一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及本一种Geobacillus SP. 4j的高 温淀粉酶基因 amyA，本发明还公开了含有该基因的表达载体和宿主细胞及其表达方法。
【背景技术】
[0002] 淀粉是一种碳水化合物，主要W a-D-葡萄糖为单位聚合而成，链平均长度为 500-1000个葡萄糖残基。淀粉中能溶于热水的一部分叫直链淀粉（Amylase)，不能溶解的 叫支链淀粉（Amylopectin)。
[0003] 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的通称，广泛存在于动植物和微生物中。由于淀粉 酶在工农业上的重要价值，因此很早就有人对淀粉酶进行研究。淀粉酶按照水解淀粉方式 的不同大致可分为四大类；（1) a -淀粉酶巧C 3. 2. 1. 1)，它W糖原或淀粉为底物，从分子 内部切开a -1，4糖巧键而使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麦芽糖。（2)目-淀粉酶巧C 3. 2. 1. 2);从底物的非还原末端依次间隔的切开a -1，4糖巧键，因此作用于直链淀粉时所 得的产物为麦芽糖，而作用于支链时只能得到50% -65%麦芽糖，残留下40%左右的极限 糊精。（3)葡萄糖淀粉酶巧C 3. 2. 1. 3):习惯上简称糖化酶，从底物非还原性末端依次水解 a -1，4糖巧键和分支点a -1，6糖巧键，生成葡萄糖。（4)异淀粉酶巧C 3. 2. 1. 9);只水解 糖原或支链淀粉分支点a -1，6糖巧键，切下整个侧枝。
[0004] 从催化专一'性上看，把a -淀粉酶归为糖巧水解酶类（glycosyl hy化ases)的 第13家族，属于a -葡萄糖巧水解酶（a-Glycosyl hy化ases，EC 3. 2. 1)，a -淀粉 酶（a-amylase)又称为液化淀粉酶，其系统名称为a-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶 (€[-1,4-邑111。日]1-邑111。日]1117化〇1日36￡0 3.2.1.1)，常用名（1-淀粉酶，又名（1-1,4糊精酶， 是一种内切酶，能水解淀粉分子中的a -1，4糖巧键，将其任意切成长短不一的短链糊精和 少量的低相对分子质量糖类，直链淀粉和支链淀粉均W无规则的形式进行分解，从而使淀 粉糊的粘度迅速下降，即"液化"起作用，故a -淀粉酶又称为液化酶。
[0005] a-淀粉酶存在于包括人、动物、植物、真菌和细菌等各种生物中。微生物中 會良产生 a-淀粉酉每的属有；Bacillus, Thermomonospor, Acinetobacter, Pseudomonas, StreptomyceSiAspergillus,化nicillus等。目前在工业上大量使用的a-淀粉酶主要 来源于枯草芽抱杆菌度acillus subtilis),地衣芽抱杆菌度acillus Iicheniformis), 解淀粉芽抱杆菌度acillus amyloliquefaciens),黑曲霉（Aspergillus niger)和米曲霉 (Aspergillus oryzae)。其中地衣芽抱杆菌生产的淀粉酶因具有热稳定性而被优先使用。 耐高温的淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此自从1973年开始投入生产W来，被广泛 应用于制糖、酿造、有机酸等W淀粉为原料的深加工工业，是目前工业上用途最为广泛的酶 之一。
[0006] 高温菌是一种极端菌，它们能够适应非常恶劣的自然条件与它们自身带有能够耐 受极端条件的蛋白是非常相关的。
[0007] 鉴于目前耐高温的淀粉酶的需求量大，开发具有耐高温，活性稳定的高温淀粉酶 或生淀粉酶成了当务之急。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种耐高温的淀粉酶，所述淀粉酶选自：
[0010] (a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肤（包含信号肤和成熟多肤）；
[0011] 化）氨基酸序列如SEQ ID NO:2中第35-549位所示的多肤（不包含信号肤，仅为 成熟多肤）；
[0012] (C)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添 加而形成的，且具有（a)或化）多肤的功能的由（a)或化）衍生的多肤。
[0013] 在一个优选例中，所述的耐高温的淀粉酶来源于深海海洋嗜热细菌（Geobacillus sp. 4j)O
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸编码所述的淀 粉酶。
[0015] 在一个优选例中，所述的多核巧酸的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0016] 在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体包含所述的多核巧酸。
[0017] 在一个优选例中，所述的载体是PMD19-T表达载体。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种细胞，其包含所述的载体，或其基因组中整合有所 述的多核巧酸。
[0019] 在一个优选例中，所述的细胞是大肠杆菌ToplO。
[0020] 在本发明的另一方面，提供一种生产所述的a -淀粉酶的方法，包括：培养所述的 细胞，从培养物中分离出表达产物。
[0021] 在一个优选例中，利用信号肤将a -淀粉酶分泌到胞外，采用硫酸倭盐析沉淀、媒 柱纯化的方法分离出表达产物。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物中含有所述的a -淀粉酶；W 及食品学上可接受的载体。
[0023] 在一个优选例中，所述的组合物的抑值为4. 5~7 (较佳地为5~6);或
[0024] 所述的组合物的保存温度为55~8(TC (较佳地为60~70°C );或
[002引所述的组合物中还包括选自下组的金属离子；K\C02\^2\^3+ W及化+。
[0026] 在本发明的另一方面，提供所述的a -淀粉酶的用途，用于水解糖原或淀粉。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种水解糖原或淀粉的方法，所述方法包括：用所述的 a -淀粉酶处理糖原或淀粉。
[0028] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0029] 图1、0D540对还原糖含量线性关系的标准曲线（葡萄糖为标准）。
[0030] 图2、Gs4j-amyA的酶学特性。
[00引](a)抑值对于Gs4j-Amy的影响；
[0032] (b)温度对于Gs4j-Amy的影响；
[003引 （C) 24小时室温储存后重组Gs4j-Amy对于抑稳定性的影响；
[0034] (d)重组Gs4j-Amy的温度稳定性。
【具体实施方式】
[0035] 本发明人经过深入的研究，首次分离获得一种来源于深海海洋嗜热细菌 (Geobacillus SP. 4j)的a-淀粉酶（高温淀粉酶），其具有酶活性高且热稳定性高（耐热 性好）的特点。在此基础上完成本发明。
[0036] 如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核巧酸和蛋白是没有分离纯化 的，但同样的多聚核巧酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。
[0037] 如本文所用，"分离的a -淀粉酶"是指a -淀粉酶基本上不含天然与其相关的其 它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化a-淀 粉酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙帰醜胺凝胶上能产生单一的主带。a-淀粉酶的纯度 能用氨基酸序列分析。
[0038] 如本文所用，所述的amyA、gs4j-amy与gs4j-amyA可互换使用；amyA、Gs4j-amy与 Gs4 j-amyA可互换使用。
[0039] 本发明的a-淀粉酶可W是重组蛋白（多肤）、天然蛋白、合成蛋白。本发明的 a -淀粉酶可W是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿 主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的 宿主，本发明的a-淀粉酶可W是糖基化的，或可W是非糖基化的。本发明的a-淀粉酶还 可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0040] 本发明还包括a -淀粉酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍 生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的天然a-淀粉酶相同的生物学功能或活性的蛋 白。本发明的a-淀粉酶片段、衍生物或类似物可W是（i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的蛋白，而送样的取代的氨基酸残基可W是 也可W不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白， 或（iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白（如前导序列或分泌序列或用 来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白）。根据本文的教 导，送些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0041] 在本发明中，术语"a -淀粉酶"指具有a -淀粉酶活性的SEQ ID N0:2序列的蛋 白。该术语还包括具有与a-淀粉酶相同功能的、SEQ ID N0:2序列的变异形式。送些变异 形式包括（但并不限于）；一个或多个（通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个， 最佳地1-5个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，W及在C末端和/或N末端添加或缺失一 个或数个（通常为20个W内，较佳地为10个W内，更佳地为5个W内）氨基酸。例如，在 本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包 括a-淀粉酶的活性片段和活性衍生物。
[004引该a -淀粉酶的变异形式包括桐源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与a -淀粉酶的DNA杂交的DNA所编码的蛋 白