专利名称：聚乙二醇化重组人生长激素药物及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明公开涉及一种治疗重组人生长激素(rhGH)缺乏症的药物制剂，尤其是一种能够明显减少用药次数，具有长效作用的聚乙二醇化重组人生长激素药物制剂以及其生产工艺。
背景技术：
重组人生长激素(rhGH)具有调节代谢、刺激蛋白合成和加速酯肪降解等生理功能，能促进骨骼和肌肉组织的生长发育，是目前治疗儿童因内源性重组人生长激素(rhGH)缺乏或不足导致的身材矮小的特效药，又因能促进伤口的愈合，也用于损伤、严重烧伤的治疗和外科手术中。
重组人生长激素(rhGH)在治疗儿童因内源性重组人生长激素(rhGH)缺乏或不足所导致的身材矮小症时，由于在体内的半衰期很短，为了达到疗效，需要每天注射，一个疗程需要注射180次，患儿非常痛苦，还会产生抗体。由于它是蛋白质，受体液中酶的降解、肾脏的排泄，在体循环中半衰期较短，需要长期注射才能持续疗效，而长期使用又可能产生抗体。
聚乙二醇(Polyethlene glycol，PEG)是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过共价件键结合方式修饰蛋白质。聚乙二醇修饰蛋白质药物不仅可以降低免疫原性和毒性、而且能明显延长血浆半衰期，提高蛋白质药物的稳定性。利用PEG对其进行修饰，可以减少蛋白质分子通过肾脏的排泄，延长体内半衰期，减少用药次数，增加治疗的有效性。
聚乙二醇修饰蛋白质技术已广泛应用于生物医药领域，到目前为止PEG修饰蛋白质和其它化合物至少有四十余种。FDA已批准的PEG化产品有聚乙二醇腺苷脱氨酶、聚乙二醇天冬酰氨酶、聚乙二醇干扰素等。有关文献报道有采用mPEG-SC修饰重组人重组人生长激素(rhGH)的内容，由于mPEG-SC是与蛋白质分子中赖氨酸残基中游离的氨基结合，因此所得到的修饰产物均一性差，为每个重组人生长激素(rhGH)结合1～7个PEG分子的混合物，要将混合物中的每一组份分离纯化非常困难，且得率也非常低。本发明提供了一种聚乙二醇分子与重组人生长激素(rhGH)的N末端结合，且一个重组人生长激素(rhGH)分子结合一个聚乙二醇分子的聚乙二醇化重组人生长激素药物的制备方法。
发明内容
本发明所要解决的首要技术课题是提供一种有利于工业化生产、且能明显减少用药次数、用于重组人生长激素(rhGH)缺乏症的临床治疗的聚乙二醇化重组人生长激素药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物，其特征在于聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物是由聚乙二醇和重组人生长激素(rhGH)以共价键连接。
所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物是由聚乙二醇和重组人生长激素(rhGH)的N末端通过共价键连接。
每个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子。
所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇(monomethoxy polyethyleneglycol，mPEG)活化分子，包括单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯(mPEG-ss)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)，其分子量在5000～40000之间；最优选的是单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。
聚乙二醇与重组人生长激素(rhGH)发生共价结合反应的比例(W/W)约0.25-20，优选比例在3-10之间。
本发明所要解决的再一个技术课题是提供一种上述聚乙二醇化重组人生长激素药物的生产工艺。
本发明所提供的生产工艺包括以下过程(1)、提供pH4.0～9.0、10-400mmol/L的盐浓度的缓冲体系；(2)、组人生长激素与聚乙二醇活性酯在步骤(1)提供的体系中反应2～48小时，温度控制在4～37℃；(3)、经步骤(2)反应得到的产物经过阴、阳离子交换柱吸附后，用盐洗脱，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)洗脱峰，经浓缩处理后上分子筛色谱分离纯化，收集一个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)，经过过滤除菌，冷冻干燥后即得。
较为优选的方案是聚乙二醇与重组人生长激素(rhGH)发生共价结合反应的缓冲体系优选的pH值在4.8-8.5之间，优选的温度在25℃-37℃，优选的时间为16-24小时。
聚乙二醇与重组人生长激素(rhGH)发生共价结合反应需要用NaCNBr作为催化剂。
与现有技术相比，本发明所具备的突出的实质性特点和显著的技术进步主要表现在以下几个方面本发明所提供的聚乙二醇化重组人生长激素药物的优点是提供在体内更长时间的血液水平，具有明显的长效性，减少注射次数而使患者容易接受；本发明所述的重组人生长激素(rhGH)是采用基因工程的方法经菌体发酵、纯化后获得，纯度大于98％，且保持有较好的生物活性；本发明采用对重组人生长激素(rhGH)的N末端选择性高的修饰方法，即聚乙二醇活性酯和重组人生长激素(rhGH)的N末端通过共价键方式连接，使产物的均一性得到大大提高，容易纯化，纯化产物的活性能够较好地保留。通过皮下或静脉注射方式使用，能提供在体内更长时间的血液水平，具有明显的长效性，减少注射次数而使患者容易接受。
附图概述
图1是重组人生长激素(rhGH)与聚乙二醇(PEG)不同比例的修饰反应结果的SDS-PAGE电泳图，图中1，2，3，4，5，6，7，8，9分别表示重组人生长激素(rhGH)与聚乙二醇(PEG)的比例为1∶0.25，1∶0.5，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10；图2是PEG-GH的分离纯化SDS-PAGE电泳图，图中1表示分子量标准，2表示rhGH，3表示PEG-GH修饰反应液，4表示离子交换洗脱液，5表示PEG-GH分子筛洗脱液；图3、PEG-GH和rhGH在小鼠血液中的存留时间曲线，图a是静脉注射，图b是皮下注射。
具体实施例方式
以下实施例1-4是聚乙二醇与重组人生长激素(rhGH)的修饰反应。
实施例1在本实施例中使用的重组人生长激素(rhGH)的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性。
将重组人生长激素(rhGH)溶于100mM的磷酸盐缓冲液(pH5.0)中，按重组人生长激素(rhGH)∶聚乙二醇(PEG)＝1∶6(W/W)的比例加入单甲氧基聚乙二醇缩丙醛(mPEG-Propionaldehyde，mPEG--ALD)，搅拌溶解，再加入NaCNBr，室温反应24小时。
实施例2在本实施例中使用的重组人生长激素(rhGH)的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性。
将重组人生长激素(rhGH)溶于100mM的磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，按重组人生长激素(rhGH)∶聚乙二醇(PEG)＝1∶10(W/W)的比例加入单甲氧基聚乙二醇缩丙醛(mPEG-Propionaldehyde，mPEG--ALD)，搅拌溶解，再加入NaCNBr，室温反应24小时。
实施例3在本实施例中使用的重组人生长激素(rhGH)的纯度大于98％，且保持有较高的生物活性。
将重组人生长激素(rhGH)溶于100mM的磷酸盐缓冲液(pH4.0)中，按重组人生长激素(rhGH)∶聚乙二醇(PEG)＝1∶3(W/W)的比例加入单甲氧基聚乙二醇缩丙醛(mPEG-Propionaldehyde，mPEG--ALD)，搅拌溶解，再加入NaCNBr，室温反应24小时。
聚乙二醇化重组人生长激素药物的分离纯化工艺将重组人生长激素(rhGH)与聚乙二醇反应得到的产物经过阴离子交换树脂或阳离子交换树脂吸附后，用盐洗脱，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子的聚乙二醇化重组人生长激素，经过浓缩处理后上分子筛凝胶色谱分离纯化，所得到的聚乙二醇化重组人生长激素药物的纯度可大于98％，在经过滤除菌、冷冻干燥后即为产品。以下实施例4-5为具体实施例。
实施例4将重组人生长激素(rhGH)与聚乙二醇反应得到的产物对100mM/LpH8.0的磷酸缓冲液透析后，经过阴离子交换树脂吸附后，用盐洗脱，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子的聚乙二醇化重组人生长激素，经过浓缩处理后上分子筛凝胶色谱分离纯化，所得到的聚乙二醇化重组人生长激素药物的纯度可大于98％，在经过滤除菌、冷冻干燥后即为产品。
实施例5将重组人生长激素(rhGH)与聚乙二醇反应得到的产物对100mM/LpH4.0的NaAc-HAc缓冲液透析后，经过阳离子交换树脂吸附后，用盐洗脱，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子的聚乙二醇化重组人生长激素，经过浓缩处理后上分子筛凝胶色谱分离纯化，所得到的聚乙二醇化重组人生长激素药物的纯度可大于98％，在经过滤除菌、冷冻干燥后即为产品。
以下是聚乙二醇化重组人生长激素药物在小鼠血液中的存留时间实验。
本研究在小鼠中进行，采用皮下和静脉两种途径注射聚乙二醇化重组人生长激素，并以重组人生长激素(rhGH)作为对照，评价其在小鼠血液中的存留时间。
取48只小鼠，分为两组。分别经皮下注射和静脉注射两种途径给药，每只小鼠注射20.0μg，0.20ml，按5min，20min，45min，2h，4h，6h，12h，18h，24h，30h，36h，42h时间点，处死动物取血0.5ml/只，加肝素钠抗凝，离心取出血浆，冷冻保存待测。
采用双抗夹心法测定血浆中聚乙二醇化重组人生长激素和rhGH的含量，测定波长490nm，以时间为横坐标，OD490值为纵坐标，绘制mPEG-GH和rhGH在小鼠血清中的存留时间曲线，该项试验结果表明，rhGH经静脉注射后，20min在小鼠血液中达到高峰，随后迅速下降，2h在血液中基本被清除；而聚乙二醇化重组人生长激素经静脉注射，20min在小鼠血液中达到高峰后，能持续维持将近6h，18h后在血液中基本被清除。rhGH经皮下注射给药后，20min在小鼠血液中达到高峰，并能维持将近60min，4h后基本被清除；而聚乙二醇化重组人生长激素经皮下注射给药后，20min在小鼠血液中达到高峰，并能维持将近10h，24h后基本被清除。这说明与对照品rhGH相比较，聚乙二醇化重组人生长激素经皮下和静脉注射途径给药，均能显著的延长在血液中的存留时间，延迟被清除的时间，具有长效的作用。
权利要求
1.一种聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物，其特征在于聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物是由聚乙二醇和重组人生长激素(rhGH)以共价键连接。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物，其特征在于所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物是由聚乙二醇和重组人生长激素(rhGH)的N末端通过共价键连接。
3.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物，其特征在于每个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子。
4.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物，其特征在于所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇(monomethoxypolyethylene glycol，mPEG)活化分子，包括单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯(mPEG-ss)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)，其分子量在5000～40000之间；最优选的是单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)。
5.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物，其特征在于聚乙二醇与重组人生长激素(rhGH)发生共价结合反应的比例(W/W)约0.25-20，优选比例在3-10之间。
6.根据权利要求1所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物的生产工艺，包括以下过程(1)、提供pH 4.0～9.0、10-400mmol/L的盐浓度的缓冲体系；(2)、组人生长激素与聚乙二醇活性酯在步骤(1)提供的体系中反应2～48小时，温度控制在4～37℃；(3)、经步骤(2)反应得到的产物经过阴、阳离子交换柱吸附后，用盐洗脱，收集主要含一个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)洗脱峰，经浓缩处理后上分子筛色谱分离纯化，收集一个聚乙二醇分子连接一个重组人生长激素(rhGH)分子的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)，经过过滤除菌，冷冻干燥后即得。
7.根据权利要求6所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物的生产工艺，其特征在于聚乙二醇与重组人生长激素(rhGH)发生共价结合反应的缓冲体系优选的pH值在4.8-8.5之间，优选的温度在25℃-37℃，优选的时间为16-24小时。
8.根据权利要求6或7所述的聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物的生产工艺，其特征在于聚乙二醇与重组人生长激素(rhGH)发生共价结合反应需要用NaCNBr作为催化剂。
全文摘要
本发明涉及一种用于重组人生长激素(rhGH)缺乏症的临床治疗的聚乙二醇化重组人生长激素药物及其制备方法，聚乙二醇化重组人生长激素(rhGH)药物是由聚乙二醇和重组人生长激素(rhGH)以共价键连接；生产工艺主要包括提供pH 4.0～9.0缓冲体系，重组人生长激素与聚乙二醇活性酯在缓冲体系中反应2～48小时，温度控制在4～37℃，再经过分离纯化工艺获得纯化，本发明具有容易纯化、利于工业化生产、具有长效性优点。
文档编号C07K14/435GK1565624SQ03132000
公开日2005年1月19日 申请日期2003年6月24日 优先权日2003年6月24日
发明者宋礼华, 王荣海, 戎隆富 申请人:安徽安科生物工程股份有限公司