专利名称：重组七鳃鳗鳗溶素、制备方法及在制备抗血栓药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种属于医药与医学工程领域，尤其是一种可阻断血栓形成且有效剂量低、安全范围大、作用强度高、不良反应轻以及低毒的重组七鳃鳗鳗溶素的制备方法及在制备抗血栓药物中的应用。
背景技术：
正常情况下，体内止血、凝血系统与纤溶系统处于生理性平衡，保持正常血流状态。但在一些病理情况下，如血管内膜损伤或静脉血流阻滞时，由于血小板活化并粘附到内皮下组织，进而引发一系列止血、凝血过程，最后形成了血栓。血栓的主要成分是由活化的血小板和纤维蛋白组成。因此，特异的抗活化血小板和抗纤维蛋白的药品可以作为血栓导向剂。目前所研制的血小板抗体主要是针对活化血小板上两个主要位点而制备的
(I； GPIIb-IIIa D GMP140.而最有效的抗血小板药物就是GPIIb- IIIa拮抗剂，因为不管
通过什么受体，什么代谢途径，血小板最后必须通过GPIIb- IIIa复合物的纤维蛋白原受体，才能发生“聚集”而形成血栓。目前，称为“抗血小板药物”的一类药物已经被作为治疗血栓性疾病的有效手段在临床上得到广泛应用，如阿斯匹林等。然而，阿司匹林抗血小板作用的特点是小剂量时抗血小板聚集，产生抗血栓作用；而大剂量时促进血小板聚集，产生促进血栓形成作用。另外，随着阿司匹林长期应用而带来的“阿司匹林抵抗”亦愈来愈限制其抗血栓的临床应用。日本七鳃鳗(lampetra japonica)属圆口纲(O^^xsioaaia)、七鳃鳗目、七鳃鳗科、七鳃鳗属，是迄今发现的最古老的无颂脊椎动物。其为海洋洄游性鱼类，成体生活在海洋，经常用吸盘附在其它鱼体上吸食其血与肉，使被吸附的鱼血流不止，日本七鳃鳗的这种独特生活习性暗示着其口腔腺中必定具有强效抗凝物质。但是，迄今为止还没有以日本七鳃鳗口腔腺为原料，制备抗血栓药物的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可阻断血栓形成且有效剂量低、安全范围大、作用强度高、不良反应轻以及低毒的重组鳗溶素蛋白、制备方法及在制备抗血栓药物中的应用。本发明的技术解决方案是一种重组七鳃鳗蛋白-鳗溶素，其特征在于将七鳃鳗鳗溶素基因构建于pET28a(+)载体，并对其在大肠杆菌中进行了高效诱导表达的产物，所述鳗溶素cDNA序列351bp长，蛋白由117个氨基酸组成，cDNA及氨基酸序列如下
1
tea acg ttc ate aac gga acc cag gaa gtg gat gcc att tgt cat aag48
权利要求
1.一种重组七鳃鳗鳗溶素蛋白，其特征在于是将七鳃鳗鳗溶素基因构建于pET28a(+) 载体，并对其在大肠杆菌中进行了高效诱导表达的产物，所述鳗溶素cDNA序列351bp长， 蛋白由117个氨基酸组成，cDNA及氨基酸序列如下
2.一种如权利要求1所述重组七鳃鳗鳗溶素的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.制备鳗溶素基因(1)取日本七鳃鳗口腔腺迅速置于液氮中保存；(2)称取0.2g七鳃鳗口腔腺，加Iml TRIzol试剂制备毒腺勻浆，4°C孵育5min ；(3)加0.2ml氯仿，盖紧盖后振摇15sec，然后置于冰上5min ；(4)4°C，12000xg，离心 15min ；(5)将上层水相移入另一离心管，加0.5ml异丙醇，并在冰上孵育IOmin ；(6)4°C，12000xg，离心 15min ；(7)弃上清，在沉淀中加Iml75%乙醇洗涤，旋涡混勻；(8)4°C, IOOOOxg离心5min，得到七鳃鳗蛋白鳗溶素的RNA沉淀；(9)空气干燥后，用TE或无RNase水溶解RNA备用；b.进行RT-PCR扩增，获得目的cDNA；RT-PCR扩增的具体操作条件是42°C 20min,99°C 5min,5°C 5min进行反转录反应；弓I物序列如下Pl: 5，-XXcatatgtcaacgttcatcaacggaacc-3，； P2 5' -XXaagcttctccccaacacattcactcac-3'；c.将获取的目的cDNA与pETj8a(+)载体相连接，转化入克隆菌Dffia后进行阳性转化子的筛选鉴定；具体操作如下(1)目的基因的回收目的基因的回收采用TaKafciPCR Fragment Recovery Kit进行；(2)质粒的提取采用质粒提取试剂盒进行；(3)目的基因DNA片段与载体pETj8a(+)以Mfe I ^WHind III双酶切，以T4 DNA Ligase进行16°C过夜连接，将目的基因与pET48a (+)相连；(4)将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E.coli DH5a中；(5)阳性转化子的筛选鉴定利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定；d.将鉴定的阳性重组子&(12法转化至表达菌E.c^iBL21中，进行终浓度为lmmol/ L的IPTG诱导表达，诱导表达条件为30°C低温过夜诱导，表达产物为重组七鳃鳗RGD毒素蛋白，命名为鳗溶素。
3. 一种如权利要求1所述重组鳗溶素在制备抗血栓药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种重组七鳃鳗鳗溶素蛋白、制备方法及在制备抗血栓药物中的应用。重组鳗溶素蛋白是将七鳃鳗蛋白鳗溶素基因构建于pET28a(+)载体，并对其在大肠杆菌中进行了高效诱导表达的产物，所述鳗溶素cDNA序列351bp长，蛋白由117个氨基酸组成，可与血小板细胞膜上糖蛋白GpⅡb／Ⅲa专一性结合而竞争性拮抗纤维蛋白原与血小板的结合，防止血小板活化和GPIIb/IIIa受体构象的改变，阻断受体与多种配体的结合，从而抑制血小板聚集的最终共同通路以阻断血栓形成，具有显著抗栓作用。
文档编号A61P7/02GK102212125SQ20111010142
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者吕莉, 张艳, 李庆伟, 王继红 申请人:辽宁师范大学