一种环己酮单加氧酶及其在合成埃索美拉唑中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种环己丽单加氧酶，生产该环己丽单 加氧酶的基因工程菌的构建，该环己丽单加氧酶的生产及应用。
【背景技术】
[0002] 质子泉抑制剂（proton pump inhibitors, PPIs)用于治疗酸相关性疾病，是近十 几年来临床应用广泛、疗效最好的药物。PPIs即H7K+-ATP酶抑制剂，其抑酸作用强，特异 性高，持续时间长久。胃酸分泌的最后步骤是胃壁细胞内质子泉驱动细胞内H+与小管内K+ 交换。研究认为；血液中的PPIs进入胃壁细胞后聚集在强酸性的分泌小管中，转化为活性 的次礙醜胺类化合物，与质子泉的半脫氨酸残基上的硫離共价结合，形成二硫键，使质子泉 失活，从而抑制中枢或外周介导的胃酸分泌。与W往临床应用的抑制胃酸药物肥受体枯抗 剂相比较，作用位点不同且有着不同的特点，即夜间的抑酸作用好、起效快，抑酸作用强且 时间长、服用方便，所W能抑制基础胃酸的分泌及组胺、己醜胆碱、胃泌素和食物刺激引起 的酸分泌。
[0003] PPIs已经成为治疗胃酸异常分泌及相关疾病的一线用药。传统的质子泉抑制剂 为弱碱性的苯并咪哇化合物，如奧美拉哇、兰索拉哇、雷贝拉哇及泮巧拉哇。后期的研究主 要集中在延长单次给药的抑酸持续时间。埃索美拉哇是奧美拉哇的S异构体，是第一个发 展为异构体的质子泉抑制剂。后来陆续发现了右兰索拉哇、左旋泮巧拉哇。2010年，全球 PPIs的销售额达到139亿美元，高居药物销售额第H位。
[0004] 中国专利文献CN1157614中公开了一种在有机溶剂中在由铁（IV)化合物和手性 支链或非支链烷基二元醇或芳族醇制得的手性铁配合物和有机碱存在下，用过氧化氨类衍 生物氧化前手性硫離而制得埃索美拉哇的方法。
[0005] 中国专利文献CN101098867中公开了一种在碱和手性铁配合物存在下利用氨过 氧化物氧化前手性硫離制备艾普拉哇的方法。
[0006] 中国专利文献CN1193971公开了将奧美拉哇、兰索拉哇或雷贝拉哇在水与有机溶 剂的混合溶液中提纯出对映体含量高的S-或R-构型的方法。
[0007] 上述合成单一构型的化合物制备工艺均存在利用拆分工艺收率较低、成本较高、 或需要使用价格昂贵的贵金属催化剂等缺点。
[0008] 硫離单加氧酶是一类依赖于黄素的单加氧酶，可W活化利用H线态的氧气分子， 使硫離氧化成手性的亚讽。该过程需要还原态的黄素辅酶（FADHz或者FMNH2)，反应结束后 辅酶转变为相应的氧化态FAD+或者FMN+，后者在NADPH的存在下转变成对应的还原型辅酶， 实现辅酶再生。反应同时还产生了一个电〇2,对酶活不利，因此需要加入过氧化氨酶使之消 除。机理如下：
[0009]
[0010] 采用生物氧化法制备亚讽具有立体选择性好，过度氧化副产物低，绿色环保等优 点而受到关注。美国专利文献US5840552中披露了用微生物催化的不对称氧化合成S-奧 美拉哇的方法，青霉菌和不动杆菌均表现出较好的转化能力和立体选择性；US20130017580 披露了用不动杆菌来源的氧化酶催化的不对称合成S-奧美拉哇的方法，但是底物投料浓 度仅有50g/L，且酶的热稳定性较差，25C反应速度慢，40小时W上才能转化彻底，难W放 大生产。
[0011]
【发明内容】
[0012] 针对现有技术中合成拉哇类药物采用的拆分工艺中收率较低，W及采用贵金属催 化工艺中成本较高、收率较低及后处理难W进行等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应 收率高、对环境友好的环己丽单加氧酶进行不对称氧化反应合成单一构型的拉哇类药物。 本发明还提供了该环己丽单加氧酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体 及该环己丽单加氧酶的高效制备方法，W及该环己丽单加氧酶在催化前手性硫離化合物成 单一构型的亚讽中的用途。
[0013] 本发明通过下述技术方案W解决上述技术问题：
[0014] 本发明的第一方面提供了一种分离的环己丽单加氧酶，其是如下（a)、化）或（C) 的蛋白质：
[0015] (a)由SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[001引 SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有氧化硫離的功 能，是一种新的环己丽单加氧酶。
[0017] 化）在（a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的 具有环己丽单加氧酶活性的蛋白质。
[001引其中，所述的"几个"是指2个至小于100个，更佳的是10个。比如添加一个外分 泌信号肤的融合蛋白，本发明发现送样的融合蛋白同样具有环己丽单加氧酶活性。也就是 说，只要由（a)衍生的蛋白质具有环己丽单加氧酶活性，且衍生方式如上所述，都可W达到 本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的蛋白质分子中进行 1~5个氨基酸残基的突变，仍然保持环己丽单加氧酶活性。
[001 引（C)和（a)的氨基酸序列具有至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具有环己 丽单加氧酶活性的蛋白质。
[0020] SEQ ID No:2所示的环己丽单加氧酶和已知的环己丽单加氧酶序列具有显著的差 异性，例如与不动杆菌来源的CHMO之间的同一性为80%。
[0021] 在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBI Bias化程序进行比对，默认参数。
[0022] 本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的环己丽单加氧酶。 优选地，所述核酸是由SEQ ID No: 1所示核巧酸序列组成的。
[0023] SEQ ID No: 1所示的核巧酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可^从±壤样本中 分离获得，也可W从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可W全基 因人工合成获得。
[0024] 本发明中，SEQ ID No:l所示的基因命名为BYKY-M0,全长1629bp。其中，其编码 序列（CD巧从第1个碱基起至第1626个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该 序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo:2所示。
[00巧]如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No:2的氨基酸序列的 核巧酸序列不仅仅局限于SEQ ID No: 1。本发明的环己丽单加氧酶基因的核巧酸序列也可 W是编码序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的其他任何核巧酸序列。另外，还可W通 过适当引入替换、缺失或插入来提供多聚核巧酸的同系物。本发明中多聚核巧酸的同系物 可W通过对核巧酸序列SEQ ID No:l的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺 失或添加来制得。
[0026] SEQ ID No: 1的同系物也指启动子变体。在所述的核巧酸序列之前的启动子或信 号序列可通过一个或多个核巧酸的替换、插入或缺失而改变，但送些改变对启动子的功能 没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子 完全替换，可提局目标蛋白的表达水平。
[0027] SEQ ID No: 1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No: 1所示序列的多聚 核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的 方式进行；Cold Spring Harbor L油oratory Press,分子生物学中的通用方案（Qirrent Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可W按照如下步骤进行；将一个载有 被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲 液的组成为0.1 wt% SDS、5wt%硫酸右旋糖巧、一盒1/20的稀释抑制剂W及2~8XSSC ; 20 X SSC为3M氯化钢和0. 3M的巧樣酸组成的溶液；杂交温度为50~70°C ;在培养几个小 时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组 成为6 X SSC+0.1 wt % SDS溶液，更优选为5 X SSC+0.1 wt % SDS ;当用送种清洗缓冲液清洗 完膜后，就可W通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
[0028] 本发明的第H个方面提供了一种包含本发明的环己丽单加氧酶基因的重组表达 载体。其可通过本领域常规方法将本发明的环己丽单加氧酶基因或其突变体的核酸序列连 接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质 粒、粘粒、瞻菌体或病毒载体等，优选质粒载体。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组 表达载体；将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体祀T28a分别用NdeI和化ndllI 酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的环己丽单加氧酶基因 的重组表达质粒祀T28a-BYKY-M0或含有编码其突变体的核酸序列的重组表达质粒。
[0029] 本发明的第四个方面是提供一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。 可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规 的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的环己丽单 加氧酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌化COli)，更优选E. COli BL21 〇)E3)。 将前述重组表达质粒BYKY-MO或其突变体转化至E. COli BL2UDE3)中，即可获得本发明优 选的基因工程菌株，即E. COli化21 0E3)/祀T28a-BYKY-M0或其突变体。转化方法可选择本 领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是： 42 °C，热击45砂。
[0030] 本发明的第五个方面是提供一种重组环己丽单加氧酶的制备方法，其包括如下的 步骤；培养本发明的重组表达转化体，W及从培养物中获得重组环己丽单加氧酶。
[0031] 本发明中催化硫離进行氧化反应形成亚讽的催化剂，可W是上述产生重组环己丽 单加氧酶的转化体的培养物，也可W是通过将该培养物离必分离后得到的转化体细胞或者 用其加工的制品。送里"加工的制品"是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的环 己丽单加氧酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物 或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
[0032] 本发明的第六个方面提供了一种本发明的环己丽单加氧酶或重组环己丽单加氧 酶在催化奧美拉哇硫離进行氧化反应形成埃索美拉哇中的应用。
[0033] 所述的奧美拉哇硫離如下式I所示：
[0034]
[0035] 所述的奧美拉哇硫離化合