中Na+浓度高于“越光”(图2)。
这表明，耐盐品种的SKc1基因在盐胁迫下具有增加水稻地上部的K+吸收、而降低Na+的功能，从而减轻Na+对叶的毒害，提高水稻的耐盐性。可见该基因在农作物抗逆性育种上具有应用价值。这是在农作物相关K+/Na+转运基因中首次发现的新功能。
实施例6水稻K+/Na+转运蛋白的制备在该实施例中，以实施例3的扩增产物为模板，用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.6和7)进行扩增，获得cDNA作为插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5’-GCGGATCCATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO.6，含有BamHI限制性内切酶的酶切位点)；3′端引物序列为5’-CGAAGCTTTTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO.7，含有HindIII限制性内切酶的酶切位点)。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证SKc1的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的SKc1。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱SKc1。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约60KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例7制备抗体将实施例6中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀SKc1基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
实施例8水稻SKc1转基因本实施例采用常用的双元载体pCAMBIA1300(购自CAMBIA公司，Canberra，Australia)作为水稻转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygr)以及限制性内切酶克隆位点(MCS)。在限制性内切酶克隆位点可插入SKc1的基因组DNA或cDNA构建成转基因质粒。
(1)带SKc1基因组DNA的转基因质粒构建利用PCR方法以高度耐盐品种“Nona Bokra”基因组DNA作为模板分4段(寡核苷酸引物分别为SEQ ID NO.9与10、11与12、13与14、15与16)扩增。
SEQ ID NO.95’-AGCTGGGAGTTGGAGAAGGACT-3’SEQ ID NO.105’-CGACGTGACAGATTTGGATTAC-3’SEQ ID NO.115’-CCAAATCAAGGGCTCCAA-3’SEQ ID NO.125’-ACTTCCTCTTCATCTCCC-3’SEQ ID NO.135’-TGCTGGTGTTTGTCTTGGACAG-3’SEQ ID NO.145’-ATATGGTCTTCGATGCTGTGGC-3’SEQ ID NO.155’-GAGGGAGAAGAAGTGATTTT-3’SEQ ID NO.165’-TGAATTATACTGCGTGAACC-3’分别用BstxI、NarI、KpnI内切酶连接成7.276Kb的基因组DNA片段，包含SKc1基因编码区。该片段还包括翻译起始密码子ATG上游的2554个碱基及终止密码子TAA下游723个碱基。该片段的5’端连接EcoRI接头后与经EcoRI和SmaI消化的pCAMBIA1300(购自CAMBIA公司)连接。连接物转化大肠杆菌常用菌株DH5α，在含有Kan(50μg/ml)和X-gal的2YT培养基上筛选转化子，挑选白色菌落提取质粒，用EcoRI和NotI酶解验证约7.3Kb片段插入载体，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。
(2)带SKc1基因cDNA的转基因质粒构建在该实施例中，以实施例3的扩增产物为模板，用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.6和8)进行扩增，获得的cDNA片段插入pCAMBIA1300上相应的限制性内切酶克隆位点。该质粒的限制性内切酶克隆位点EcoRI和BamHI间插入了CaMV35S启动子，XbaI和HindIII间插入了NOS基因的终止信号序列。
5′寡核苷酸引物序列为5’-GCGGATCCATGAGTTCTCTGGATGCCAC-3’(SEQ ID NO.6，含有BamHI限制性内切酶的酶切位点)；3′端引物序列为5’-CGTCTAGATTATTCTATCTTCCATGCCTGACC-3’(SEQ ID NO.8，含有XbaI限制性内切酶的酶切位点)。
用BamHI和XbaI消化cDNA和载体pCAMBIA1300，将cDNA连接到CaMV35S启动子和NOS基因的终止信号序列之间。连接物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有Kan(50μg/m1)的2YT培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用BamHI和XbaI酶解挑选出有约1.7Kb片段插入的克隆，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。
(3)SKc1基因转化水稻上述两种重组质粒通过冻融法导入常用的农杆菌菌株EHA105。每200μl EHA105感受态细胞加0.5-1μg(约10μl)质粒DNA混匀，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)的YEB平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含抗生素的YEB平板上划单菌，连续划3次。参考Hiei等(1994)的方法，从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD600为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此菌液即可用于转化水稻各种受体材料。
本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻中花11(感盐品种，购自中国农业科学院作物品种资源库)的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的中花11未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，用1.5％NaClO溶液消毒90分钟，无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Vir基因活化物，使用浓度为100μmol/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1(Hyg 25mg/l)进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D2S2(Hyg 50mg/l)选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS0H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。获得的再生植株移栽成活后提取叶片总DNA，经PCR或Southern杂交鉴定转化植株。用转基因T1代进行盐胁迫下K+、Na+离子浓度测定。
结果表明，转基因水稻的耐盐性有所提高，这验证SKc1基因功能。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>水稻钾、钠离子转运基因及其应用<130>036261<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1665<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1665)<223>
<400>1atg agt tct ctg gat gcc act act cct aga tat gac gag ttt aaa agg 48Met Ser Ser Leu Asp Ala Thr Thr Pro Arg Tyr Asp Glu Phe Lys Arg1 5 10 15atc tac cac ctt ttc ctt ttc cat gca cac cca ttc tgg ctc caa ctg 96Ile Tyr His Leu Phe Leu Phe His Ala His Pro Phe Trp Leu Gln Leu20 25 30ctg tac ttc ctc ttc atc tcc ctc ttg ggt ttc ttg atg ctg aaa gct144Leu Tyr Phe Leu Phe Ile Ser Leu Leu Gly Phe Leu Met Leu Lys Ala35 40 45ctg ccg atg aag acc agc atg gtg ccg agg ccc atg gac ttg gac ctg192Leu Pro Met Lys Thr Ser Met Val Pro Arg Pro Met Asp Leu Asp Leu50 55 60atc ttc acg tcg gtg tcg gcg acg acg gtg tcg agc atg gtc gcc gtc240Ile Phe Thr Ser Val Ser Ala Thr Thr Val Ser Ser Met Val Ala Val65 70 75 80gag atg gag tcc ttc tcc aac tcc cag ctc ctc ctc atc acc ctc ctc288Glu Met Glu Ser Phe Ser Asn Ser Gln Leu Leu Leu Ile Thr Leu Leu85 90 95atg ctg ctt ggt ggt gag gtc ttc acc agc atc ctt ggc ctc tac ttc336Met Leu Leu Gly Gly Glu Val Phe Thr Ser Ile Leu Gly Leu Tyr Phe100 105 110acc aac gcc aag tac tcc tcc aag atg ata gca acc tta cct gat gat384Thr Asn Ala Lys Tyr Ser Ser Lys Met Ile Ala Thr Leu Pro Asp Asp115 120 125gac gac cat ggt ggc agt ggc aaa cca cca cca gca acg acg tca cct432Asp Asp His Gly Gly Ser Gly Lys Pro Pro Pro Ala Thr Thr Ser Pro130 135 140
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权利要求
1.一种分离的水稻K+/Na+转运蛋白，其特征在于，它包含具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进植物K+/Na+转运功能的由(a)衍生的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中1-1665位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1662位的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-3999位的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
8.一种水稻K+/Na+转运蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出水稻K+/Na+转运蛋白。
9.一种改良植物的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有水稻K+/Na+转运蛋白的编码序列，所述的水稻K+/Na+转运蛋白选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进植物K+/Na+转运功能的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使水稻K+/Na+转运蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入水稻K+/Na+转运蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法改良植物的耐盐性。
全文摘要
本发明提供了一种新的植物基因－水稻K
文档编号C12N15/63GK1618804SQ20031010868
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月19日 优先权日2003年11月19日
发明者林鸿宣, 任仲海, 高继平, 晁代印, 朱美珍, 王宗阳, 蔡秀玲 申请人:中国科学院上海生命科学研究院