专利名称：Tpa衍生物的基因工程菌破碎技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地涉及组织纤溶酶原激活剂(tPA)衍生物的基因工程菌的破碎技术。
背景技术：
随着生物科学的发展，从大规模的基因工程药物生产到少量的重组蛋白研究，大肠杆菌表达系统由于其高效性和成熟的技术而被广泛地应用于生产和科研中。通常，该系统表达的蛋白以胞内可溶性蛋白，或胞内不可溶的包涵体形式存在，在完成细菌培养后，就必须破碎细胞，获得蛋白，并进一步分离纯化。
目前，常用的细胞破碎一般分为机械方法与非机械方法(如冻融、渗透压冲击、酶解法、化学法)等，最为常用的方法仍为机械破碎方法，包括超声波破碎、珠磨机(Bead mill)以及高压匀浆(High pressure homogenizer)。超声波破碎因其操作简单、有效而广泛应用于小规模细胞破碎，珠磨机以及高压匀浆则广泛用于大规模生产。
细胞破碎作为目标蛋白纯化过程的第一步，如何提高细胞破碎的效率，获得目标产物的高回收，同时尽量对避免目标蛋白的损伤，将对于后续纯化过程产生重要影响。在目前所广泛应用的细胞破碎过程中，往往会产生大量的热能，过高的温度会使破碎率降低，能量消耗增大，并同时导致对目标产物的损伤。这种情况在大规模细胞破碎过程中尤为严重。由于破碎细菌的主要阻力来自于细菌细胞壁肽聚糖的网状结构。因此，研究和开发能够有效降低菌体细胞壁强度，从而能够快速、有效并在较温和条件下破碎细胞的技术，对于重组蛋白质工业化生产具有十分现实的意义与应用价值。
因此，本领域迫切需要开发快速、有效地细胞破碎技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种快速、有效地破碎重组tPA衍生物细胞的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种对生产组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的大肠杆菌进行破碎的方法，它包括步骤(a)在表达条件下，培养生产组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的大肠杆菌，所述大肠杆菌含有表达组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的第一质粒，和表达λ噬菌体裂解基因SˉRRz的第二质粒，其中裂解基因SˉRRz与表达调控序列可操作地相连，从而表达出组织纤溶酶原激活剂或其衍生物，以及裂解基因SˉRRz的表达产物(较佳地，裂解基因S-RRz的表达产物不含分泌信号肽)；(b)收集大肠杆菌菌体；(c)将大肠杆菌菌体悬浮于含0.5-10mM细胞膜渗透诱导剂的水溶液中，在37±3℃下放置10-60分钟，其中所述水溶液pH为7.5-9，且所述的细胞膜渗透诱导剂选自下组EDTA、EGTA或其混合物；(d)用超声波法或高压匀浆法破碎步骤(c)中的菌体，获得破碎产物。
在另一优选例中，步骤(c)中在37±2℃下放置10-40分钟。
在另一优选例中，步骤(c)中在37±2℃下放置10-30分钟。
在另一优选例中，步骤(c)中所述的细胞膜渗透诱导剂的浓度为1-5mM。
在另一优选例中，步骤(c)中所述的细胞膜渗透诱导剂是EDTA。
在另一优选例中，步骤(c)中所述的水溶液的pH为7.5-8.5。
在另一优选例中，所述的λ噬菌体裂解基因SˉRRz是S基因含Sam7突变的λ噬菌体cI857的DNA的EcoRI/ClaI酶切片段，大小为1400-1500bp。
在另一优选例中，步骤(d)中使用超声波法破碎。
在另一优选例中，还包括步骤(e)从步骤(d)的破碎产物中分离纯化出组织纤溶酶原激活剂或其衍生物。
在本发明的第二方面，提供了一种大肠杆菌，它含有表达组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的质粒，它还含有表达λ噬菌体裂解基因SˉRRz的质粒，其中裂解基因SˉRRz与表达调控序列可操作地相连，且裂解基因S-RRz的表达产物不含分泌信号肽。
图1显示了细菌生长曲线。其中，1.TPA衍生物工程菌；2.TPA衍生物工程菌；3.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌4.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌。
图2显示了目的蛋白的表达。其中，各泳道如下1.分子量标准；2.TPA衍生物工程菌；3.TPA衍生物工程菌；4.TPA衍生物工程菌；5.TPA衍生物工程菌诱导前对照；6.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌诱导前对照；7.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌；8.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌；9.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌。
图3TPA衍生物工程菌的发酵电泳图。其中，各泳道如下1.分子量标准；2.TPA衍生物工程菌摇瓶发酵诱导3小时；3.TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导前对照；4.TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导1小时；5.TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导3小时；6.TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导2小时。
图4含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌发酵电泳图。其中，各泳道如下1.分子量标准；2.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌摇瓶发酵诱导3小时；3.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导前对照；4.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导1小时；5.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导2小时；6.含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌发酵罐发酵诱导3小时。
图5显示了含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌与对照(无SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌)随超声波作用时间的延长破碎效果比较。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，将λ噬菌体的裂解基因SˉRRz引入生产tPA的大肠杆菌工程菌。意外地发现，在发酵过程中，裂解基因的表达产物不仅对细菌的生长没有影响，而且对目的蛋白的表达也基本上没有影响；而在破碎过程中，通过加入特定的细胞膜渗透诱导剂(如EDTA等鳌合剂)，可以快速地破坏大肠杆菌的细胞壁结构，使得大肠杆菌细胞得以简便快速的破碎。在此技术上完成了本发明。
如本文所用，术语“tPA”或“组织纤溶酶原激活剂”指一种具有溶解血栓作用的蛋白质分子，其蛋白质分子的氨基酸序列以及cDNA编码序列是已知的(见Pennica et al.，1983；Nature，301，214)。tPA蛋白质分子量为67kDa，由指形区、表皮生长因子区、两个三角区(K1及K2)以及蛋白酶活性区组成。
如本文所用，术语“tPA衍生物”或“组织纤溶酶原激活剂衍生物”指仅保留有tPA分子K2区及蛋白酶活性区的蛋白质分子，在例如US专利5223256等众多文献中有描述。
如本文所用，术语“细胞膜渗透诱导剂”是能够诱导细菌改变细胞膜渗透性，从而释放出细胞膜内的蛋白质的物质。代表性细胞膜渗透诱导剂是能够螯合Ca2+、Mg2+的鳌合剂，如EDTA、EGTA或其混合物等。
如本文所用，“裂解基因SˉRRz”指S基因缺陷的λ噬菌体SˉRRz基因。一种代表性例子是从S基因带有琥珀突变的λ噬菌体(cI857，sam7)中获得的S基因缺陷的SˉRRz基因片段。代表性的λ噬菌体裂解基因SˉRRz是S基因含Sam7突变的λ噬菌体cI857的DNA的EcoRI/ClaI酶切片段，大小约为1400-1500bp。
λ噬菌体的S基因表达的酶具有破坏细胞膜的作用，可使R和Rz基因的产物能到达细胞壁的肽聚糖层，从而裂解细胞壁。将S基因缺陷的SˉRRz基因导入大肠杆菌中，细胞中只是积累了R和Rz基因的产物，并不能使细胞裂解。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
如本文所用，“本发明的工程菌”指含有第一质粒(表达tPA或其衍生物)和第二质粒(表达SˉRRZ基因)的大肠杆菌工程菌。
本发明的人tPA或其衍生物和SˉRRZ基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的tPA或其衍生物和SˉRRZ基因的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
本领域常用的适用于大肠杆菌的表达载体都可用于本发明。例如含有T7启动子的载体有pET5、pET9、pET11、pET12、pET14、pET15、pET16、pET17、pET19-pET25等质粒都是优选的。这些质粒可购自Novagen(Madison，Wis.53711)等公司或用常规方法构建。
对于获得的tPA或其衍生物和SˉRRZ基因，可以用常规方法分别导入本领域常用的各种表达载体，分别获得含有tPA或其衍生物的表达载体，以及含有SˉRRZ基因的表达载体。
将含有tPA或其衍生物的表达载体导入大肠杆菌，就获得了生产含有tPA或其衍生物的表达载体的工程菌。
事实上，本领域现有的各种生产tPA或其衍生物的大肠杆菌工程菌(如ATCC 53227等)都可用于本发明。在众多文献和专利中公开了生产tPA或其衍生物的大肠杆菌，例如美国专利H2,055(申请人ZymoGenetics，Inc.，申请号Appl.No.778203，申请日1985年9月20日)，美国专利6,027,888(申请人Boardof Regents，The University ofTexas System，申请号834516，申请日1997年4月4日)，美国专利5,106,741(申请人The Upjohn Company，申请号714365；申请日1991年6月12日)。
将含有S-RRZ基因的表达载体导入生产tPA或其衍生物的大肠杆菌工程菌就获得了本发明的含有第一质粒(表达tPA或其衍生物)和第二质粒(表达SˉRRZ基因)的工程菌。
用本发明工程菌生产tPA或其衍生物的方法与常规方法基本相同，其中发酵、分离纯化等步骤可完全相同。因此，在这些相同步骤完全可以采用本领域的已有的各种条件。本发明的不同点仅在于破碎步骤中增加了用细胞膜渗透诱导剂处理菌体，从而释放出SˉRRz基因表达产物的步骤。
应理解，本发明的技术方案并不受其作用机理的限制。然而为了便于理解，以下给出了本发明技术方案的机理将S基因缺陷的SˉRRz基因导入大肠杆菌中，细胞中只是积累了R和Rz基因的产物，并不能使细胞裂解，这样，在细菌培养期，细菌仍能正常生长。而在细胞破碎时，加入含EDTA等细胞膜渗透诱导剂的缓冲液后，EDTA等与细胞外膜的Ca2+、Mg2+结合，破坏细胞外膜，使R和Rz的产物从细胞质渗透通过细胞膜，到达细胞壁的肽聚糖层，从而裂解细胞壁。再配合使用超声波等常规破碎方法，可使细胞迅速破碎，获得所需的包涵体。
本发明的主要优点在于(a)对大肠杆菌工程菌的生长以及目的蛋白(如组织纤溶酶原激活剂或其衍生物)的表达基本上无影响。
(b)对大肠杆菌工程菌的破碎速度快，效率高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1将λ噬菌体的裂解基因SˉRRz导入TPA衍生物的基因工程菌培养基LB培养基蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/lLB固体培养基蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl 10g/l，琼脂粉2g/l方法TPA衍生物(仅保留有tPA分子K2区及蛋白酶活性区)基因通过PCR的方法从Clontech公司Human Fetal Brain 5.-stretch plus cDNA库(产品号HL50156)中扩增得到。扩增基因插入到T7启动子的表达质粒pET11(US5,643,757)中，转入大肠杆菌BL21(DE3)(US 5,439,808)中，获得表达TPA衍生物工程菌。TPA衍生物基因工程菌为Amp(氨苄青霉素)抗性。
通过EcoRI/ClaI酶切λ噬菌体(cI857，含Sam7突变。购自华美生物工程公司，产品号MD0361)，分离获得裂解基因SˉRRz片段(1466bp)。将得到的裂解基因SˉRRz片段插入到用相同酶切的质粒pWSK129(US 6309817，或Wang，R.F.，andS.R.Kushner.1991.Construction of versatile low-copy-number vectorsfor cloning，sequencing and gene expression in E.coli.Gene 100195-199.)中，获得含有λ噬菌体的裂解基因SˉRRz的(Kan R)质粒pWSK147。pWSK147为含λ噬菌体的裂解基因SˉRRz的质粒，Kan(卡那霉素抗性)。
将TPA衍生物的基因工程菌在含100μg/ml Amp的LB平板上划线，37℃培养过夜，约16小时，挑取单菌落，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃，250rpm，培养过夜，约16小时，取0.5ml接种于50ml含100μg的LB培养基中，37℃，250rpm，培养约2小时，OD600≈0.5取出摇瓶，冰浴中冷却10min，6000rpm离心10min，弃上清，加入12ml 75mM CaCl2(4℃预冷)悬浮菌体，冰浴30min，6000rpm离心10min，弃上清，加入3ml 75mM CaCl2(4℃预冷)悬浮菌体，制得感受态细胞。取200μl感受态细胞，加入1μl pWSK147质粒，冰浴1小时后，置42℃水浴2min加入800μl LB培养基，37℃水浴1小时，取适量涂于含100μg/ml Amp，50μg/ml Kan的LB平板上，37℃培养16～18小时。即得到含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌。
实施例2含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌的生长及目的蛋白表达a.细菌生长分别取20μl-70℃甘油保存的TPA衍生物工程菌和含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基，与3ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃250rpm培养过夜，约16小时，再分别取0.5ml接种于50ml含100μg/ml Amp的LB培养基，与50ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃250rpm培养，每1小时取样测OD600，每个菌株做两个摇瓶，观察它们的生长情况。
结果如图1所示。可见SˉRRz基因的导入，并没有对细菌生长造成明显影响。
b.目的蛋白的表达分别取20μl-70℃甘油保存的TPA衍生物工程菌和含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基，与3ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃250rpm培养过夜，约16小时，再分别取1ml接种于100ml含100μg/ml Amp的LB培养基，与100ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃250rpm培养2小时，加入100μl 1MIPTG，使其终浓度为1mM，诱导4小时，并取样电泳。
结果如图2所示。可见，SˉRRz基因的导入，并没有明显影响目的蛋白的表达。
c.15升发酵罐发酵发酵培养基蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，(NH4)2SO43g/l，NaCl 5g/l，K2HPO4·3H2O 5g/l，pH7.2，计料体积10l，实配体积8l补料培养基(a)补糖培养基200g葡萄糖、1g MgSO4.7H2O溶于400ml水中(b)补氮培养基80g蛋白胨，40g酵母粉溶于400ml水中发酵工艺(TPA衍生物工程菌和含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌的发酵工艺一样，仅菌种的差异)取-70℃保存甘油菌，接种于4瓶100ml LB培养基(TPA衍生物工程菌种子加入100μg/ml Amp，含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌种子加入100μg/ml Amp，50μg/ml Kan)中，37℃250rpm培养12小时后，转接发酵罐(TPA衍生物工程菌接种时加入100μg/ml Amp，含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌接种时加入100μg/ml Amp，50μg/ml Kan)，发酵时以pH-DO控制补糖，以2M NaOH控制pH6.5～7.2，发酵6小时加入400ml补氮培养基，7小时加入10ml 1M IPTG进行诱导，8小时加入200ml补氮培养基，诱导3小时结束。
结果如图3、图4所示。TPA衍生物工程菌和含SˉRRZ基因的TPA衍生物工程菌的目的蛋白的表达基本相同，它们的OD600和湿重分别是37和520g以及38和500g。相同的工艺结果也相似。
实施例3TPA衍生物工程菌和含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌破碎工艺的比较分别取20μl-70℃甘油保存的TPA衍生物工程菌和含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌，接种于含3ml 100μg/ml Amp的LB培养基，与3ml含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃250rpm培养过夜，约16小时，再分别取1.5ml接种于200ml含100μg/ml Amp的LB培养基，与含100μg/mlAmp，50μg/ml Kan的LB培养基中，各5瓶，37℃250rpm培养2小时，加入200μl1M IPTG，使其终浓度为1mM，诱导2小时后，4000rpm离心10min，弃上清，再以40ml水洗一次，6000rpm离心10min，称湿重，分别以15％湿重计，加入适量50mM Tis HCl pH8.0，2mM EDTA缓冲液悬浮菌体，37℃水浴20min后，取10ml超声波破碎，在不同的超声时间取样，测定超声上清液中的蛋白释放量。
实验结果如图5所示。含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌经酶解后，在超声前已有一些蛋白释放出来，经超声后，其蛋白释放达到最大量时间约比TPA衍生物工程菌快30％，同时显著降低了能耗。
此外，重复实施例3的上述步骤，不同点在于改变用细胞膜渗透诱导剂预处理的条件，即用1mM EDTA、5mM EDTA、2mM EGTA替换2mM EDTA，用10min、30min、50min放置时间替换20min放置时间，用pH7.8、pH8.5替换pH8.0。结果表明，其蛋白释放达到最大量时间约比对照快25-40％。
讨论本发明构建的含SˉRRz基因的TPA衍生物工程菌与常规TPA工程菌相比较，在菌体的生长、高密度发酵培养条件控制以及目的重组产物表达等方面与常规TPA工程菌均无差别。与此同时，以超声波破碎的结果显示，本发明构建的S-RRz基因的TPA衍生物工程菌可以被更为有效和便利地破碎。尤其为在大规模的TPA重组蛋白质生产过程中提供了便利。在采用其他细胞破碎方法时也起到相同的作用。本发明的工程菌的应用可以在不改变原有发酵培养工艺和保持产物表达水平的条件下，缩短和降低细胞破碎的时间与强度，简化细胞破碎工艺，提高目的产物的回收。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种对生产组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的大肠杆菌进行破碎的方法，其特征在于，它包括步骤(a)在表达条件下，培养生产组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的大肠杆菌，所述大肠杆菌含有表达组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的第一质粒，和表达λ噬菌体裂解基因S-RRz的第二质粒，其中裂解基因S-RRz与表达调控序列可操作地相连，从而表达出组织纤溶酶原激活剂或其衍生物，以及裂解基因S-RRz的表达产物；(b)收集大肠杆菌菌体；(c)将大肠杆菌菌体悬浮于含0.5-10mM细胞膜渗透诱导剂的水溶液中，在37±3℃下放置10-60分钟，其中所述水溶液pH为7.5-9，且所述的细胞膜渗透诱导剂选自下组EDTA、EGTA或其混合物；(d)用超声波法或高压匀浆法破碎步骤(c)中的菌体，获得破碎产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中在37±2℃下放置10-40分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中在37±2℃下放置10-30分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的细胞膜渗透诱导剂的浓度为1-5mM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的细胞膜渗透诱导剂是EDTA。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的水溶液的pH为7.5-8.5。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的λ噬菌体裂解基因S-RRz是S基因含Sam7突变的λ噬菌体cI857的DNA的EcoRI/ClaI酶切片段，大小为1400-1500bp。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中使用超声波法破碎。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(e)从步骤(d)的破碎产物中分离纯化出组织纤溶酶原激活剂或其衍生物。
10.一种大肠杆菌，它含有表达组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的质粒，其特征在于，它还含有表达λ噬菌体裂解基因S-RRz的质粒，其中裂解基因S-RRz与表达调控序列可操作地相连。
全文摘要
本发明公开了一种对生产组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的大肠杆菌进行破碎的方法，它包括步骤(a)在表达条件下，培养大肠杆菌，所述大肠杆菌含有表达组织纤溶酶原激活剂或其衍生物的第一质粒，和表达λ噬菌体裂解基因S－RRz的第二质粒；(b)收集大肠杆菌菌体；(c)将大肠杆菌菌体悬浮于含0.5－10mM细胞膜渗透诱导剂的水溶液中；(d)用超声波法或高压匀浆法破碎步骤(c)中的菌体，获得破碎产物。本发明方法可快速、高效地破碎大肠杆菌。
文档编号C12N15/33GK1614009SQ200310108420
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月5日 优先权日2003年11月5日
发明者张毅, 褚仲梅, 杨胜利, 陆坚峰, 刘成, 屈贤铭 申请人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司