专利名称：检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测猪病毒性传染病病原的器具，特别是涉及一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条。
背景技术：
我国是生猪的生产和消费大国。随着大中小型规模化养猪场、种猪场数量的逐年增加，猪繁殖障碍性疾病已成为我国规模化猪场最重要的疾病之一，发病率平均达30％以上，造成巨大的经济损失，并严重制约着养猪业的发展。猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪乙型脑炎病毒(JEV)是造成猪繁殖障碍的三种重要病毒。PRRSV引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，主要表现为感染母猪发热，厌食，怀孕后期发生流产、死胎、木乃伊胎和弱仔等，感染仔猪发生呼吸困难(肺炎)、免疫机能障碍和高死亡率，因部分病猪的耳朵发紫，又称蓝耳病。蓝耳病近年来在我国广为传播，如2006年我国南北10多个省(市、区)的猪群发生的“高热病”现认为是高致病性PRRSV毒株引起，发病猪群达200万头，死亡40万头。因此，PRRSV被认为是导致近年来猪肉价格上涨的主要疾病之一。PPV引起猪细小病毒病，主要表现为受感染的母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、死胎、畸形胎、木乃伊胎和弱仔以及屡配不孕，而其他年龄的猪感染后不表现明显的临床症状。目前猪细小病毒病在我国猪群中广为传播，在大多数感染猪场呈地方性流行并且很难净化，从而造成了持续的经济损失，严重阻碍了养猪业的健康发展。JEV引起人畜共患病-流行性乙型脑炎。猪乙型脑炎，主要表现为感染猪发热，厌食，母猪怀孕后期突然发生流产、死胎、木乃伊胎和弱仔等，新生仔猪良莠不齐、死亡率高，感染公猪出现睾丸炎。猪乙型脑炎主要由带病毒的蚊虫叮咬而传播，主要分布在亚洲各国，我国大部分地区均有本病发生。
快速诊断是有效防控疾病的基础。但在生产中，PRRSV、PPV和JEV引起的繁殖障碍性疾病，临床症状相似，而且经常混合感染，单凭临床病理变化往往不能及时正确诊断，最后确诊有赖实验室检查，如检测病猪样品中病原或其特异抗体的存在、甚至用分离到的病原复制出临床病例。目前实验室检测这三种病毒的方法有(1)病毒分离与鉴定，无菌取病猪样品接种肺泡巨噬细胞或MarC-145细胞(对PRRSV)、猪传代肾细胞(对PPV和JEV)培养相应病毒，用酶或荧光素印迹抗体检测细胞培养中的病毒，或用中和抗体鉴定病毒；(2)用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PRRSV感染猪血清中的特异抗体，用血凝抑制试验(HI)检测PPV或JEV感染猪血清中的特异抗体；(3)用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞培养物或病猪样品中的PRRSV或JEV核酸，用PCR检测细胞培养物或病猪样品中的PPV核酸。
病毒分离与鉴定和PCR检测技术操作复杂、需要仪器和较长的时间，不适合生产或现场的快速诊断需要。ELISA和HI比病毒分离与鉴定和PCR技术简便、快速，常用来检测PRRSV(ELISA)、JEV和PPV(HI)及其抗体，但仍不便于我国基层或现场普遍推广应用。因为ELISA仍需要酶标仪和试剂，较复杂的操作步骤和经验，HI也需要新鲜的豚鼠或鹅红血球；这些仪器、试剂在基层或者缺乏，或者缺乏操作人员和保存条件。为此，有人研究报道了用斑点免疫金渗滤法来检测PPV、JEV和PRRSV。这种方法利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原-抗体反应由ELISA或HI的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹和红血球印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况而判断结果，因此比ELISA和HI更简便、快速和实用。但目前报道的斑点免疫金渗滤法一次只检测一种猪病病原，即使这样，也至少需添加2次试剂和洗涤2次才能获得结果；如果要鉴别诊断上述三种猪病病毒，则同时需要多种试剂盒和十几个操作步骤，非专业的基层人员使用仍显得不方便。
专利文献CN101216488A中公开了一种检测猪繁殖与呼吸综合症抗体的试纸条及其制备方法，其是通过检测PRRSV抗体进行诊断，而不是直接检测病毒的存在，并且只能间接地诊断三种主要的猪繁殖障碍性病毒中一种(PRRSV)，有很大的局限性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种结果显示直观、准确的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，该检测试纸条和斑点免疫金渗滤法一样特异、敏感但操作使用更简便、快速和实用，且检测成本更为低廉。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，至少包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层是由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜上标记有一个/条含有抗猪/小鼠IgG的对照印迹，和至少一个/条含有猪繁殖障碍性病毒抗体的检测印迹，所述猪繁殖障碍性病毒抗体为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪细小病毒PPV、猪乙型脑炎病毒JEV单克隆抗体(简称单抗)/多克隆抗体(简称多抗)中的至少一种，每一个/条检测印迹中只含有一种相应的病毒单抗/多抗；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹所含猪繁殖障碍性病毒抗体相对应的并以胶体金标记的抗猪繁殖障碍性病毒的多克隆抗体/单克隆抗体。所述金标抗体纤维层上如附着抗猪繁殖障碍性病毒金标单抗，则相应地以抗该病毒的多抗标记检测印迹，并以抗小鼠IgG溶液标记对照印迹；金标抗体纤维层上如附着抗病毒金标多抗，则相应地以抗该病毒的单抗标记检测印迹，并以抗猪IgG溶液标记对照印迹。
在所述纤维素膜层上分别标记有含PRRSV多抗/单抗、PPV多抗/单抗、JEV多抗/单抗的三个/条检测印迹；所述金标抗体纤维层上附着有对应的混合金标抗体，它是以胶体金标记的抗PRRSV、PPV和JEV单抗/多抗的混合物。
在所述纤维素膜层上标记有两个/条检测印迹，分别含有PRRSV多抗/单抗、PPV多抗/单抗，或分别含有PRRSV多抗/单抗、JEV多抗/单抗，或分别含有PPV多抗/单抗、JEV多抗/单抗，在所述金标抗体纤维层上附着有对应的以胶体金标记的抗PRRSV、PPV的单抗/或多抗，或抗PRRSV、JEV的单抗/或多抗，或PPV、JEV的单抗/或多抗。
所述纤维素膜层上标记有一条/个检测印迹时，其与对照印迹的排列组合为“‖”、“＝”、“//”、“-|”、“+”、“⊥”、“
”、“..”、“≈”、“
”中的任意一种；纤维素膜层上标记有两条/个检测印迹时，其与对照印迹的排列形式为“
”、“///”、“
”、“±”、“...”、“
”、“∵”中的任意一种；纤维素膜层上标记有三条/个检测印迹时，其与对照印迹的排列形式为“||||”、“////”、“王”、“
”、“....”、“∷”中的任意一种。
所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜中的任意一种制成。
所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维、聚酯纤维中的任意一种制成。
所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。
所述吸水层用吸水纸制成。
所述金标抗体纤维膜层由玻璃棉、尼龙纤维、聚酯纤维中的任意一种制成。
在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附层一侧0.3～0.7cm处印制有样品标记线。
本发明的有益效果是 (1)检测特异性强，敏感性高。该快速检测试纸条以胶体金印迹高亲和力的特异性单抗/多抗为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单抗/多抗特异性和亲和力(结合力)影响很小，且具有较高的印迹率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克的相应病毒的蛋白。
(2)操作简便，快速。使用本发明试纸条时无需附加任何其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检的澄清样品液中30秒左右，然后在5分钟左右即可判定检测结果。
(3)结果显示直观、准确。以同时检测三种猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条为例，以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性印迹，即在纤维素膜上只显示一条/个棕红色对照印迹C，表示这三种猪病病毒在被检测样品液中均未检出，在纤维素膜上显示一条/个棕红色对照印迹C和三条/个棕红色检测印迹R、P、J，则表示在被检测样品液中均检出这三种猪病病毒，检测结果呈阳性；结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(4)减少投资和检测成本。使用该快速检测试纸条，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；一条试纸一次可以检测1～3种猪病病毒(原)，而且专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费，节省检测成本，检测费用低。
(5)应用范围广，便于普遍推广应用。本发明操作简单，成“一步式”或“傻瓜式”，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图1为一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条的侧视结构示意图。
图2为图1的俯视结构示意图。
具体实施例方式 实施例1一种同时检测三种猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，参见图1和图2，图中1为以塑胶薄片条制成的支撑层，2为以玻璃棉制成的样品吸附层，3为附着有胶体金标记的抗PRRSV(代号R)、抗PPV(代号P)和抗JEV(代号J)单克隆抗体(Wi)的玻璃棉纤维层，4为硝酸纤维素膜，5为由吸水滤纸制成的吸水层，将编号2、3、4、5各层依次粘贴在支撑层1上，彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透。在硝酸纤维素膜4上，分别以抗PRRSV、抗PPV、抗JEV多克隆抗体IgG溶液(Xi)标记出三种病毒的检测印迹6(R+P+J)，并以羊(兔)抗小鼠IgG溶液标记出对照印迹7(代号C)；检测印迹与对照印迹的排列形式为“||||”。8-1为覆盖在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3上面的测试端的白色保护膜，在样品吸附层2和金标抗体纤维层3交界处对应的保护膜8-1上偏向于样品吸附层2一侧0.5cm处印有印迹线9，9的右端印有箭头及max字样，吸水层5(手柄端)上覆盖有其它颜色(如黄色)保护膜8-2。
用于对照印迹的羊(或兔)抗小鼠/猪IgG抗体，及用于检测印迹和金标抗体纤维层的抗PRRSV、抗PPV和抗JEV的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下 1)羊(或兔)抗小鼠/猪IgG的制备 以饱和硫酸铵法提取小鼠/猪血清中的IgG取1份血清加2份PBS液(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000r/min离心15min，弃上清液；以适量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33％，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000r/min条件下离心15min，弃上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液(pH7.2)过夜透析，换液2～3次，在4℃、10000r/min条件下离心15min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以50μg～100μg(IgG)/kg体重经皮下或肌肉注射抗体阴性健康羊或家兔3～4次，末次免疫20天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取羊(兔)抗小鼠/猪的IgG(其提取方法与上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于标记本发明试纸条的对照印迹。
2)抗PRRSV、抗PPV和抗JEV单克隆抗体(Wi)的制备 以50～100μg/只的PRRSV(PPV或JEV)蛋白免疫Balb/c系小鼠三次，每次间隔15～30天；第三次加强免疫后3～4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与2×107～5×107的NSO浆细胞瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7～1mL的40％～50％PEG4000(pH 8.5～9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100～200μL/孔)，置于37℃5％CO2培养箱中培养7～10天后，以5～10μg/mL的纯化PRRSV(PPV或JEV)蛋白包被96孔酶标板，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(OD450≥0.5)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92～98，其分泌的抗PRRSV(PPV或JEV)的单克隆抗体W1(W2或W3)特异地与PRRSV(PPV或JEV)反应，而不与其它猪病病毒发生交叉反应，亲和力常数达109～10，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，这三种病毒的单克隆抗体(Wi)，均用于制备金标单克隆抗体(Wi)。
3)抗PRRSV、抗PPV和抗JEV金标单克隆抗体(Wi)和金标单克隆抗体纤维膜的制备 以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～100mL沸腾的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4mL的0.5～2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH值至8.5～9.5，以1∶1000～1300的印迹比将待印迹的抗PRRSV(或PPV，或JEV)的单克隆抗体W1(W2或W3)加入pH8.5～9.5的金溶胶中，印迹10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃下、1500～3000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃下、15000r/min离心1小时，弃上清液，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，分别获得胶体金印迹的抗PRRSV、抗PPV和抗JEV的单克隆抗体。将1∶100～500稀释的胶体金印迹的上述单克隆抗体中的2～3种混合吸附于精制玻璃棉(尼龙纤维或聚酯纤维)中，4℃下低温真空干燥，即制得金标单克隆抗体纤维膜。
4)抗PRRSV、抗PPV和抗JEV多克隆抗体(Xi)的制备 分别采用国家批准的针对这三种猪病的灭活疫苗或弱毒疫苗，单独多次免疫接种抗体阴性健康猪。末次免疫20天后静脉采血，以ELISA或HI测定其血清抗体效价在1∶2000或1∶1024以上，则心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)。
5)上述检测试纸条的检测操作方法 a检测样品液的制备无菌取病猪或流产胎儿的脑、肺、肠、肝、淋巴结等组织，将其剪碎、研磨，以生理盐水制成1∶2～5倍待检测样品悬液，置4℃或室温澄清或离心；若取病猪的血液，则分离血清，并以生理盐水作1∶10～50倍稀释待测。
b检测操作将该快速检测试纸条测试端插入待检测样品澄清液或血清中，插入深度不超过印迹线9，约30秒后取出试纸条，水平放置约1～5分钟，同时观察结果。
c结果判断如果在检测试纸条纤维素膜上只显示出一条/个棕红色对照印迹C，表示测检结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出PRRSV、PPV和JEV；如果检测试纸条上的纤维素膜出现棕红色的对照印迹C和检测印迹R或P或J，表示检测结果呈阳性，即在待检样品中检测出相应的PRRSV或PPV、或JEV；如果检测印迹R、P、J同时出现，表示在待检样品中同时检测出PRRSV、PPV、JEV这三种猪病病毒；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。
6)所述检测试纸条测试的原理如下 当该快速检测试纸条测试端(样品吸附带)插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检猪病病毒及金标抗体纤维膜中的金标抗体一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端滤纸中，扩散过程中待检猪病病毒可与该病毒相对应的金标单抗相结合，进而与纤维素膜上检测印迹中的抗该病毒的多抗IgG结合，从而显示出棕红色的检测印迹R、P、J；而对照印迹中的羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标单抗(Wi)结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有PRRSV、PPV、JEV这三种猪病病毒，试纸条只显示出一条/个棕红色对照印迹C；样品溶液中含有PRRSV(PPV或JEV)，则分别与其对应的金标单抗Wi结合，再与纤维素膜上的抗病毒的多抗IgG检测印迹R(P或J)结合，显示出棕红色检测印迹，为阳性印迹；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。
实施例2一种同时检测三种猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于由尼龙纤维制成的金标抗体纤维层3上附着以胶体金标记的抗PRRSV、抗PPV和抗JEV金标多克隆抗体(Xi)(R+P+J)；在硝酸纤维素膜4上，分别以抗PRRSV、抗PPV和抗JEV单克隆抗体IgG溶液(Wi)喷涂出三条/个检测印迹(R+P+J)，并以羊(或兔)抗猪IgG溶液喷涂出对照印迹C，检测印迹与对照印迹的排列形式为“////”、“王”、“
”、“....”、“∷”中的任意一种。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同，不重述。
实施例3一种同时检测两种猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于由聚酯纤维制成的金标抗体纤维层上仅附着有抗PRRSV、抗PPV金标单克隆抗体(Wi)；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上分别以对应的抗PRRSV、抗PPV多克隆抗体IgG溶液(Xi)标记出两个检测印迹，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液印上对照印迹，检测印迹与对照印迹的排列形式为“
”、“///”、“
”、“±”、“...”、“
”、“∵”中的任意一种。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例4一种同时检测两种猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于由尼龙纤维制成的金标纤维层上附着抗PRRSV、抗PPV金标多克隆抗体(Wi)；聚偏二氟乙烯纤维素膜层4上分别以对应的抗PRRSV、抗PPV单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出两条检测印迹“/”，并以羊(或兔)抗猪IgG溶液标记出对照印迹“\”。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例5一种同时检测两种猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例2基本相同，不同之处在于金标抗体纤维层上仅附着有抗PPV和抗JEV金标多克隆抗体(Xi)；纯纤维素膜层4上分别以对应抗PPV和抗JEV单克隆抗体IgG溶液(Xi)标记出两条检测印迹“|”，并用羊(或兔)抗猪IgG溶液在纯纤维素膜上印制对照印迹“—”。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例6一种同时检测两种猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于玻璃棉制成的金标抗体纤维层上仅附着有抗PRRSV、抗JEV金标多克隆抗体(Xi)；羧化纤维素膜层4上分别以抗PRRSV和抗JEV单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出相应的两条检测印迹“
”，用羊(或兔)抗猪IgG溶液在羧化纤维素膜上印制对照印迹“
”。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例7一种检测两种猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于玻璃棉制成的金标抗体纤维层上附着有抗PRRSV和抗PPV的金标多克隆抗体(Xi)；在硝酸纤维素膜层上分别以抗PRRSV、抗PPV金标单克隆抗体IgG溶液(Xi)标记出两条检测检测印迹“
”，并以羊(或兔)抗猪IgG溶液在硝酸纤维素膜上印制对照印迹“
”。
实施例8一种检测两种猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于金标抗体纤维层上附着有抗JEV和抗PPV的金标金标单克隆抗体(Xi)；在硝酸纤维素膜层上分别以抗JEV和抗PPV金标多克隆抗体IgG溶液(Wi)喷涂出两条检测印迹“|”，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液在硝酸纤维素膜上印上对照印迹“
”。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例9一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例3基本相同，不同之处在于由尼龙纤维制成的金标纤维层上附着有抗PRRSV金标多克隆抗体(Wi)；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上以对应的抗PRRSV单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出一个/条检测印迹，并以羊(或兔)抗猪IgG溶液标记出对照印迹，检测印迹与对照印迹的排列组合为“‖”、“＝”、“//”、“-|”、“+”、“⊥”、“”、“..”、“≈”、“
”中的任意一种。
实施例10一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于由聚酯纤维制成的金标抗体纤维层上仅附着有抗PPV金标单克隆抗体(Wi)；在聚偏二氟乙烯制成的纤维素膜层4上以对应的抗PPV多克隆抗体IgG溶液(Xi)标记出一个检测印迹“·”，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液印上对照印迹“·”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例1相同。
实施例11一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于玻璃棉制成的金标抗体纤维层上仅附着有抗JEV金标多克隆抗体(Xi)；羧化纤维素膜层4上以抗JEV单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出一条检测印迹“
”，并以羊(或兔)抗猪IgG溶液在羧化纤维素膜上印制对照印迹“
”。
实施例12一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原试纸条，其结构、制备方法与实施例1基本相同，不同之处在于由玻璃棉制成的金标抗体纤维层上附着有抗JEV金标金标单克隆抗体(Xi)；在硝酸纤维素膜层上以抗JEV和抗PPV金标多克隆抗体IgG溶液(Wi)喷涂出一条检测印迹“|”，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液在硝酸纤维素膜上印上对照印迹“
”。
实施例13该快速检测试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于支撑层1由不吸水的硬纸条制成，测试端样品吸附纤维层2由尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用纯纤维素膜制成。
实施例14该快速检测试纸条结构和实施例1基本相同，不同之处在于样品吸附纤维层2由聚酯纤维膜制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式
1中的检测操作方法，不重述。
实施例15该快速检测试纸条结构和实施例3基本相同，不同之处在于测试端的样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯(PVDF)纤维膜。
实施例16该快速检测试纸条结构和实施例7基本相同，不同之处在于样品吸附带2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例1中的检测操作方法，不重述。
权利要求
1.一种检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，至少包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层是由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于所述纤维素膜层上标记有一个/条含有抗猪/小鼠IgG的对照印迹，和至少一个/条含有猪繁殖障碍性病毒抗体的检测印迹，所述猪繁殖障碍性病毒抗体为抗猪繁殖与呼吸综合症病毒PRRSV、猪细小病毒PPV、猪乙型脑炎病毒JEV单克隆抗体/多克隆抗体中的至少一种；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹所含猪繁殖障碍性病毒抗体相对应的并以胶体金标记的抗猪繁殖障碍性病毒的多克隆抗体/单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于在所述纤维素膜层上分别标记有含PRRSV多抗/单抗、PPV多抗/单抗、JEV多抗/单抗的三个/条检测印迹；所述金标抗体纤维层上附着有对应的混合金标抗体，它是以胶体金标记的抗PRRSV、PPV和JEV单抗/多抗的混合物。
3.根据权利要求1所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于在所述纤维素膜层上标记有两个/条检测印迹，分别含有PRRSV多抗/单抗、PPV多抗/单抗，或分别含有PRRSV多抗/单抗、JEV多抗/单抗，或分别含有PPV多抗/单抗、JEV多抗/单抗，在所述金标抗体纤维层上附着有对应的以胶体金标记的抗PRRSV、PPV的单抗/或多抗，或抗PRRSV、JEV的单抗/或多抗，或PPV、JEV的单抗/或多抗。
4.根据权利要求1至3中的任意一项权利要求所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于所述纤维素膜层上标记有一条/个检测印迹时，其与对照印迹的排列组合为“||”、“＝”、“//”、“-|”、“+”、“⊥”、“”、“··”、“≈”、
中的任意一种；纤维素膜层上标记有两条/个检测印迹时，其与对照印迹的排列形式为“|||”、
“///”、
“±”、“...”、“∵”、
中的任意一种；纤维素膜层上标记有三条/个检测印迹时，其与对照印迹的排列形式为“||||”、“////”、“王”、
“....”、
中的任意一种。
5.根据权利要求4所述检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于所述纤维素膜层由硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜中的任意一种制成。
6.根据权利要求5所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维、聚酯纤维中的任意一种制成。
7.根据权利要求6所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。
8.根据权利要求7所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于所述吸水层用吸水纸制成。
9.根据权利要求8所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于所述金标抗体纤维膜层由玻璃棉、尼龙纤维、聚酯纤维中的任意一种制成。
10.根据权利要求9所述的检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，其特征在于在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附层一侧0.3～0.7cm处印制有样品标记线。
全文摘要
本发明公开了可检测猪繁殖障碍性病毒传染病病原的试纸条，它包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，该吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，在纤维素膜层上标记有一个含有抗猪/小鼠IgG的对照印迹，和至少一个含有猪繁殖障碍性病毒抗体的检测印迹，所述猪繁殖障碍性病毒抗体为抗PRRSV、PPV、JEV单克隆抗体/多克隆抗体中的至少一种；在金标抗体纤维层上附着有与检测印迹所含病毒抗体相对应的抗猪繁殖障碍性病毒的金标多克隆抗体/单克隆抗体。该试纸条检测时特异性强、敏感性高，无需附加设备、试剂，人人均可操作，适合现场快速鉴别诊断猪繁殖障碍性病毒传染病。
文档编号G01N33/569GK101339191SQ200810141160
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月28日 优先权日2008年8月28日
发明者张改平, 肖治军, 李学伍, 邓瑞广, 杨艳艳, 杨继飞, 东 赵, 王爱萍, 邢广旭, 柴书军, 刘庆堂 申请人:河南省农业科学院