一种猪日本乙型脑炎病毒dna复制子疫苗载体的构建方法及其用途
【专利摘要】一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗的构建方法及其用途，属于生物医药【技术领域】。以构建的JEV疫苗毒株SA14-14-2感染性克隆为基础，去除病毒结构蛋白基因prM和E而保留全部非结构蛋白的复制子表达载体PAC-JEV，并在结构蛋白基因C基因下游插入目的基因后将该重组复制子PAC-JEV-目的基因转染BHK-21，可以用于JEV基因与蛋白功能关系及基于复制子载体的疫苗的研究。
【专利说明】一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体为一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗的构建方法及其用途。
【背景技术】
[0002]病毒复制子指去除病毒结构蛋白基因而保留与复制相关的非结构蛋白基因的病毒亚基因组，该亚基因组具有自主复制并翻译表达非结构蛋白及插入的目的蛋白。因此病毒复制子不仅是研究病毒基因结构与功能技术平台，也是表达外源蛋白及研发新型复制子疫苗的新型手段。已有甲病毒、小RNA病毒、黄病毒、冠状病毒等RNA病毒的复制子构建成功报道，其中研究最为成熟的是甲病毒复制子，已研制成功作为真核表达载体的商业化甲病毒复制子产品，同时以甲病毒复制子为基础的新型疫苗也被证明能保护动物免受病毒感染，然而甲病毒复制子细胞毒性强很快致细胞凋亡，不能持续表达外源蛋白。黄病毒复制子却克服了上述缺点，黄病毒复制子细胞毒性很小，能在细胞内复制数十天；黄病毒属病毒的RNA聚合酶的保真性高而保证黄病毒属病毒复制子作为疫苗载体时免疫原性较稳定；黄病毒属病毒复制子的RNA小于1000Ont便于遗传操作，因此黄病毒属病毒复制子的研究极具科研价值。
[0003]乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一种重要的黄病毒科(Flaviviridae family) 黄病毒属(Flavivirus)成员，同属病毒还包括黄热病毒(Yellowfever virus, YEV),蝶传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus, TBEV)和登革热病毒(Dengue virus，DENV)等。JEV病毒粒子直径约50nm，病毒基因组单股正链RNA，长约llkb，含一大的开放阅读框编码病毒的结构蛋白C、prM、囊膜蛋白E和7个非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5。JEV 基因组 5’ 端有 I 型帽子结构(m7GpppAm p )，3，无聚腺苷酸尾。基因组5’和3’末端核苷酸都可形成高度保守的二级结构，参与病毒的复制，NS3、NS5基因编码的复制酶对病毒基因组复制和翻译是必须的。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗的构建方法及其用途的技术方案，其构建方法简单，获得的疫苗性能稳定，成本低，效果显著。
[0005]所述的一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤:
I)将含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段质粒pK-JEV，以低拷贝质粒pACYC_177为骨架，引入新的酶切位点(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I)，将 CMV 启动子插入新引入的酶切位点HindII1- EcoR I间；之后分别将JEV结构蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoR I和Kpn I酶切位点间，称为PAC-CMV-CF2A质粒；再以pK-JEV为模板，用NS 1-F及 NS 1-R、NS I1-F 及 NS II H-R1/R2/R3 分别扩增 JEV 非结构蛋白 NS I 和 NS II +HDVRz,将NS I保存于_20°C，备用；
2)利用Xba I 和 Xho I 将 NS II 连接到 pBluescript SK2 (+)上并称为 pBlue-NS II +HDVRz,以Nhe I和Xho I为酶切位点将polyA连接到pBlue- NS II +HDVRz，连接产物鉴定正确后经Xba I和Xho I双酶切再连接到pAC-CMV-CF2A上，将其称为pAC_exJEV ；
3)最后利用SalI和Xba I将NS I连接到pAC-exJEV上，将最终的复制子载体称为pAC-JEV，即得DNA复制子疫苗。
[0006]所述的一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗的构建方法，其特征在于以构建的JEV疫苗毒株SA14-14-2感染性克隆为基础，去除病毒结构蛋白基因prM和E而保留全部非结构蛋白的复制子表达载体pAC-JEV。
[0007]所述的一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法，其特征在于在结构蛋白基因C基因下游插入EGFP或目的基因后将该重组复制子PAC-JEV-EGFP或目的基因转染BHK-21。
[0008]所述的一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体在JEV基因与蛋白功能关系及基于复制子载体的疫苗研究上的应用。
[0009]上述一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法，其构建方法简单，获得的疫苗性能稳定，成本低，效果显著；该复制子表达载体可以用于JEV基因与蛋白功能关系的研究，应用于基于复制子载体疫苗的研究。
[0010]本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为复制子及相关载体结构不意图；
图2为复制子pAC-JEV-EGFP在BHK-21细胞的表达；
图 2 中:A.12h ； B.48h ； C.8d ；D.Negative control (BHK-21 cells transfectionwith pAC-JEV-EGFP)。
【具体实施方式】
[0012]现结合本发明的实例，进一步说明本发明的有益作用。
实施例
[0013]将含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段质粒ρΚ-JEV，以低拷贝质粒pACYC_177为骨架，引入新的酶切位点(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I ),^CMV启动子插入新引入的酶切位点Hind II1- EcoR I间；之后分别将JEV结构蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoR I和Kpn I酶切位点间，称为pAC_CMV_CF2A质粒；再以pK-JEV为模板，用NS 1-F及NS 1-R、NS I1-F及NS II H-R1/R2/R3分别扩增JEV非结构蛋白NS I和NS II +HDVRz，将NS I 保存于 _20°C，然后再利用 Xba I 和 Xho I 将NS II 连接到 pBluescriptSK2 (+)上并称为pBlue- NS II +HDVRz,以Nhe I和Xho I为酶切位点将polyA连接到pBlue-NS II +HDVRz，连接产物鉴定正确后经Xba I和Xho I双酶切再连接到pAC_CMV_CF2A上，将其称为pAC-exJEV，最后利用Sal I和Xba I将NS I连接到pAC-exJEV上，将最终的复制子载体称为pAC-JEV。再将获得的pAC-JEV参照Lipofectamine2000说明书方法转染BHK-21细胞，即得DNA复制子疫苗。
[0014]以下通过试验进一步说明本发明的有益试验结果。[0015]试验一:
试验材料:含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段质粒pK-JEV ;质粒pBluescriptSK2 (+)、pcDNA3.l、pEGFP_Nl、低拷贝质粒pACYC-177、小鼠抗JEV多抗均由浙江农林大学动物实验室提供和制备。
[0016]1.含CMV启动子的JEV复制子载体pAC-JEV的构建
JEV复制子载体pAC-JEV结构如图1，以低拷贝质粒pACYC-177为骨架，引入新的酶切位点(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I )，将 CMV 启动子插入新引入的酶切位点"i/?d II1- EcoR I间；之后分别将JEV结构蛋白C基因、FMDV 2A插入I和Kpn I酶切位点间命名该质粒为PAC-CMV-CF2A;再以pK-JEV为模板，用NS 1-F及NS 1-R、NS I1-F及NS II H-R1/R2/R3分别扩增JEV非结构蛋白NS I和NS II +HDVRz (二者包含全部的非结构蛋白基因)，先将NS I保存于_20°C备用，利用Xba I和Xho I将NS II连接到 pBluescript SK2 (+)上并命名为 pBlue- NS II +HDVRz,以 Nhe I 和 Xho I 为酶切位点将polyA连接到pBlue- NS II +HDVRz，连接产物鉴定正确后经Xba I和Xho I双酶切再连接到pAC-CMV-CF2A上，将其命名为pAC_exJEV，最后利用Sal I和Xba I将NS I连接至IjpAC-exJEV上，将最终的复制子载体命名为pAC-JEV。
[0017]2.转染 BHK-21 细胞
大提pAC-JEV质粒，将质粒转染BHK-21细胞，具体方法参照LipOfectamine2000说明书。通过方阵实验确定质粒与脂质体用量的最佳比值，之后将质粒染至24孔板单层BHK-21细胞，以pACYC-177空质粒为阴性对照。
[0018]3.含EGFP报告基因复制子的构建
以 pEGFP-Nl 为模板，设计合成两条引物 EGFP-F/R(F:5’ GTAGGTACCGTGAGCAAGGG3’ ; R:5’ TATGTCGACCTTGTACAGCTCGT3’)，PCR 扩增获得 EGFP 基因，利用 Kpn I 和 Sal I 双酶切与pAC-JEV相连接并命名为pAC-JEV-EGFP,测序验证后，Lipofectamine2000转染BHK-21，同时以空载体pACYC-177为阴性对照，并在转染后12h开始，每隔24h再荧光显微镜下观察荧光变化。
[0019]实验结果:
1.含CMV启动子的JEV复制子载体pAC-JEV的构建
将CMV启动子、HDVRz、PolyA终止子等元件引入质粒pACYC-177中，在本实验室构建的JEV感染性克隆的基础上，去除JEV结构蛋白prM和E，构建了保留全部非结构蛋白的JEV复制子载体PAC-JEV (见图1)。为方便后续试验的对照，再通过PCR方法缺失掉NS5羧基端部分基因序列而构建的质粒pAC-JEV-Λ NS5 (见图1)。
[0020]2.含报告基因EGFP复制子的构建
将报告基因EGFP插入到复制子载体pAC-JEV构建成复制子pAC-JEV-EGFP，鉴定正确后，Lipofectamine2000转染BHK-21后，每隔12h荧光显微镜下观察。结果显示:12h即出现荧光，荧光可持续8d左右，期间发现部分阳性细胞变圆死亡现象。
【权利要求】
1.一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段质粒pK-JEV，以低拷贝质粒pACYC_177为骨架，引入新的酶切位点(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I)，将 CMV 启动子插入新引入的酶切位点HindII1- EcoR I间；之后分别将JEV结构蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoR I和Kpn I酶切位点间，称为PAC-CMV-CF2A质粒；再以pK-JEV为模板，用NS 1-F及 NS 1-R,NS I1-F 及 NS II H-R1/R2/R3 分别扩增 JEV 非结构蛋白 NS I 和 NS II +HDVRz，将NS I保存于_20°C，备用；
2)利用Xba I 和 Xho I 将 NS II 连接到 pBluescript SK2 (+)上并称为 pBlue-NS II +HDVRz,以Nhe I和Xho I为酶切位点将polyA连接到pBlue- NS II +HDVRz，连接产物鉴定正确后经Xba I和Xho I双酶切再连接到pAC-CMV-CF2A上，将其称为pAC_exJEV ； 3)最后利用SalI和Xba I将NS I连接到pAC-exJEV上，将最终的复制子载体称为pAC-JEV，即得DNA复制子疫苗。
2.如权利要求1所述的一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗的构建方法，其特征在于以构建的JEV疫苗毒株SA14-14-2感染性克隆为基础，去除病毒结构蛋白基因prM和E而保留全部非结构蛋白的复制子表达载体pAC-JEV。
3.如权利要求1所述的一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体的构建方法，其特征在于在结构蛋白基因C基因下游插入EGFP或目的基因后将该重组复制子PAC-JEV-EGFP或目的基因转染BHK-21。
4.如权利要求1所述的一种猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子疫苗载体在JEV基因与蛋白功能关系及基于复制子载体的疫苗研究上的应用。
【文档编号】A61K39/12GK103540604SQ201310502189
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】王晓杜, 周圻, 马志永 申请人:浙江农林大学