0:4)，
[0078] PCR 条件为；95°C预变性 5min，随后 95°C 30s、45°C -65°C 30s、72°C Imin 进行 30 个循环，最后在72°C延伸lOmin。
[0079] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在550bp左右有一明亮的特异性条带。将该条带 切下，经琼脂糖凝胶电泳回收后连接PMD19-T载体后采用标准的氯化巧法转入大肠杆菌 ToplO菌株中，涂布于含有硫酸卡郝霉素抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液 体培养基（含硫酸卡郝霉素）中培养，使用通用引物M13进行PCR验证，正确后将阳性转化 子送去测序。
[0080] 通过生物信息学分析该质粒所含的片段确为高温淀粉酶基因的部分序列。将该阳 性转化子命名为pMD19-T-amyA/ToplO,将其含有的质粒命名为pMD19-T-amyAp。
[0081] 实施列2、高温淀粉酶基因 amyA全长的克隆
[0082] 参照基因走读的试剂盒Genome Wa化ing Kit (Takara)说明书的引物设计原则，W 简并PCR获得的同源性较高的淀粉酶基因序列为依据，分别设计出上下游的SP1、SP2、SP3 共6条特异性引物，首轮W Geobacillus SP. 4j基因组DNA为模板，APl (备选AP2、AP3、AP4) 和SPl为引物。第二轮W稀释到合适倍数（通常为1000倍或10000倍）的第一轮PCR反 应液为模板，APl (备选AP2、AP3、AP4)和SP2为引物。第H轮W稀释到合适倍数（通常为 1000倍或10000倍）的第二轮PCR反应液为模板，APl (AP2、AP3、AP4)和SP2为引物。经 过3轮PCR反应，根据序列拼接后的结果重新进行下一轮基因走读，经凝胶电泳后获得高温 淀粉酶基因 amyA的部分序列的上游片段约ISOObp,下游片段约2000bp。将2个片段分别 连接PMD19-T载体后采用标准的氯化巧法转入大肠杆菌toplO菌株中，涂布于含有硫酸卡 郝霉素抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基（含硫酸卡郝霉素）中 培养，使用通用引物M13进行PCR验证，正确后将阳性转化子送去测序。
[0083] 将测序结果与已获得的淀粉酶基因的部分序列进行比对拼接，再通过生物信息学 方法确定高温淀粉酶基因 amyA(后续也称为gs4j-amyA)的开放阅读框，得到高温淀粉酶 基因 amyA的序列（SEQ ID NO: 1)，序列全长1650bp，编码一个含有549个氨基酸的蛋白质 佛Q ID NO:2)。
[0084] 实施列3、高温淀粉酶基因 amyA表达载体的构建
[0085] 根据得到的高温淀粉酶基因 amyA全序列设计如下引物：
[0086] 上游引物 Am-OA-F ; 5 ' -AGCGAGCTCATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTG GTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGCCGCACCGTTTAACG-3' （SEQ ID N0:5)，
[0087] 下游引物 Am-OA-R ;5, -CCCGCTCGAGTAGGCCATGCCACCAAC-3' (SEQ ID N0:6)。
[008引其中，上游引物中包含了大肠杆菌外膜蛋白信号肤ompA的编码序列。
[0089] 用PCR扩增得到高温淀粉酶基因 amyA全序列。该PCR条件为95°C预变性5min， 随后95°C 30s、48°C 30s、72°C Imin进行32个循环，最后在72°C延伸IOmin。琼脂糖凝胶电 泳显示1700bp左右处有一特异性条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，用Seal和化Ol酶切，琼 脂糖凝胶电泳回收1700bp左右的DNA片段。
[0090] 将大肠表达载体祀1'-283同样用5。曰1和化〇1酶切，琼脂糖凝胶电泳回收53006口 的DNA片段，将其与上述所得1700bp的的DNA片段连接后，按照标准的氯化巧法转化入大 肠杆菌ToplO中，筛选具有硫酸卡郝霉素抗性的转化子。LB液体培养基（含硫酸卡郝霉素） 中培养后使用通用引物Ml3进行PCR验证，PCR验证程序为95 °C预变性5min，随后95 °C 30s、 48°C 30s、72°C Imin进行30个循环，最后在72°C延伸IOmin。琼脂糖凝胶电泳显示在2000bp 左右有正确条带的为阳性转化子，将对应的正确的菌株送测序，测序显示序列正确，质粒构 建正确。将该阳性转化子命名为祀T28a-amyAp/ToplO,含有的质粒命名为祀T28a-amyAp。
[0091] 实施例4、高效表达高温淀粉酶的大肠杆菌工程菌株化21/pET28a-〇mpA-gs4j-amy 的构建
[0092] 将表达载体祀T28a-〇mpA-gs4j-amy按照标准的氯化巧法转入大肠杆菌E. coli BL2UDE3)中，筛选具有硫酸卡郝霉素抗性的转化子。LB液体培养基（含硫酸卡郝霉素）中 培养后使用通用引物M13进行PCR验证，PCR验证程序为95°C预变性5min，随后95°C 30s、 48°C 30s、72°C Imin进行30个循环，最后在72°C延伸IOmin。
[0093] 琼脂糖凝胶电泳显示在2000bp左右有正确条带的为阳性转化子，将阳性转化子 命名为 I3L21/pET28a-〇mpA-gs4j-amy。
[0094] 实施例5、利用大肠杆菌重组株化21/pET28a-〇mpA-gs4j-amy生产重组a -淀粉酶
[0095] 挑取化21/pET28a-〇mpA-gs4j-amy重组菌株单克隆于IOml LB培养基中（卡纳霉 素50 U g/ml)，37°C培养直到菌液浓度ODe。。达到1. 0左右，取Iml菌液W 2%的接种量接种 于50ml LB培养基中（卡纳霉素50 U g/ml)，37°C培养化左右直到菌液浓度ODe。。达到0. 6 左右，向培养液中加入IPTG诱导菌体表达，IPTG的终浓度为1mmol/l，37°C培养4她。
[0096] 实施例6、amyA蛋白纯化和酶活测定
[0097] 前述成功构建了菌株化21/pET28a-〇mpA-gs4j-amy，该菌株高效表达Gs4j-amyA。 Gs4j-amyA在大肠杆菌外膜蛋白信号肤ompA的作用下分泌到胞外，纯化时选择硫酸倭盐析 的方法获得粗酶沉淀，然后通过媒柱金属莖合层析进行纯化。
[009引 蛋白纯化平衡缓冲液；10mmol/L磯酸二氨钢，lOmmol/L磯酸氨二钢，0. 5mol/L 化Cl，20mmol/L咪哇，pH 7.4。蛋白纯化洗脱缓冲液；10mmol/L磯酸二氨钢，lOmmol/L磯酸 氨二钢，0. 5mol/L化Cl，500mmol/L咪哇，pH 7. 4。所有的蛋白纯化缓冲液均需要0. 45ym 滤膜过滤后使用。透析缓冲液为去除咪哇的蛋白纯化平衡缓冲液。
[0099] 1、硫酸倭盐析法获取Gs4 j-amyA粗酶液
[0100] BL21/祀T28a-〇mpA-gs4j-amy能很好实现两种淀粉酶的分泌表达，按照前述方法 培养，IPTG诱导4化产生的发酵上清液，加入适量硫酸倭使得上清酶液达到一定饱和度，过 夜并间断揽拌，使得蛋白沉淀下来。然后于5000;r/min，4°C离必IOmin,将上清和沉淀分离， 沉淀用Iml磯酸盐缓冲液溶解，制成共IOml粗酶液，粗酶液经过截留分子量为30KDa透析 袋在透析缓冲液中透析36h，每1化更换一次缓冲液，除去大部分硫酸倭盐分，透析过程中 有部分蛋白沉淀，体积增大到15ml，通过离必除去蛋白沉淀，然后用0. 45 Um滤膜过滤后用 做后续纯化的粗酶液。为了确定盐析过程较合适的硫酸倭饱和度，各取Iml上清粗酶液， 缓慢加入硫酸倭分别使相应的饱和度为20% -90% (饱和度100%对应的硫酸倭含量为 707g/L)，500化/min，4°C离必15min将盐析上清和盐析沉淀尽量分离，然后盐析沉淀用Iml 的PBS重悬，测定盐析上清和盐析沉淀的蛋白含量和酶活。
[010。 2、Gs4j-amyA粗酶液的媒柱纯化
[0102] 配制平衡缓冲液、洗脱缓冲液，0. 45 U m滤膜过滤后超声30min方可使用。采用媒 NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，洗脱时用含50~500mmol/L咪哇的洗脱液分阶段洗脱，各洗脱 2个柱体积。收集的部分测定酶活并测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分通过蛋白电泳检测 纯度。
[0103] 3、酶活和蛋白测定
[0104] 淀粉酶活力W水解产生一定还原糖所需的酶量来表征，还原糖的测定采用DNS 法。绘制标准曲线：取7支试管，标记为0、1、2、3、4、5、6，按表2.1在冰水浴中配制成总体 积800 U L的溶液。
[0105] 各管摇匀，从冰水浴中转移到沸水浴中，等到沸腾后精确计时反应5min，放入冰水 浴中冷却后加去离子水6ml，混匀再用分光光度计测定540nm处的吸光值，空白为0号管。 W葡萄糖含量（mg)为横坐标，0化4。为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线（图1)，算出计算公式。 反应体系中还原糖含量（mg)=稀释倍数X (Asw+0.00 54)今1. 1787。
[0106] 由于测定的粗酶液中（发酵上清液或菌体破壁液）含有还原糖，且1 % (w/v)的可 溶性淀粉底物中也有部分还原糖。因此酶活力测定时要去除送两方面的影响。1% (w/v) 的淀粉底物的配制；将1% (w/v)的可溶性淀粉糊化后溶解到抑7. 50含有0. 05mol/L磯 酸氨二钢的巧樣酸液中，揽拌均匀，12(TC灭菌20min后4°C保存。
[0107] 表2、还原糖的标准曲线测定步骤 [010 引
[0109] 总反应产生的还原糖：取若干试管标记，吸取1 % (w/v)的淀粉底物 280 U 1 (抑7. 50)，放入6(TC恒温水浴预热IOmin。然后将粗酶液（新鲜菌液SOOOg离必3min 后的发酵上清液）20 U 1加入试管中，立即混匀，精确反应lOmin。反应后，将反应试管立即 转移到冰水浴中，立即加入200 U 1去离子水和300 U 1的DNS试剂，混合均匀。然