烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统及其应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统及其应用。优化烟粉虱MED隐种TRP基因序列的sgRNA的靶标位点的合成引物克服脱靶效应，能从核基因水平抑制目的基因表达，从而达到持久稳定的效果，成持久稳定的突变型。
【专利说明】
烟粉虱MED隐种TRP基因的CRI SPR/cas9系统及其应用
技术领域
[00011 本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统 及其应用。
【背景技术】
[0002] 烟粉虱 Bemisia tabaci(Gennadius)属半翅目（Hemiptera)粉虱科 (Aleyrodidae)，小粉虱属Bemisia，属于世界性的入侵害虫。其中烟粉虱MED隐种自2003年 首次在中国云南昆明发现，至今为止，已几乎遍布全国各省，并逐渐取代烟粉虱MEAM1隐种， 成为危害我国农作物的主要烟粉虱隐种。MED隐种对温度具有较强的抵抗力是其能扩散为 全世界重要害虫并在我国逐渐取代其它隐种的关键因素之一，是其入侵并成功扩张的重要 机制之一。MED隐种具有很强的温度耐受能力，使其在炎热的季节能猖獗危害;而在寒冷季 节，逐渐扩大的保护地为其提供了越冬场所，使得其累积大量虫口数以致暴发。昆虫能根据 环境温度的变化而进行体内生理性的适应性调整，其中怎样感知外界温度并将其传递至体 内的温度感知环节起关键作用。
[0003] CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated proteins)系统全名为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛 集关联蛋白系统，是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来 对抗入侵的病毒及外源DNA。其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与 tracrRNA(trans_activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，进而引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具 有引导作用的sgRNA(singleguid e RNA)，以引导Cas9对RNA、DNA和蛋白的定点切割，Cas9能 在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。然 而，CRISPR/Cas9系统存在脱靶效应的问题，限制其从核基因水平抑制目的基因表达的技术 效果，难以达到持久稳定的效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服上述技术问题，提供一种适合烟粉虱MED隐种TRP基因的 CRISPR/cas9系统，进而利用该系统诱导烟粉虱的基因突变，获得稳定的突变型。本发明使 用CRISPR/Cas9系统，从核基因水平抑制目的基因表达，为进一步利用诱导基因突变来实现 害虫的生物防治提供理论基础。
[0005] 根据本发明的烟粉虱MED隐种BtTRP基因的CRISPR/cas9系统，其中，烟粉虱MED隐 种的TRP基因序列的sgRNA的靶标位点，sgRNA靶标位点的合成引物为：引物BtTRP-F : GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
[0006] 引物 sgRNA-R: AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAA CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇
[0007] 根据本发明的【具体实施方式】，本发明的烟粉虱MED隐种CRISPR/Cas9系统构建的方 法包括以下步骤：
[0008] 设计烟粉虱MED隐种BtTRP靶基因的sgRNA;
[0009] (1)使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)和HF缓冲液，在PCR仪中进行体外 合成sgRNA;
[0010] (2)以Cas9质粒（plasmid 42251，Addgene)为模板，使用mMESSAGE mMACHINE 5卩61(;[1:(細13；[011，1]34)在体外合成0&89-1111?熟；
[0011] (3 )使用Femto j et Express (Eppendorf)，femtot ip 11针（Eppendorf)和 InjectMan NI 2显微注射仪，进行靶基因的显微注射；
[0012] (4)将实验分为注射型组和野生型组，其中注射型组为向烟粉虱伪蛹注射靶基因 的实验组，野生型组为不注射任何液体的对照组。
[0013] CRISPR/Cas9系统在BtTRP基因温度耐受性功能验证中的应用，包括高温胁迫处理 统计击倒时间和低温胁迫处理统计恢复时间。试验表明本发明的本发明的烟粉虱MED隐种 BtTRP基因的CRISPR/cas9系统克服了脱靶效应，能从核基因水平抑制目的基因表达，从而 达到持久稳定的效果，成持久稳定的突变型。
【附图说明】
[0014] 图1 CRISPR/Cas9系统在验证烟粉虱MED隐种BtTRP基因耐热性功能中的应用：比 较烟粉虱注射型和野生型耐热性表型值差异，即观察高温胁迫后击倒时间。所有数据均用 SPSS 16.0统计软件进行数据统计分析，显著性检验水平为P〈0.05。
[0015] 图2 CRISPR/Cas9系统在验证烟粉虱MED隐种BtTRP基因耐寒性功能中的应用：比 较烟粉虱注射型和野生型耐寒性表型值差异，即观察低温胁迫后恢复时间。所有数据均用 SPSS 16.0统计软件进行数据统计分析，显著性检验水平为P〈0.05。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1:烟粉虱MED隐种CRISPR/Cas9系统的建立
[0017] 1、sgRNA引物的设计：
[0018]设计烟粉虱MED隐种的TRP基因序列的sgRNA的靶标位点，sgRNA靶标位点的设计需 要克服脱靶效应而反复优化，本发明的系列优化措施包括剔除与靶标序列最后12个碱基或 NGG PAM片段吻合的片段。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0019] 引物BtTRP-F:GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAG AAATAGC；
[0020] 引物 SgRNA-R:AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAA CTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇
[0021] 2、sgRNA 的合成：
[0022] (1)使用Phusion聚合酶（New England Biolabs)和HF缓冲液混合，进行30yL体系 的无模板PCR反应，具体为：HF buffer 3.0yL、sgRNA-R 1.2yL、BtTRP-F 1.2yL、dNTP 0·6μ L、Phusion Polymerase 0.6yL、灭菌ddH2〇 23.4yL〇
[0023] (2)反应条件为：98￡€3〇8;98°(：1〇8,6〇1€3〇8,72°(：158,35个循环 ；72°(：1〇11^11，1〇1€ 00 ο
[0024] (3)PCR扩增结果检测:PCR产物用1%的凝胶电泳检测，并送上海生工生物工程技 术服务有限公司进行测序。
[0025] (4)sgRNA模板的纯化：利用TIANGEN的TIANquick Midi Purification Kit试剂盒 将PCR产物进行纯化。
[0026] (5)sgRNA的合成：以上一步合成的DNA作为模板，用MEGAscript T7Kit试剂盒 (Ambion)进行体外转录过程。
[0027] (6)酚氯仿萃取并用异丙醇沉淀纯化sgRNA，用ddH20稀释到1μg/μL并放于-80°C冰 箱保存备用。
[0028] 3、Cas9mRNA 的合成
[0029] (1)提取质粒（plasmid 42251，Addgene)DNA，利用AXYGEN plasmid miniprep kit 试剂盒进行提取；
[0030] (2)质粒线性化:用PmeI(New England Biolabs)对质粒进行线性化反应；
[0031] (3)乙醇沉淀纯化；
[0032] (4)体外转录合成Cas9mRNA:利用mMESSAGE mMACHINE T7Kit(Ambion)试剂盒进行 转录合成；
[0033] (5)聚腺苷酸化反应；
[0034] 4、显微注射
[0035] (1)注射试剂：在30yL体系中，将0.5yg sgRNA和10yg Cas9mRNA混合（大约摩尔比 为2:1)，溶于3yL 3M的醋酸钠溶液中（pH 5.2)，并用3倍体积的无水乙醇沉淀浓缩(-20°C过 夜沉淀）。12000印111离心30111；[11，加75%的乙醇，12000印1]1离心5111；[11，重复一次，注射前用IlyL 水重悬；
[0036] (2)注射方法:收集烟粉虱MED隐种红眼期伪蛹，排列并粘附在事先贴有透气双面 胶的盖玻片表面上。使用Femtojet Express(Eppendorf)，femtotip II针（Eppendorf)和 InjectMan NI 2显微注射仪，从尾端注射，注射压强为llOOhPa左右，注射时间为0.1 s。
[0037] (3)培育方法:将盖玻片放置在琼脂培养基上，放入人工气候箱中使其完成发育。 温度为26±1°C，相对湿度60-80%，光周期为16L:8D。
[0038] 5、CRISPR/Cas9在BtTRP基因温度耐受性功能验证中的应用
[0039]现有技术已研究表明，TRP基因在烟粉虱MED隐种温度耐热性中起关键作用 [0040] (1)高温胁迫处理统计击倒时间：
[0041] 用吸虫器收集初羽化烟粉虱成虫(<3h)(包括注射型和野生型成虫），放入PCR管，管 口塞已消毒的脱脂棉团，每管1头成虫，分别编号。将装有烟粉虱的PCR管5个一组，同时插入漂 浮板，将漂浮板置于由德国Huber 温度控制器（CC-106A，Germany，Huber K_Sltem:ase!iinenb:aii GmbH)控温的水浴槽内，温度提前设置为恒温45°C，保持液面与脱脂棉团下端齐平，使整个 PCR管腔体都浸没水中。在PCR管置于水浴槽内lmin后，开始计时，观察管内烟粉虱的活动状 态，以烟粉虱失去对身体的控制能力，无法自主站立作为热击倒计时结束的标准，并将这段 时间作为高温击倒时间TKD(heat knockdown time)。
[0042] (2)低温胁迫处理统计恢复时间：
[0043]用吸虫器收集初羽化烟粉虱成虫（<3h)(包括注射型和野生型成虫），放入PCR管， 管口塞已消毒的脱脂棉团，每管1头成虫，分别编号。将装有烟粉虱的PCR管10个一组，同时 插入塑料泡沫制成的漂浮板，将漂浮板置于由德国Huber温度控制器(CC-106A，Germany， HuberKMtemaschinenb.au.GmbH)控温的内置温控腔体内，腔体内温度提前设置丨旦温于-5°C， 保持液面与脱脂棉团下端齐平，使整个PCR管腔体浸没水中，并将低温腔体盖严。在PCR管置 于水浴槽内lOmin后，迅速将其取出，擦干管壁上的水，置于室温26°C环境下，开始计时。观 察管内烟粉虱的活动状态，以烟粉虱逐渐恢复对身体的控制能力，能够自主站立作为冷击 倒恢复计时的标准，将这段时间作为冷致昏恢复时间TRc(chillcoma recovery time)。 [0044] 实验结果如图1、2所示。图1显示CRISPR/Cas9系统在验证烟粉虱MED隐种BtTRP基 因耐热性功能中的应用，比较烟粉虱注射型和野生型耐热性表型值差异，即观察高温胁迫 后击倒时间，注射型的打到时间显著低于野生型，所有数据均用SPSS16.0统计软件进行数 据统计分析，显著性检验水平为P〈〇 . 05。图2显示CRISPR/Cas9系统在验证烟粉虱MED隐种 BtTRP基因耐寒性功能中的应用：比较烟粉虱注射型和野生型耐寒性表型值差异，即观察低 温胁迫后恢复时间，注射型的低温恢复时间显著高于野生型。所有数据均用SPSS 16.0统计 软件进行数据统计分析，显著性检验水平为P〈〇.05。验证了 BtTRP基因在烟粉虱温度耐受性 中起了关键作用，说明本发明的CRISPR/Cas9系统能从核基因水平抑制目的基因表达，从而 达到持久稳定的效果，成持久稳定的突变型。
【主权项】
1. 烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统，其特征在于，烟粉虱MED隐种TRP基因序 列的sgRNA靶标位点的合成引物为： 引物 BtTRP-F: GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGAAAT AGC； 引物 sgRNA-R: AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTG CTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇2. 权利要求1所述烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统在获得烟粉虱MED隐种 TRP基因突变型方面的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106086008SQ201610405985
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月10日
【发明人】吕志创, 王原, 刘万学, 万方浩
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所