一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法
【专利摘要】本发明涉及一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，包括以下步骤：在低氧微环境条件下采用电脉冲对成肌细胞进行处理。所述电脉冲的电压范围为2V/10mm?16V/10mm。所述电脉冲的单次脉冲时长范围为1?24ms。所述电脉冲的频率为0.1?10Hz。所述电脉冲的总时长为：如果进行单次电刺激，总时长为24?48小时；如果进行多次电刺激，每次时长为2?3小时,每天电刺激1?2次，电刺激的天数为2?10天。所述低氧微环境的氧气的体积分数范围为2％?12％。本发明所述的建立方法建立的模型可以更好的模拟运动对在体骨骼肌的影响。
【专利说明】
一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和运动人体科学领域，尤其涉及骨骼肌细胞运动模型的建立 方法。
【背景技术】
[0002] 运动使骨骼肌产生适应，然而骨骼肌细胞对运动适应的分子机制并不清楚。在研 究不同因素对骨骼肌细胞影响的机制时没有一个成熟的细胞模型可以利用，细胞模型易于 得到单一、特殊的组织成分，利于研究细胞运动、细胞器的运动、细胞内的代谢动态、细胞间 的相互作用和细胞与外环境因素间的相互作用等，所以细胞模型已成为生命科学不可或缺 的工具。因此建立骨骼肌细胞运动模型将有助于研究骨骼肌细胞对运动适应的分子机制。
【发明内容】
[0003] 鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法， 通过该方法建立的模型可以很好的模拟骨骼肌细胞对运动适应产生的变化。
[0004] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0005] -种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，包括以下步骤:在低氧微环境条件下采用 电脉冲对成肌细胞进行处理。
[0006] 本发明的有益效果是：
[0007] 发明人在研究中设计并发现，采用低氧微环境和电脉冲联合的方案比单独的低氧 微环境、电脉冲或其他的条件可以更好的模拟骨骼肌细胞的运动，该种方法建立的模型可 以广泛应用于运动人体科学和生物工程领域中。
[0008] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0009] 进一步，所述电脉冲的电压范围为2V/10mm-16V/10mm。
[0010]采用上述进一步方案的有益效果是:采用上述范围的电压有利于施加有效的收缩 电压，如果电压过低，会出现肌管细胞不收缩或收缩幅度微小的问题；如果电压过高，会出 现肌管细胞膜和细胞器受损，细胞脱落死亡的问题。
[0011 ]进一步，所述电脉冲的单次脉冲时长范围为l_24ms。
[0012] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0013] 如果时间过长，容易出现肌管细胞强直收缩，细胞膜和细胞器受损，细胞脱落死亡 的问题;如果时间过短，容易出现肌管细胞不收缩或收缩幅度微小的问题。
[0014] 进一步，所述电脉冲的频率为O.l-lOHz。
[0015] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0016] 如果频率过大或过小都容易出现肌管细胞不收缩问题。
[0017] 进一步，所述电脉冲的总时长为:如果进行单次电刺激，总时长为24-48小时;如果 进行多次电刺激，每次时长为2-3小时，每天电刺激1-2次，电刺激的天数为2-10天。
[0018] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0019] 总时长合适，有利于肌管细胞微结构的组装形成，利于肌管细胞的肌节的形成，利 于肌管细胞的新陈代谢和发育壮大;如果总时长过长，会出现肌管细胞微结构紊乱，肌节受 损问题;如果总时长过短，容易出现肌管细胞肌节形成缓慢，肌管细胞发育迟缓等问题。
[0020] 进一步，所述低氧微环境的氧气的体积分数范围为2%-12%。
[0021 ]采用上述进一步方案的有益效果是：
[0022]如果氧气含量过低，容易出现成肌细胞融合率下降或停止融合，肌管细胞形成发 育缓慢问题;如果氧气含量过高，容易出现与在体骨骼肌实际氧浓度不符合的问题。
[0023]进一步，所述成肌细胞为C2C12细胞。
[0024] 采用上述进一步方案的有益效果是:容易获得，且能够很好的反映骨骼肌细胞对 运动适应产生的变化。
[0025] 进一步，具体操作为：
[0026] 1)选取C2C12细胞进行增殖培养与传代；
[0027] 2)接种增殖培养与传代后的C2C12细胞；
[0028] 3)C2C12细胞诱导分化培养；
[0029] 4)采用在低氧微环境条件下采用电脉冲对步骤3)的诱导分化培养的C2C12细胞进 行处理，电脉冲的条件为：电压选取在2￥/1〇111111-16￥/1〇1]1111，单次脉冲时长在1-241118，频率在 O.l-lOHz，如果进行单次电刺激，总时长为24-48小时;如果进行多次电刺激，每次时长为2-3小时，每天电刺激1-2次，电刺激的天数为2-10天;低氧微环境的条件为:0 2的体积分数为 2%-12%〇
[0030] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0031] 通过上述方法建立的模型，可以准确的反应骨骼肌细胞对运动适应产生的变化， 方便用于生理生化等方面的研究。
[0032] 进一步，电脉冲刺激前更新细胞分化培养的培养基，选择多次电刺激的方案，电脉 冲刺激每天1次，持续4天，最后一次电刺激后3小时收获细胞。
[0033] 采用上述进一步方案的有益效果是：
[0034] 通过上述方法建立的模型，可以更好地体外模拟在体骨骼肌的实际氧浓度变化范 围，排除常用21%氧浓度对细胞的氧化应激，使该模型更接近真实的骨骼肌低氧微环境。
[0035] 进一步，在收获细胞后，将有收缩功能的肌管细胞用于基础研究或临床应用，例 如:进彳丁蛋白质提取和/或RNA提取。
【附图说明】
[0036]图1为2-7天C2C12细胞诱导分化培养图（40 X );
[0037] 图2为2-7天C2C12细胞诱导分化培养图（100 X )。
【具体实施方式】
[0038] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。
[0039] 下面通过一些具体的实施例来进行介绍。
[0040] 实验细胞:C2C12细胞，购自中国医学院科学院基础医学研究所。
[0041]实施例以及对比实施例 [0042] 1、C2C12细胞增殖培养与传代
[0043] 将C2C12细胞以lX105/ml密度接种于100mm的培养皿，每皿6ml的增殖培养基（高 糖DMEM，10%FBS，青霉素100U/ml，链霉素80μg/ml)，于5%C02、37°C培养箱培养。细胞汇合 约80 %时按1:3传代。
[0044] 传代操作，预先37 °C温育增殖培养基、PBS和胰酶，吸弃培养皿中的培养基，用2ml 的roS洗细胞两次，吸弃roS，加入lml的0.25 %胰酶37 °C消化约2min;待细胞收缩变圆并大 部分脱壁后，加 lml的增殖培养基终止消化，吹悬并转移细胞入离心管，1000rpm/min离心 5min，弃上清，加新培养基按1:3传代于100mm的培养皿，每皿6ml培养基。
[0045] 2、接种细胞
[0046]当培养皿中细胞汇合约80 %时，吸弃培养基，用2ml的PBS洗细胞两次，吸弃PBS，加 入lml的0.25 %胰酶37 °C消化2min;待细胞收缩变圆并大部分脱壁后，加 lml的增殖培养基 终止消化，吹悬并转移细胞入离心管，l〇〇〇rpm/min离心5min，弃上清，加新培养基吹悬细胞 并调整细胞浓度至5 X 104/ml; 2ml/孔，铺入6孔板，于5 %C02、37°C培养箱培养，待诱导分化。 [0047] 3、C2C12细胞诱导分化培养
[0048]当6孔板中的细胞汇合约80-90%时，将各孔中的增殖培养基更换为分化培养基 (高糖DMEM，2%HS，青霉素100U/ml，链霉素80μg/ml)，2ml/孔，进行诱导分化培养，期间每隔 24小时更换分化培养基，每日显微镜下观察多核肌管的形成，诱导分化7天后完成C2C12多 核肌管的培养。7天诱导分化过程中用普通盖玻片制备的细胞爬片染色结果见图。
[0049] 4、EPS与低氧方案，同时设置对照组
[0050]低氧培养实验选择10%的氧浓度，对照组为普通C02培养箱(20%02)。电脉冲方案1 (简写为EPS 1):电压14V，单次刺激时长2ms，频率1Hz，电刺激总时间120分钟；电脉冲方案2 (简写为EPS2):电压14V，单次刺激时长2ms，频率2Hz，电刺激总时间120分钟；电脉冲方案3 (简写为EPS3):电压14V，单次刺激时长24ms，频率2Hz，电刺激总时间120分钟。电脉冲方案 见表1A，实验分组见表1B。
[00511 表1A电脉冲方案
[0052]
[0053] 表1B C2C12肌管实验分组
[0054]
[0055]分化成熟的C2C12肌管细胞移入低氧培养箱进行持续4天的培养，并在首日适应12 小时后与常氧组同时开始电脉冲刺激。电脉冲刺激前每孔更换2ml新分化培养基，电刺激完 成后再次更新分化培养基2ml/孔。电刺激每天1次，持续4天。最后一次电刺激后3小时收获 细胞，用于进一步的研究。
[0056] 5、C2C12肌管细胞蛋白质和RNA提取
[0057] 最后一次电脉冲刺激后3小时，6孔板中3孔肌管细胞用预冷的PBS洗2遍，细胞刮刀 刮下细胞并转移至1.5ml的EP管，4°C，12000g离心5分钟，弃上清，-80°C保存，用于蛋白质提 取。
[0058] 6孔板的另3孔肌管细胞用PBS洗2遍，每孔直接加入lml的Trizol，室温静置5分钟， 转移裂解液入1.5ml的EP管，提取总RNA。
[0059]下面分别检测低氧微环境下EPS对C2C12肌管MyHC和糖脂代谢调节蛋白mRNA表达 的影响。
[0060] 一、检测过程中涉及的实验仪器与试剂如下。
[0061] 主要实验仪器：
[0062]
[0063]~主要试剂: '
'
[0064] (1)蛋白质提取、定量试剂
[0065] -步法动物组织活性蛋白提取试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；
[0066] Pierce BCA Protein Assay Kit购自Thermo Scientific;
[0067] (2)ELISA 试剂盒
[0068] PPAR γ Cla检测试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司；
[0069] 肌球蛋白重链7(MYH7)检测试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司；
[0070] 肌球蛋白重链2(MYH2)检测试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司；
[0071] 肌球蛋白重链4(MYH4)检测试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司；
[0072] 肌球蛋白重链1 (MYH1)检测试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司；
[0073] (3)RT_PCR 试剂
[0074] Trizol购自 Invitrogen公司；
[0075] RNase-Free Dnase购自美国Promega公司；
[0076] GoScript Reverse Transcription System(反转录试剂盒）购自美国Promega公 司；
[0077] GoTaq qPCR Master Mix(实时定量试剂盒)购自美国Promega公司；
[0078] 丙酮、异丙醇和无水乙醇(分析纯)均购自国药集团化学试剂北京有限公司。
[0079] 二、实验方法
[0080] UC2C12肌管细胞蛋白质提取
[0081] (1)取出冻存的细胞置于冰上，按照每100μ1紧实细胞体积加入lml提取试剂(每毫 升提取试剂中加入ΙμL的蛋白酶抑制剂ΙμL的DTT和ι〇μL的PMSF)，用枪头反复吹吸细胞沉 淀，8-10次，以充分悬浮细胞。
[0082] (2)旋涡剧烈震荡lmin，放置冰上15min。期间取出震荡2-3次，每次30秒。
[0083] (3)4°C离心，14000g，15min，将上清分装至预冷离心管中，-20°C保存备用。
[0084] 2、C2C12肌管细胞总蛋白含量测定
[0085] 蛋白含量测定采用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量分析试剂盒，依照表2 制作蛋白浓度标准曲线，待测样品5倍稀释(5μ1待测样品+20μ1冷PBS)，BCA工作液(按50:1 混合BCA试剂Α和试剂幻。96孔板，标准曲线各点和样品均做复孔检测，每孔上样量10yl，BCA 工作液200μ1，混匀后37°C避光温育1小时，562nm读取0D值并计算样本蛋白浓度。
[0086]表2不同浓度蛋白标准品的配置
[0087]
[0088] 3、ELISA测定蛋白PGC-Ια，MyHC_I，MyHC_IIa，MyHC_IIb，MyHC_IIx
[0089] (1)使用前将所有的试剂和标本缓慢复温至室温(20°C)，试剂不能直接在37°C溶 解，加湿器提高室内湿度> 60 %。
[0090] (2)配制标准品。每瓶标准品（冻干粉)加入相应稀释液lml，室温混匀约10分钟，其 为最高浓度原液。准备7个EP管，将标准品原液依次倍比稀释成相应浓度。临用前15分钟内 配制。
[0091] (3)待测样本准备。冻存蛋白上清液置于4°C解冻，4°C低温高速12000g离心10分 钟，并对上清液依据预实验的结果进行稀释，置于冰上。
[0092] (4)加样:分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔8孔，依次加入100μ1不同 浓度的标准品。空白孔加 ?ΟΟμΙ稀释液，余孔加待测样品?ΟΟμΙ，加样时间控制在10分钟内。 酶标板加贴覆膜，混匀置于湿盒37°C温育2小时。
[0093] (5)弃去孔中液体，滤纸上拍干（不用洗涤），每孔立即加检测溶液A工作液100μ1 (临用前配制），酶标板加贴覆膜，置于湿盒37°C温育1小时。
[0094] (6)弃去孔内液体，每孔用350μ1的洗涤液洗涤，浸泡1 -2分钟，甩掉酶标板内的液 体，滤纸上轻拍将孔内液体拍干，重复洗板3次。最后一次洗涤后，把孔内的洗液完全甩干。 每孔立即加检测溶液Β工作液100μΙ(临用前配制），酶标板加贴覆膜，置于湿盒37°C温育0.5 小时。
[0095] (7)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同上。
[0096] (8)每孔加底物(TMB)溶液90μ1，酶标板加上覆膜，37 °C避光显色(反应时间控制在 15分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。
[0097] (9)每孔加终止溶液100μΙ，终止反应，此时蓝色立转黄色。酶标板晃动混匀，在确 保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的0D值。
[0098] (10)根据标准曲线计算样本中目标蛋白的浓度。
[0099]但所用方法未能检测出C2C12肌管细胞MyHC-IIb的含量。
[0100] 4丄2(：12肌管细胞总1?熟的提取
[0101] 6孔板中3孔肌管细胞用PBS洗2遍，每孔直接加入lml的Trizol，室温静置5分钟，转 移裂解液入1.5mlEP管。
[0102] (l)lml的玻璃匀浆器（180°C烤3个小时），加入lml的Trizol后立刻放入小鼠肌肉 组织(约40mg)，室温研磨30-50次；
[0103] (2)将上述组织的Trizol裂解液转入1.5ml EP管中，室温放置5分钟；
[0104] (3)在EP管中加入0.2ml氯仿，盖好EP管盖子，用手猛烈震荡15秒，室温下静置2分 钟后，4°C，12000g离心15分钟；
[0105] (4)小心移取上层水相置于新EP管中，加入500μ1异丙醇，在室温放置10钟，4°C， 12000g离心10分钟；
[0106] (5)弃上清，加入lml的75%乙醇洗涤，涡旋混合，4°C，7500g离心5分钟；
[0107] (6)弃上清，让沉淀的RNA在超净工作台内室温下自然干燥。
[0108] (7)用Rnase-free water溶解RNA沉淀。
[0109] 5、C2C12肌管细胞总RNA浓度的测定与纯化
[0110] (1)使用紫外分光光度计测定RNA浓度及A260/A280比值，其比值均在1.9-2.0之 间，RNA浓度=A260 X稀释倍数X 0.04yg/yl。
[0111] (2)取5ygRNA用Promega的DNA酶（RQIRNas-Free DNase)消化可能含有的DNA后用 于逆转录（DNA消化体系见表3)。消化程序：37°C30min后立即加入ΙμL的RQIRNase Stop Solution 并 65°C 10min 灭活 DNase。
[0112] 表3DNA消化体系
[0113]
[0114] 6、逆转录
[0115]使用GoScript?Reverse Transcriptase(Promega)，按照要求将纯化后的总RNA进 行如下逆转录的操作：
[0116] (1)将各试剂置于冰上溶化后离心备用。
[0117] (2)将试剂按表4加入EP管（总体积10μ1)，完成模板RNA与引物的混合，置于PCR仪 进行70°C、5min预变性，完成后置于冰上。
[0118] 表4RNA与引物混合体系
[0119]
[0120] (3)按表5配制RT-MiX，向每个样品管加入10μ 1，混匀。
[0121] 表5 RT-Mix体系
[0122]
[0123] (4)共20μ1的反应体系进行如下反转录程序，25°C退火5分钟，42°C延伸60分钟，70 °C逆转录酶失活15分钟，程序完成后的cDNA-20°C保存。
[0124] 7、实时定量
[0125] 使用PromegaG〇Taq?qPCR Master Mix试剂盒。按试剂盒说明书要求配制20μ1的 反应体系(表6)。每个样本做3个复孔。引物序列见下面的序列表。
[0126]
[0127]
[0128] 反应程序:95°C预变性1〇!1^11;95°(：158,6〇1€6〇8的？0?反应设置40个循环 ；之后熔 解曲线程序95°(：158,60°(：158,95°(：158。分析荧光信号，绘制扩增曲线和熔解曲线。定量方 法用2-^ et表示基因的表达量。计算公式AACt=[Ct(实验组目的基因）一Ct(GATOH)] - [Ct(对照组目的基因）一Ct(GAPDH)]。
[0129] 表6 qPCR反应体系
[0130]
[0131 ]计算方法:基因表达使用比较CT法相对定量，
[0132] 目的基因的表达量=2一(CT target-CT GAPDH)。
[0133] 三、数据统计方法
[0134] 数据以平均数土标准差（? ± SD)记录，用SPSS19.0统计软件进行处理。数据先 进行正态分布检验，符合正态分布采用多因素方差分析，若有显著性，用Bonferroni (方差 具有齐性)或Games-Howell(方差不具齐性)进行组间多重比较，显著水平取P〈0.05。
[0135] 四、实验结果
[0136] 1、电脉冲与低氧诱发C2C12肌管细胞PGC-la变化
[0137] 多因素方差分析表明（表7):低氧对C2C12肌管细胞PGC-la蛋白含量有显著影响(F =1785.864，？ = 0.000)$?5对02(：12肌管细胞？6(：-1€[蛋白含量有显著影响$ = 731.944，？ = 0.000);低氧与EPS之间交互作用显著$ = 85.110，？ = 0.000)。组间多重比较表明：低氧 各组PGC-lα蛋白含量均高于对应的常氧组(P〈0.01);EPS-2HZ组PGC-lα蛋白含量高于EPS-1Hz组和对照组(P〈0.01)，EPS-lHz组与对照组PGC-la蛋白含量无显著差异。
[0138] 表7 C2C12肌管细胞PGC-la蛋白含量(单位pg/mg)
[0139]
[0140] 注:常氧组间2Hz组与对照组比较：??〈0.05，???〈0.01;
[0141] 常氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:★?〈0 · 05，★★?〈0 · 01;
[0142] 低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0143] 低氧组间 2Hz组与 1Hz组比较:☆?〈0 · 05，☆☆?〈0 · 01;
[0144] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0145] 2、电脉冲及低氧诱发C2C12肌管细胞PGC-1_RNA表达变化
[0146] 多因素方差分析表明（表8):低氧对C2C12肌管细胞PGC-1_RNA表达有显著影响(F =105·760，P = 0·000) ;EPS对C2C12肌管细胞PGC-lamRNA表达有显著影响(F= 10·698，P = 0.002);低氧与EPS之间交互作用显著(F = 8.579，P = 0.005)。组间多重比较表明：① LC和 LE1组PGC-lamRNA表达分别低于HC和HE1组(？〈0.01)，1^2与冊2组?601_8祖表达无显著差 异；②低氧组中，LE2组PGC-lamRNA表达高于LE1和LC组(？〈0.01)，1^1与1^：组?6(：-1_8祖表 达无显著差异。
[0147] 表8 C2C12肌管细胞PGC-lamRNA表达量(单位X10一5)
[0148]
[0149] 注:低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0.05，<Χ>Ρ〈0.01;
[0150] 低氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:☆?〈0 · 05，☆☆?〈0 · 01;
[0151] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0152] 3、电脉冲与低氧诱发C2C12肌管细胞MyHC变化
[0153] (1)电脉冲与低氧诱发C2C12肌管细胞MyHC-I蛋白的变化
[0154]多因素方差分析表明（表9):低氧对C2C12肌管细胞MyHC-I蛋白含量有显著影响(F =39.615，？ = 0.000)$?3对02(：12肌管细胞1^!1(：-1蛋白含量有显著影响$ = 38.249，？= 0.000);低氧与EPS之间交互作用显著(F = 4.648，P = 0.032)。组间多重比较表明：① LC组 MyHC-I蛋白含量低于HC组(P〈0 · 01);②常氧组中，HE 1和HE2组MyHC-I蛋白含量低于HC组(P〈 0.01);③低氧组中，LE2组MyHC-I蛋白含量低于LC组(P〈0.05)，LE1组MyHC-I蛋白含量比LC 组有下降趋势但差异无显著性。
[0155] 表9 C2C12肌管细胞MyHC-I蛋白含量(单位pg/mg)
[0156]
[0157] 注:常氧组间2Hz组与对照组比较：??〈0· 05，???〈0· 01;
[0158] 常氧组间1Hz组与对照组比较:▲?〈0 · 05，▲▲?〈0 · 01;
[0159] 低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0160] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0161] (2)电脉冲与低氧诱发C2C12肌管细胞MyHC-IIa蛋白的变化
[0162] 多因素方差分析表明（表10):低氧对C2C12肌管细胞MyHC-IIa蛋白含量有显著影 响0 = 54.843沖=〇.〇〇〇)$?3对〇2(：12肌管细胞1^!1(：-113蛋白含量有显著影响（卩= 35.721，P = 0 ·000);低氧与 EPS 之间交互作用显著(F = 9.228，Ρ = 0· 004)。
[0163] 组间多重比较表明：① LE1和LE2组MyHC-IIa蛋白含量低于对应的ΗΕ1和ΗΕ2组(Ρ〈 0.05或Ρ〈0.01);②常氧组中，ΗΕ1和ΗΕ2组MyHC-IIa蛋白含量高于HC组(Ρ〈0.01);③低氧组 中，LE1和LE2组MyHC-IIa蛋白含量也高于LC组，但只有LE2组MyHC-IIa蛋白含量增加有显著 性(P〈0.05)。
[0164] 表10 C2C12肌管细胞MyHC-IIa蛋白含量(单位pg/mg)
[0165]
[0166] 注:常氧组间2Hz组与对照组比较：??〈0· 05，???〈0· 01;
[0167] 常氧组间1Hz组与对照组比较:▲?〈0 · 05，▲▲?〈0 · 01;
[0168] 低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0169] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0170] (3)电脉冲与低氧诱发C2C12肌管细胞MyHC-IIx蛋白的变化
[0171]多因素方差分析表明（表11):低氧对C2C12肌管细胞MyHC-IIx蛋白含量有显著影 响（F= 1094.679，P = 0 ·000);EPS对C2C12肌管细胞MyHC-IIx蛋白含量有显著影响（F = 52.368，P = 0 ·000);低氧与 EPS 之间交互作用显著(F= 136.02，Ρ = 0· 000)。
[0172] 组间多重比较表明：①低氧各组MyHC-IIx蛋白含量均低于对应的常氧组（P〈 0.01);②常氧组中，HE1和HE2组MyHC-IIx蛋白含量低于HC(P〈0.01);③低氧组中，LE1和LE2 组MyHC-IIx蛋白含量高于LC组(P〈0.05或P〈0.01)。
[0173] 表11 C2C12肌管细胞MyHC-IIx蛋白含量(单位pg/mg)
[0174]
[0175] 注:常氧组间2Hz组与对照组比较：??〈0.05，???〈0.01;
[0176] 常氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:★?〈0 · 05，★★?〈0 · 01;
[0177] 常氧组间1Hz组与对照组比较:▲?〈0 · 05，▲▲?〈0 · 01;
[0178] 低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0179] 低氧组间1Hz组与对照组比较:ΛΡ〈0 · 05，ΛΛΡ〈0 · 01;
[0180] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#Ρ〈0 · 05，##Ρ〈0 · 01。
[0181 ] 4、电脉冲与低氧诱发C2C12肌管糖脂代谢蛋白mRNA表达变化
[0182] (1)C2C12肌管细胞脂代谢调节蛋白MCAD mRNA表达变化
[0183] 多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞MCAD mRNA表达有显著影响（F = 34.667，P = 0.000)，EPS对C2C12肌管细胞MCAD mRNA表达有显著影响（F = 21.930，P = 0. 〇〇〇)，低氧与EPS之间交互作用显著(F= 14.224，P = 0.001)。组间多重比较表明：① LE1和 LE2组肌管细胞MCAD mRNA表达低于对应的HE1和HE2组(P〈0.05或P〈0.01);LC与HE组无显著 性差异;②HE1组肌管细胞MCAD mRNA表达高于HE2和HC组(P〈0.01)，③LE2组肌管细胞MCAD mRNA表达低于LC组(P〈0.01)(表12)。
[0184] 表12 C2C12肌管细胞MCAD mRNA表达量(单位X 10一2)
[0185]
[0186] 注:常氧组间2Hz 组与 1Hz 组比较:★?〈0· 05，★★?〈0· 01;
[0187] 常氧组间1Hz组与对照组比较：▲?〈0 · 05，▲▲?〈0 · 01;
[0188] 低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0189] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0190] (2)C2C12肌管细胞脂代谢调节蛋白CPTIB mRNA表达变化
[0191] 多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞CPTIB mRNA表达有显著影响（F = 7.328，P = 0.019)，EPS对C2C12肌管细胞CPT1B mRNA表达有显著影响（F = 34.406，P = Ο ·〇〇〇)，低氧与EPS之间交互作用显著(F = 33.461，Ρ = 0· 000)。（表13)
[0192] 组间多重比较表明：① LC和LE1组肌管细胞CPT1B mRNA表达低于对应HC和ΗΕ1组(Ρ 〈0 · 05或P〈0 · 01)，但LE2组CPT1B mRNA表达却高于HE2组(P〈0 · 01)。②LE2组肌管细胞CPT1B mRNA表达高于LE1和LC组(P〈0.01)，LE1组CPT1B mRNA表达与LC组无显著差异(P>0.05)。
[0193] 表13 C2C12肌管细胞CPT1B mRNA表达量(单位X10一4)
[0194]
[0195] 注:低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0196] 低氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:☆?〈0 · 05，☆☆?〈0 · 01;
[0197] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0198] (3)C2C12肌管细胞糖代谢调节蛋白GLUTlmRNA表达变化
[0199] 多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞GLUTlmRNA表达有显著影响（F = 167·598，Ρ = 0·000)，EPS对C2C12肌管细胞GLUTlmRNA表达有显著影响（F = 56.817，P = 0 ·〇〇〇)，低氧与EPS之间交互作用显著(F = 8.057，Ρ = 0· 006)。（表14)
[0200] 组间多重比较表明：①低氧各组肌管细胞GLUTlmRNA表达低于对应常氧组(Ρ〈0.05 或Ρ〈0.01);②EPS2组肌管细胞GLUTlmRNA表达高于对照组（Ρ〈0.01)，EPS1组肌管细胞 GLUTlmRNA表达与对照组无显著差异(P>0.05)，③LE2组肌管细胞GLUTlmRNA表达高于LE1组 (P<0.01)〇
[0201] 表14 C2C12肌管细胞GLUTlmRNA表达水平(单位ΧΙΟ-2)
[0202]
[0203] 注:常氧组间2Hz组与对照组比较：??〈0· 05，???〈0· 01;
[0204] 低氧组间2Hz组与对照组比较:〇Ρ〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0205] 低氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较：☆?〈0 · 05，☆☆?〈0 · 01;
[0206] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0207] (4) C2C12肌管细胞糖代谢调节蛋白GLUT4mRNA表达变化
[0208]多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞GLUT4mRNA表达有显著影响（F = 165.928，P = 0.000);EPS对C2C12肌管细胞GLUT4mRNA表达有显著影响（F = 98.827，P = Ο ·000);低氧与EPS之间交互作用不显著(F = 2.232，Ρ = 0· 150)。（表15)
[0209] 组间多重比较表明：低氧各组肌管细胞GLUT4mRNA表达低于常氧相应组(Ρ〈0.01); EPS2组肌管细胞GLUT4mRNA表达低于EPS1和对照组（卩〈0.01);册1组肌管细胞607141111?祖表 达低于HC组(P〈0.01)。
[0210] 表15肌管细胞GLUT4mRNA表达水平(单位X 10-4)
[0211]
[0212] 注:常氧组间2Hz组与对照组比较：??〈0.05，???〈0.01;
[0213] 常氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:★?〈0 · 05，★★?〈0 · 01;
[0214] 常氧组间1Hz组与对照组比较：▲?〈0 · 05，▲▲?〈0 · 01;
[0215] 低氧组间2Hz组与对照组比较:〇P〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0216] 低氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:☆?〈0 · 05，☆☆?〈0 · 01;
[0217] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0218] (5)C2C12肌管细胞糖代谢调节蛋白PDH mRNA表达变化
[0219] 多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞PDH mRNA表达有显著影响（F = 79·723，Ρ = 0·000) ;EPS对C2C12肌管细胞GLUT4mRNA表达没有显著影响（F = 3.241，P = 0.075);低氧与EPS之间交互作用不显著(F= 1.902，Ρ = 0· 192)。（表16)
[0220] 组间多重比较表明：低氧各组roH mRNA表达低于常氧相应组(Ρ〈0.01)。
[0221] 表16 C2C12肌管细胞PDH mRNA表达量(单位ΧΙΟ-2)
[0222]
[0223] 注:对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#Ρ〈0 · 05，##Ρ〈0 · 01
[0224] (6)C2C12肌管细胞糖代谢调节蛋白GYSlmRNA表达变化
[0225] 多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞GYSlmRNA表达有显著影响（F = 72·742，Ρ = 0·000)，EPS对C2C12肌管细胞GYSlmRNA表达有显著影响（F=15.090，P = 0·001)，低氧与EPS之间交互作用显著(F = 20·975，P = 0·000)。（表17)
[0226] 组间多重比较表明：① LE1和LC组肌管细胞GYSlmRNA表达低于相应HE1和HC组(P〈 0.01 )，LE2组肌管细胞GYSlmRNA表达与常氧HC2组无显著差异。②LE2组肌管细胞GYSlmRNA 表达高于LE1和LC组（P〈0.05或P〈0.01)，但LE1组肌管细胞GYSlmRNA表达低于LC组（P〈 0·05)〇
[0227] 表17 C2C12肌管细胞GYSlmRNA表达量(单位X10一2)
[0228]
[0229] 注:低氧组间2Hz组与对照组比较:〇Ρ〈0 · 05，<Χ>Ρ〈0 · 01;
[0230] 低氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:☆?〈0 · 05，☆☆?〈0 · 01;
[0231 ] 低氧组间1Hz组与对照组比较:ΛΡ〈0 · 05，ΛΛΡ〈0 · 01;
[0232] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#Ρ〈0 · 05，##Ρ〈0 · 01。
[0233] (7)C2C12肌管细胞糖代谢调节蛋白HK2mRNA表达变化
[0234] 多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞HK2mRNA表达有显著影响（F = 46 · 807，P = 0 · 000);EPS对C2C12肌管细胞HK2mRNA表达有显著影响(F = 31 · 642，P = 0 · 000); 低氧与EPS之间交互作用不显著$ = 2.618，？ = 0.114)。（表18)
[0235] 组间多重比较表明：① HE1组肌管细胞HK2mRNA表达低于HC组(P〈0.01);②LE2组肌 管细胞HK2mRNA表达高于LE1组(P〈0.05)，LE1组表达与LC组无显著差异;③EPS2组该基因表 达高于EPS1 组(Ρ〈0·05或Ρ〈0·01)。
[0236] 表18 C2C12肌管细胞HK2mRNA表达量(单位Χ10一2)
[0237]
[0238] 注:常氧组间1Hz组与对照组比较：▲?〈0· 05，▲▲?〈0· 01;
[0239] 常氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较:★?〈0 · 05，★★?〈0 · 01;
[0240] 低氧组间 2Hz 组与 1Hz 组比较：☆?〈0 · 05，☆☆?〈0 · 01;
[0241] 对照组间、1Hz组间和2Hz组间比较:#P〈0 · 05，##P〈0 · 01。
[0242] (8)C2C12肌管细胞糖代谢调节蛋白LDH mRNA表达变化
[0243] 多因素方差分析表明：低氧对C2C12肌管细胞LDH mRNA表达没有显著影响（F = 1.489沖=〇.246)』？5对〇2(：12肌管细胞1^!11111?财表达没有显著影响0 = 〇.77〇，？= 0·485)。低氧与EPS之间交互作用显著(F = 6·646，P = 0·011)，
[0244] 单因素方差分析未见组间有显著差异。（表19)
[0245] 表19 C2C12肌管细胞LDH mRNA表达量
[0246]
[0247] 5、分析讨论
[0248] (1)电脉冲与低氧对C2C12肌管细胞PGC-la的影响
[0249]之前的大量研究支持PGC-la是研究运动对骨骼肌影响的重要标志物，运动训练使 骨骼肌细胞PGC-la蛋白含量升高，并随运动负荷增加而升高。本研究结果表明：首先，低氧 微环境可使C2C12肌管细胞PGC-la蛋白含量增加，但此时的PGC-1_RNA表达下调。其次，在 常氧或低氧微环境下EPS2方案均可使C2C12肌管细胞PGC-la蛋白含量大幅增加，证明EPS2 方案可以有效诱发C2C12肌管细胞产生收缩。还有，在常氧或低氧微环境下EPS1方案刺激肌 管细胞4天后，未见C2C12肌管细胞PGC-la蛋白含量及其mRNA表达发生显著变化；但比较 EPS1组和EPS2组的肌管细胞MyHC-I和Ila型含量变化趋势和幅度非常接近，只是MyHC-IIx 型的变化趋势相反；同时，考虑到小鼠有氧运动训练第6周末时骨骼肌细胞PGC-la蛋白含量 和基因表达也未发生变化;本研究认为EPS1方案可以诱发C2C12肌管有效收缩。两套电脉冲 方案对C2C12肌管细胞PGC-la影响差异的具体机制需进一步研究。总之，低氧微环境下EPS2 诱发C2C12肌管细胞收缩可以有效模拟运动对在体骨骼肌PGC-la的影响。
[0250] (2)电脉冲与低氧对C2C12肌管细胞肌纤维类型的影响
[0251] 肌球蛋白重链(MyHC)已成为划分肌纤维类型和研究骨骼肌适应性的标志物：1型 (慢缩-氧化型）、IIa(快缩-氧化型）、IIx(快缩-糖酵解型）和lib(快缩-糖酵解型）。本研究 结果表明：首先，低氧组较常氧组组C2C12肌管细胞的MyHC-Ι，MyHC-IIx肌球蛋白重链含量 显著降低，MyHC-IIa有下降趋势，证明生理性低氧微环境（10%02)抑制了 C2C12肌管细胞的 增殖。其次，低氧微环境下EPS2使C2C12肌管细胞MyHC-I型肌球蛋白重链含量降低，MyHC-Ila型肌球蛋白重链含量升高，MyHC-IIx型肌球蛋白重链含量升高，即EPS2诱发C2C12肌管 收缩使其由慢肌纤维（I型）向快肌纤维（IIx、IIa)转化;EPS1对C2C12肌管细胞肌球蛋白重 链含量的影响与EPS2有相同的趋势。还有，常氧微环境下EPS使C2C12肌管细胞MyHC-I型肌 球蛋白重链含量降低，MyHC-IIa型肌球蛋白重链含量大幅升高，但MyHC-IIx型肌球蛋白重 链含量降低，即EPS诱发C2C12肌管收缩使其由I、IIx型肌纤维向快肌纤维（Ila)转化。最新 研究发现，用基因芯片研究抗阻训练对人体骨骼肌的影响时，一次大强度的抗阻训练所引 发的661个表达差异基因中大部分来自快肌纤维(MHC Ila)，且年轻人的骨骼肌变化比老年 人敏感。综上所述，发明人发现采用EPS方案诱发C2C12肌管收缩而引起的肌球蛋白重链变 化趋势与大强度的抗阻训练对在体骨骼肌的影响更接近。
[0252] (3)电脉冲与低氧对C2C12肌管细胞糖脂代谢蛋白mRNA表达的影响
[0253] CPT1B和MCAD是研究骨骼肌脂酸氧化代谢的重要酶，CPT1B是骨骼肌中催化长链脂 肪酸进入线粒体进行β氧化的关键酶，MCAD是骨骼肌中催化中链脂肪酸进入线粒体进行β氧 化的限速酶。可以作为反映肌肉对耐力运动训练的适应机制的指标之一。本研究结果表明： 首先，低氧组较常氧组C2C12肌管细胞GLUT1和GLUT4mRNA表达下调，结果提示低氧抑制了 C2C12肌管细胞的葡萄糖胞内转运。其次，在常氧或低氧微环境下，EPS2方案使C2C12肌管细 胞GLUTlmRNA表达上调，GLUT4mRNA表达下调；EPS1方案只下调了GLUT4mRNA表达，且下调幅 度小于EPS2方案。结果提示电脉冲诱发C2C12肌管细胞收缩时，其葡萄糖摄取可能主要依靠 GLUT1的增加。
[0254] 本研究还发现，低氧组较常氧组CPT1B、PDH、GYS1和HK2均显著降低，结果提示低氧 微环境抑制了 C2C12肌管细胞的糖脂代谢。还有，常氧微环境下，EPS2方案对C2C12肌管细胞 的MCAD、CPTlB、roH、GYSl和HK2的mRNA表达未产生显著影响，结果提示常氧微环境下EPS2方 案对C2C12肌管细胞的糖脂代谢未产生显著影响。常氧微环境下，EPS1方案使C2C12肌管细 胞MCAD mRNA的表达增加，同时HK2mRNA表达下降。结果提示常氧条件下EPS1方案使肌管细 胞线粒体氧化利用中链脂肪酸加强，葡萄糖利用减少。
[0255] 低氧微环境下，EPS2方案使C2C12肌管细胞MCAD mRNA的表达下调的同时上调了 CPT1B和GYS1的mRNA的表达，PDH mRNA表达未发生显著变化;结果提示低氧微环境下EPS2方 案使C2C12肌管细胞线粒体氧化利用长链脂肪酸加强，糖原合成加强。而EPS1方案使C2C12 肌管细胞GYSlmRNA表达下调，PDH mRNA表达未发生显著变化，结果提示低氧微环境下EPS1 方案使C2C12肌管细胞糖原合成减弱。
[0256] 综上可以推断，在低氧微环境下，EPS2诱发的收缩可以消耗C2C12肌管细胞更多的 肌糖原，肌糖原下降的同时激活了肌管的糖原合成；而EPS1刺激时，C2C12肌管将更多利用 脂肪酸氧化供能。总之，本研究结果提示:EPS方案中脉冲频率由1Hz增加到2Hz，C2C12肌管 细胞利用脂肪酸氧化供能减少，利用糖氧化供能增加。
[0257] 本研究中LDH mRNA的表达未发生显著变化，这提示在常氧还是常氧条件下EPS诱 发C2C12肌管收缩是以葡萄糖和脂肪酸的有氧氧化功能为主，并未激活糖酵解功能系统。
[0258] C2C12肌管细胞与骨骼肌细胞葡萄糖和脂肪酸代谢相关8个蛋白的mRNA表达一致 情况:①常氧+EPS1组C2C12肌管细胞的GLUT1和LDH的mRNA变化与运动训练小鼠骨骼肌变化 一致，比例为2/8。②常氧+EPS2组C2C12肌管细胞的MCAD、HK2和LDH的mRNA变化与运动训练 小鼠骨骼肌变化一致，比例为3/8。③低氧+EPS1组C2C12肌管细胞的MCAD、GLUT1、GYS1和LDH 的mRNA变化与运动训练小鼠骨骼肌第4周末变化一致，比例为4/8。④低氧+EPS2组C2C12肌 管细胞的CPT1B、GYS1、HK2和LDH的mRNA变化与运动训练小鼠骨骼肌第5周末变化一致，比例 为4/8。这一结果表明，在低氧条件下EPS诱发C2C12肌管细胞收缩比在常氧条件下能更好的 模拟有氧运动训练对大鼠骨骼肌葡萄糖和脂肪酸代谢的影响。
[0259] 综上所述，常氧或低氧微环境下，EPS诱发肌管收缩均是以糖和脂肪酸的有氧氧化 供能为主。所以，EPS能较好的模拟有氧运动对在体骨骼肌糖脂代谢的影响。
[0260]发明人在前期的研究中发现有氧运动训练使小鼠骨骼肌中PGC-la蛋白大幅增加。 在本发明中，EPS2在常氧(体积分数为20%的02)和低氧微环境下(体积分数为10%的02)均 能有效诱发C2C12肌管中PGC-la蛋白显著增加;所以EPS2联合低氧微环境诱发C2C12肌管收 缩较单独应用EPS能更好的模拟运动对在体骨骼肌的影响。
[0261]本发明中EPS方案中脉冲频率由1Hz增加到2Hz，则C2C12肌管利用脂肪酸氧化供能 减少，利用糖氧化供能增加，所以频率变化对C2C12肌管的糖脂代谢产生影响;但EPS方案中 脉冲频率由1Hz增加到2Hz，对C2C12肌管肌球蛋白重链含量没有显著影响。低氧抑制了 C2C12肌管细胞增殖。
[0262] 发明人又进一步调整了电脉冲和低氧环境的参数，具体参数举例如下：
[0263]
[0264] 方案四在方案一的基础上采用了多次电刺激，每次时长为2小时，每天电刺激1次， 电刺激的天数为10天，其余均与方案一相同。
[0265] 方案五在方案一的基础上采用了多次电刺激，每次时长为3小时，每天电刺激2次， 电刺激的天数为2天，其余均与方案一相同。
[0266] 方案六在方案一的基础上采用了多次电刺激，每次时长为2.5小时，每天电刺激1 次，电刺激的天数为6天，其余均与方案一相同。
[0267 ]上述方案也能够得到与上述相类似的结论。
[0268] 采用电脉冲与低氧环境联合的条件建立的模型可以很好的模拟骨骼肌细胞的运 动，利于研究肌细胞细胞与外环境的相互作用、肌细胞间的相互作用、肌细胞的代谢过程及 信号传导系统等，重要的是可以依据实际需要制备具有一定快、慢肌纤维比例和代谢特点 的可收缩肌管细胞用于临床骨骼肌疾病的治疗。
[0269] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤:在低氧微环境条 件下采用电脉冲对成肌细胞进行处理。2. 根据权利要求1所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，所述电脉冲 的电压范围为2V/10mm-16V/10mm。3. 根据权利要求1所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，所述电脉冲 的单次脉冲时长范围为l-24ms。4. 根据权利要求1所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，所述电脉冲 的频率为O.l-lOHz。5. 根据权利要求1所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，所述电脉冲 的总时长为:如果进行单次电刺激，总时长为24-48小时;如果进行多次电刺激，每次时长为 2-3小时，每天电刺激1-2次，电刺激的天数为2-10天。6. 根据权利要求1-5任一项所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，所 述低氧微环境的氧气的体积分数范围为2%-12%。7. 根据权利要求1-5任一项所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，所 述成肌细胞为C2C12细胞。8. 根据权利要求1所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，具体操作 为： 1) 选取C2C12细胞进行增殖培养与传代； 2) 接种增殖培养与传代后的C2C12细胞； 3. C2C12细胞诱导分化培养； 4) 采用在低氧微环境条件下采用电脉冲对步骤3)诱导分化培养的C2C12细胞进行处 理，电脉冲的条件为：电压选取在2V/10mm-16V/10mm，单次脉冲时长在l-24ms，频率在0 · 1-10Hz，如果进行单次电刺激，总时长为24-48小时;如果进行多次电刺激，每次时长为2-3小 时，每天电刺激1-2次，电刺激的天数为2-10天;低氧微环境的条件为:0 2的体积分数为2%-12%〇9. 根据权利要求8所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，电脉冲刺激 前更新用于细胞分化培养的培养基，选择多次电刺激的方式，电刺激每天1次，持续4天，最 后一次电刺激后3小时收获细胞，即为建立的骨骼肌细胞运动模型。10. 根据权利要求9所述一种骨骼肌细胞运动模型的建立方法，其特征在于，在收获细 胞后，将有收缩功能的肌管细胞用于基础研究或临床应用。
【文档编号】C12N5/077GK106086001SQ201610512846
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】李松波, 谢敏豪, 丁军颖, 孙景权
【申请人】李松波, 谢敏豪, 北京体育大学