一种固态发酵制备纳豆激酶的方法
【专利摘要】本发明属于微生物发酵工程技术领域，涉及一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，先分别配制斜面培养基、种子液培养基和发酵培养基，再将纳豆芽孢杆菌接种到斜面培养基上培养得到活化后的纳豆芽孢杆菌后挑取1～2环到种子液培养基中振荡培养作为发酵种子液，然后将发酵培养基灭菌后自然冷，将发酵种子液喷洒于发酵培养基中，并加入水搅拌均匀候在烧杯中铺成薄层，用纱布封口后依次发酵、后熟24h后加入生理盐水，浸提、离心后获得富含纳豆激酶的上清液；其制备工艺简单，操作方便，原料易得，成本低，制备的纳豆激酶活性高，经济效益明显。
【专利说明】
一种固态发酵制备纳豆激酶的方法
技术领域：
[0001] 本发明属于微生物发酵工程技术领域，涉及一种以花生柏为原料，采用固态发酵 工艺制备纳豆激酶的技术，特别是一种固态发酵制备纳豆激酶的方法。
【背景技术】：
[0002] 血栓是由纤维蛋白原和血小板聚集形成的，常引发一系列疾病，是一种严重危害 人类健康的心血管疾病。纳豆激酶(nattokinase简称NK，是由纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，纳豆激酶已被证实是一种治疗心脑血管疾病 的理想候选药物，与其他传统溶栓药相比，具有安全性好、成本低、易被人体吸收、作用直接 迅速、作用持续时间长等诸多优点。因此，纳豆激酶作为新一代治疗血栓的有效药物，具有 较广阔的开发和应用前景。目前，已公开的纳豆激酶制备方法有很多，例如 CM 2 0 1 5 1 0 4 9 5 0 6 2 . 9公开了 一种可放大的快速高效纳豆激酶纯化制备方法， CN201510731704.0公开了一种采用深层液体发酵提取纳豆激酶的方法，该方法的发酵料为 黄豆、红豆、水果或蔬菜;N201210512373.8公开了一种纳豆激酶的制造方法，利用经典深层 发酵技术，通过引入鹰嘴豆粉作为原料组成混合培养基制备纳豆激酶，201310154402.2公 开了一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法，利用黑豆为原料制备高活性纳豆激 酶，但这些方法基本上都存在酶活力低，生产率低，生产成本高等问题。因此，迫切需要寻求 一种生产率高、成本低的纳豆激酶制备方法。花生柏(PNM)是花生仁经压榨提炼油料后所得 的副产品，其粗蛋白质含量为38.0 %~47.0%，粗纤维含量为4.0 %~7.0%，粗脂肪含量为 0.5%~2.0%，现多采用热压榨工艺提取花生油，导致花生蛋白过度变性，附加值降低，只 能用于禽畜水产饲料，这极大限制了花生柏粗蛋白在食品和非食品领域的有效利用。目前 利用微生物发酵花生柏制备抗氧化肽的研究较多，明强强等人利用酵母菌、乳酸菌、黑曲霉 等五种微生物固态发酵花生柏，探索制备抗氧化肽的工艺条件。刘红梅等人运用枯草芽抱 杆菌AS1.398、地衣芽孢杆菌2709和植物乳杆菌等四种微生物液态发酵制备花生抗氧化肽， 但利用纳豆芽孢杆菌发酵花生柏制备纳豆激酶的研究未见报道。
【发明内容】
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[0003] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种花生柏固态发酵 制备纳豆激酶的方法，通过调整发酵时间、温度、接种量、料液比和营养盐加入量，制备高活 力的纳豆激酶，为降低纳豆激酶的生产成本提供理论依据和技术支持，为花生柏的高值化 利用提供新途径。
[0004] 为了实现上述目的，本发明制备纳豆激酶的具体过程为：
[0005] (1)培养基的配制：将琼脂15g/L、蛋白胨10g/L、牛肉粉3g/L和氯化钠5g/L混合均 匀后在121°C灭菌20min得到pH值为7.1~7.5的斜面培养基;将蛋白胨1(^/1、牛肉膏58/1、 氯化钠3g/L、葡萄糖10g/L和酵母膏5g/L混合均匀后在121°C下灭菌20min得到种子液培养 基;将花生柏、麸子、豆柏、燕麦、大豆分别用清水洗净并加总重量3倍的水浸泡15h后按6:1: 1:1:1的重量比混合，并加入花生柏、麸子、豆柏、燕麦和大豆总重量1.5的％蔗糖、0.21 %的 硫酸镁、0.27 %的氯化钙混合组成的营养盐，混合均匀在121°C下灭菌20min得到发酵培养 基；
[0006] (2)纳豆芽孢杆菌种子液的制备:在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌用接种环挑出1 ~2环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37°C培养箱中培养24h得到活化后的纳豆芽孢 杆菌，将活化后的纳豆芽孢杆菌在无菌条件下挑取1~2环到种子液培养基中，在37°C、 160r/min条件下振荡培养18h作为发酵种子液，备用；
[0007] (3)将发酵培养基经121°C在0.22MPa压力下蒸汽灭菌20min后自然冷却至55°C以 下，在无菌条件下，将3~5mL发酵种子液喷洒于30g发酵培养基中，并加入发酵培养基重量 40%~60%的水搅拌均勾，于20〇111]^的烧杯中铺成2-3〇]1的薄层，用纱布封口后在33~41 <€ 条件下依次发酵18~30h、4°C后熟24h后，加入总重量5倍的生理盐水，在4°C浸提2h后 10000r/min离心10min，获得富含纳豆激酶的上清液。
[0008] 本发明制备的纳豆激酶活力能达到3162U/mL，可溶性氮含量能达到5.6mg/mL，羟 自由基清除率能达到74%，铁还原力0D值能达到0.906。
[0009] 本发明与现有技术相比，以花生柏作为主要原料进行固态发酵获得具有较高纳豆 激酶活性的产品，降低了溶栓激酶的生产成本，为广大心脑血管疾病患者带来福音，而且增 加了花生柏的附加值，经济优势明显，对于我国花生产业的发展与农民的增收致富有着重 大的意义，其制备工艺简单，操作方便，原料易得，成本低，制备的纳豆激酶活性高，经济效 益明显。
【附图说明】：
[0010] 图1为本发明实施例所述纳豆芽孢杆菌的生长曲线图。
[0011] 图2为本发明实施例所述尿激酶活力标准曲线图。
[0012] 图3为本发明实施例所述发酵温度对发酵效果的影响曲线图。
[0013] 图4为本发明实施例所述接种量对发酵效果的影响曲线图。
[0014] 图5为本发明实施例所述发酵时间对发酵效果的影响曲线图。
[0015] 图6为本发明实施例所述料液比对发酵效果的影响曲线图。
【具体实施方式】：
[0016] 下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
[0017] 实施例1:
[0018]本实施例制备纳豆激酶的具体过程为：
[0019] (1)培养基的配制：将琼脂15g/L、蛋白胨10g/L、牛肉粉3g/L和氯化钠5g/L混合均 匀后在121°C灭菌20min得到pH为7.1~7.5的斜面培养基;将蛋白胨1(^/1、牛肉膏58/1、氯 化钠3g/L、葡萄糖10g/L和酵母膏5g/L混合均匀后在121°C下灭菌20min得到种子液培养基； 将花生柏、麸子、豆柏、燕麦、大豆分别用清水洗净并加总重量3倍的水浸泡后按6:1:1:1:1 的重量比混合，并加入花生柏、麸子、豆柏、燕麦和大豆总重量1.5的％蔗糖、0.21 %的硫酸 镁、0.27%的氯化钙混合组成的营养盐，混合均匀在121°C下灭菌20min得到发酵培养基；
[0020] (2)纳豆芽孢杆菌种子液的制备:在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌用接种环挑出1 ~2环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37°C培养箱中培养24h得到活化后的纳豆芽孢 杆菌，将活化后的纳豆芽孢杆菌在无菌条件下挑取1~2环到种子液培养基中，在37°C、 160r/min条件下振荡培养18h作为发酵种子液，备用；
[0021] (3)将发酵培养基经121°C在0.22MPa压力下蒸汽灭菌20min后自然冷却至55°C以 下，在无菌条件下，将3~5mL发酵种子液喷洒于30g发酵培养基中，并加入发酵培养基重量 40 %~60 %的水搅拌均勾，于200mL的烧杯中铺成2~3cm薄层，用纱布封口后在33~41°C条 件下依次发酵18~30h、4°C后熟24h后，加入总重量5倍的生理盐水，在4°C浸提2h后10000r/ min离心10min，获得富含纳豆激酶的上清液。
[0022] 实施例2:
[0023]本实施例将实施例1步骤(2)制备的发酵种子液每隔3h取样，测定660nm处的0D值， 以未接种纳豆芽孢杆菌的种子培养液为空白对照，绘制纳豆芽孢杆菌的生长曲线(如图1所 示），确定接入发酵培养基的种龄;并依次改变步骤(3)中的发酵温度、接种量(发酵种子液 喷洒量）、发酵时间、料液比(发酵培养基与加入其中的水的重量比）和步骤(1)中的营养盐， 分别测定单因素对纳豆激酶活力与可溶性氮含量的影响，发酵温度分别为29、33、37、41、45 °C;接种量分别为l、2、3、4、5mL;发酵时间分别为12、18、24、30、36h;料液比分别为1:0.2、1: 0.3、1 :0.4、1:0.5、1:0.6;其测定结果分别如图3、4、5、6所示;营养盐41添加组42不加组， 然后根据单因素实验结果，选择温度、时间、接种量和料液比四个影响较为显著的因素进行 正交实验，实验设计见表1:
[0024]表1因素与水平排列
[0025]
[0026]正交实验结果见表2:
[0027]表2:正交试验设计与极差分析结果
[0028]
[0029] 在发酵温度的影响中，K2>K1>K3，K2最大，说明37°C对纳豆激酶活力的影响最 大;在发酵时间的影响中K2 >K3 >K1，K2最大，说明24h对纳豆激酶活力的影响最大;在接种 量的影响中，K3>K2>K1，K3最大，说明5mL对纳豆激酶活力的影响最大;在料液比的影响中 ΚΙ >K2>K3，K1最大，说明1:0.4对纳豆激酶活力的影响最大。
[0030] 本实施例所述纳豆激酶活力的测定过程为：先制作尿激酶标准曲线，按照WS1 - (X-052)一2001Z-2010,参照文献"Astrup T，Muller S.The fibrin plate method for estimating fibrinolytie activity[J].Arch Biochemical Biopys,1995,40：346-351" 公开的方法，以尿激酶标准品单位数的对数为纵坐标，溶解圈垂直两直径乘积的对数为横 坐标，绘制标准曲线（如图2所示），并计算得到回归方程y = 4.9864x+0.5141，R2 = 0.9947， 再取上清液点样于纤维蛋白平板上，37°C孵育18h，测量溶解圈的垂直两直径，两直径乘积 的对数代入回归方程，计算样品酶活力，每组数据均平行测定3次;可溶性氮含量的测定参 照文献"明强强，于丽娜，杨庆利，等.黑曲霉固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究 [J].食品科技，2014，39(2): 17-22"的方法测定;测定抗氧化活性时，羟自由基清除率、铁 还原力的测定按照文献"Yu L N，Sun J，Liu S F，et al.Ultrasonic-assisted enzymolysis to improve the antioxidant activities of peanut(Arachin conarachin L.)antioxidant hydrolysate[J]. International Journal of Molecular Sciences · 2012，13:9051-9068" 的方法测定。
[0031] 本实施例纳豆芽孢杆菌的生长曲线如图1所示，在0~12h内，纳豆芽孢杆菌生长速 度较慢，处于延滞期；12h后纳豆芽孢杆菌生长迅速，进入对数生长期；21h开始纳豆芽孢杆 菌生长变缓，菌数趋于稳定，进入稳定期；30h开始纳豆芽孢杆菌数量开始减少，进入衰亡 期，由此确定纳豆芽孢杆菌的最适种龄为18h。
[0032] 本实施例发酵温度对发酵效果的影响如图3所示，在29~45°C范围内，纳豆激酶活 力呈现先增加后减小的趋势，在发酵温度为37°C时，纳豆芽孢杆菌产酶活力最高;可溶性氮 含量也呈现先增加后减少的趋势，温度为41°C时，可溶性氮含量最高，菌种的生长对温度要 求较高，在适宜温度范围内，纳豆芽孢杆菌才能快速生长繁殖，产生大量的蛋白酶水解底物 蛋白。当温度高于纳豆杆菌适宜的生长范围时，纳豆杆菌的生长繁殖受到抑制，导致菌体数 量减少，综合评价发酵温度对这2个指标的影响，确定33~41°C作为正交实验发酵温度范 围。
[0033]本实施例接种量对发酵效果的影响如图4所示，接种量在1~5mL范围内，发酵液中 纳豆激酶活力先增加后减小，接种量4mL时纳豆激酶活力最高，可溶性氮含量的增加趋势与 纳豆激酶活力变化基本一致，随着接种量的增加，菌种生长繁殖过程中产生的蛋白酶量增 多，蛋白水解生成的肽增加，发酵产物中可溶性氮含量增大，当接种量5mL时，纳豆激酶活力 和可溶性氮含量均降低。这可能与接种的纳豆芽孢杆菌数量大、消耗的营养物质过多，导致 纳豆芽孢杆菌的生长受到抑制，综合评价菌液量对发酵的影响，选择3~5mL接种量作为正 交实验水平范围。
[0034]本实施例发酵时间对发酵效果的影响如图5所示，在12~36h范围内，纳豆激酶的 活力是先增加后减少，24h时纳豆激酶活力最大；可溶性氮含量呈现出先增加后减少的趋 势。在固态发酵初期，菌种生长繁殖旺盛，产生各种酶量增多，将发酵底物的大分子有机物 水解为小分子物质，有利于肽的生成，则发酵产物中可溶性氮含量高。随着发酵时间的延 长，菌种生长进入稳定期，产生的酶量减少，此外，纳豆芽孢杆菌在生长过程中要消耗营养 物质，导致可溶性氮含量减少，综合评价发酵时间的影响，确定18~30h作为正交实验发酵 时间范围。
[0035]本实施例料液比对发酵效果的影响如图6所示，由图中可以看出最适料液比为1: 0.5,固态发酵水分含量过低，影响营养基质的溶解和传递以及颗粒的润胀等条件，不利于 菌种生长，水分含量过高不利于通气，使基质成团，影响氧的传递和发酵热的散失，且纳豆 芽孢杆菌产生的蛋白酶被稀释，使蛋白酶与底物蛋白接触机率下降，影响水解速率，发酵液 中可溶性氮含量少，纳豆激酶的活力较低，综合评价料液比对发酵的影响，确定1:0.4~1: 〇. 6作为正交实验水平范围。
[0036]本实施例添加营养盐的E1组纳豆激酶活力和可溶性氮含量分别为2680U/mL、 5. lmg/mL;不添加的E2组分别为2260U/mL、4.6mg/mL，El组明显高于E2组.
[0037]本实施例由正交实验结果可以看出，发酵时间对发酵产物中纳豆激酶活力的影响 最大，其余依次为接种量、料液比、温度，理论最优组合为发酵时间24h、发酵温度37°C、接种 量5mL、料液比1:0.4，在此发酵条件下测得发酵液的纳豆激酶活力达到3162U/mL，比单因素 中的最高酶活提高了 18 % (2680U/mL)，可溶性氮含量为5.6mg/mL，羟自由基清除率为74 %， 铁还原力0D值为0.906。
【主权项】
1. 一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，其特征在于制备纳豆激酶的具体过程为： (1) 培养基的配制：将琼脂15g/L、蛋白胨10g/L、牛肉粉3g/L和氯化钠5g/L混合均匀后 在121°C灭菌20min得到pH值为7.1~7.5的斜面培养基;将蛋白胨1(^/1、牛肉膏58/1、氯化 钠3g/L、葡萄糖10g/L和酵母膏5g/L混合均勾后在121°C下灭菌20min得到种子液培养基;将 花生柏、麸子、豆柏、燕麦、大豆分别用清水洗净并加总重量3倍的水浸泡15h后按6:1:1:1:1 的重量比混合，并加入花生柏、麸子、豆柏、燕麦和大豆总重量1.5的％蔗糖、0.21 %的硫酸 镁、0.27%的氯化钙混合组成的营养盐，混合均匀在121°C下灭菌20min得到发酵培养基； (2) 纳豆芽孢杆菌种子液的制备:在无菌环境下，将纳豆芽孢杆菌用接种环挑出1~2环 接种到斜面培养基上，在37°C培养箱中培养24h得到活化后的纳豆芽孢杆菌，将活化后的纳 豆芽孢杆菌在无菌条件下挑取1~2环到种子液培养基中，在37°C、160r/min条件下振荡培 养18h作为发酵种子液，备用； (3) 将发酵培养基经121°C在0 · 22MPa压力下蒸汽灭菌20min后自然冷却至55°C以下，在 无菌条件下，将3~5mL发酵种子液喷洒于30g发酵培养基中，并加入发酵培养基重量40 %~ 60%的水搅拌均勾，于20〇111]^的烧杯中铺成2-3〇]1的薄层，用纱布封口后在33~41<€条件下 依次发酵18~30h、4°C后熟24h后，加入总重量5倍的生理盐水，在4°C浸提2h后10000r/min 离心10min，获得富含纳豆激酶的上清液。
【文档编号】C12R1/07GK106085991SQ201610562331
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】胡迎芬, 王艳平, 马爱国, 梁惠, 张源洁, 刘青, 丁皓玥
【申请人】青岛大学