专利名称:重组杆菌溶素的表达和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
。具体地，本发明涉及一种重组蛋白的表达和应用。
技术背景
杆菌溶素的定义是在中性(pH值在7附近)条件下具有分解蛋白质的一类酶的总称。其来源为大肠杆菌，本发明中的杆菌溶素基因来自芽孢杆菌属。杆菌溶素蛋白分子量约为35KDa，最佳PH值为7. 0。杆菌溶素的用处非常广泛，本发明中的杆菌溶素是用于糖化血红蛋白检测试剂盒。这就需要从这一类的蛋白酶中选取能特异性的切割糖化血红蛋白的 β链N-末端糖化缬氨酸残基的杆菌溶素酶。
血糖试剂盒中包含有两种酶杆菌溶素和果糖缬氨酸氧化酶。反应原理是首先用杆菌溶素把糖化血红蛋白β链N-末端的糖化缬氨酸残基切割下来，然后糖化的缬氨酸作为果糖缬氨酸氧化酶的反应底物，被特异性地清除N-末端的氨基酸并且产生过氧化氢，然后通过检测过氧化氢的量计算血糖的浓度。糖化血红蛋白检测试剂盒是用于检测人全血中的糖化血红蛋白的浓度。
糖尿病及其并发症是危害我国人体健康的重要疾病，也是我们日常生活中常见的一种难以完全治愈的疾病，近年来其发病率持续增高，一旦患病，会给人们甚至是整个家庭的幸福罩上极大的阴影。中国中医科学院糖尿病研究总院，通过对近5万名20岁以上的人群进行血糖检测，糖尿病的总患病率已达11.观％。因此对其进行诊断、检测和治疗具有重要意义，也必定会带来不容忽视的市场价值。
糖化血红蛋白(HbAlc)则是血液中与葡萄糖结合了的那部分血红蛋白，是β链N 端缬氨酸与葡萄糖进行的非酶缩合反应，先形成不稳定的Shiff碱，然后经过Amadori重排，形成稳定的酮氨化合物，它们的结合缓慢而不逆。HbAlc不受血糖浓度暂时的波动的影响，可以反映测定前8-12周血糖的平均水平，与抽血时间，患者是否空腹，是否使用胰岛素等因素都无关，因而是判定糖尿病长期控制的良好指标。在国外，已经将HbAlc监测作为糖尿病治疗判定和调整治疗方案的“金标准”。非糖尿病人的HbAlc为4-5. 5%，老年人在 7. 0-7. 5%为正常值。
杆菌溶素基因分为两部分，前面的分泌肽和后面的成熟肽部分，分泌肽的作用是使细胞内生成的杆菌溶素分泌到胞外。现有技术中的生产杆菌溶素的方法都是将杆菌溶素的基因全部表达，因为杆菌溶素对细胞有毒性，所以细胞为了生存，表达杆菌溶素的量很小，以便尽可能降低对细胞的毒害，并且因为是分泌到胞外的培养液中，所以表达出来的杆菌溶素浓度低，并且难以进一步浓缩。另外，现有技术的方法一般通过对芽孢杆菌发酵生产再纯化的方法制备产品的，例如申请号200810234458. 8 (公开号CN 101407800A，
公开日2009年4月15日)的中国专利申请中记载“本发明是一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌Ll_9(Paenil3acillus polymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶方法，其步骤包括菌株活化、种子液的制备、产酶培养基的制备和产酶发酵培养和粗酶液的制备。”这类方法一般纯度低，成本高。因此，需要对杆菌溶素的基因和表达进行进一步研究以提供获得杆菌溶素的新方法。
发明内容
本发明运用基因工程技术只截取杆菌溶素基因中的成熟肽部分，去掉分泌肽部分，表达纯化大量稳定的重组杆菌溶素包涵体，并对其进行复性，得到了有活性的稳定的杆菌溶素。因此，本发明提供一种杆菌溶素基因和该基因表达的重组蛋白及其制备方法。通过本发明的方法得到的杆菌溶素具有易纯化、产量大、活性高的特点。
因此，本发明一方面提供一种截短芽孢杆菌的杆菌溶素基因，该基因具有如SEQ ID NO :1所示的核酸序列。
SEQ ID NO 1
agtcgccggcacgtcgacggtcggcgtgggccgcggtgtgttgggggatcagaaatatatcaatacgac gtattcctcgtattatggctactactatttgcaagacaatacgcgcggcagcggcatttttacgtatgacggacgaa accgcaccgttttgcccggcagcttgtgggccgatggcgacaaccaatttttcgccagctatgacgcggcggccgtg gacgcccattattacgccggcgtcgtgtatgattactacaaaaatgtgcacggccggctgagetatgacggcagcaa cgccgccatccgttcgaccgtccattatggccgtggctacaacaacgcgttttcgaacggttcgcaaatggtgtacg gcgatggcgacggacagacgtttttgccgttttccggcggcattgacgtcgtggggcatgagttgacccatgcggtg acggattatacggccgggcttgtttaccaaaacgaatccggcgccatcaatgaagcgatgtccgatattttcggcac gctcgtggagttctacgccaaccgcaacccggactgggagatcggcgaagacatttacacgcctggggtcgccggcg atgcggtccgctcgatgtccgacccggcgaaatacggcgatccggatcattattccaaacggtacaccggcacgcaa gacaacggcggcgtccatacgaacagcggcatcatcaataaagccgcgtacttgctcagccaaggcggcgtccatta cggcgtgagcgtcaccggcatcggccgcgacaatatggggaaaattttctaccgggcgcttgtctactatttgacgc cgacgtcgaacttcagccagctgcgcgccgcctgcgtgcaagcggccgctgatttgtacgggtcgacaagccaagaa gtcaactcggtgaaacaggcgttcaatgcggttggagtgtattaa
本发明另一方面提供一种截短芽孢杆菌的杆菌溶素蛋白，该蛋白具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO 2
VAGTSTVGVGRGVLGDQKYINTTYSSYYGYYYLQDNTRGSGIFTYDGRNRTVLPGSLWADGDNQFFAS YDAAAVDAHYYAGVVYDYYKNVHGRLSYDGSNAAIRSTVHYGRGYNNAFWNGSQMVYGDGDGQTFLPFSGGIDVVG HELTHAVTDYTAGLVYQNESGAINEAMSDIFGTLVEFKANRNPDffEIGEDIYTPGVAGDALRSMSDPAYY⑶PDH YSKRYTGTQDNGGVHTNSGIINKAAYLLSQGGVHYGVSVTGIGRDKMGKIFYRALVYYLTPTSNFSQLRAACVQA AADLYGSTSQEVNSVKQAFNAVGVY
本发明还提供一种制备重组杆菌溶素的方法，包括以下步骤
1)根据SEQ ID NO 1所示的核酸序列进行全基因合成，从而得到SEQ ID NO=I所示的核酸序列的截短芽孢杆菌的杆菌溶素基因；
2)用步骤1)获得的核酸序列与表达质粒进行重组，对重组子进行验证(例如DNA 测序)以确定重组表达质粒的序列正确；
3)用步骤2、获得的重组表达质粒转化宿主细胞；
4)培养宿主细胞获得杆菌溶素包涵体蛋白；
5)将步骤4)得到的杆菌溶素包涵体蛋白通过复性液进行复性，得到有活性的可溶的重组杆菌溶素。
本发明还提供一种对包涵体进行复性的复性液，该复性液包含 IMTris-Cl (ρΗ7· 5)，50mM ZnCl2, IOOmM CaCl2,0. 25M Argo
优选地，在本发明的步骤幻中使用上述复性液。
本发明不限于特定的表达载体。优选地，本发明中使用的表达载体为能与杆菌溶素基因序列重组并形成表达质粒的表达载体。优选地，使用的表达载体为原核表达载体，表达出来的杆菌溶素为包涵体形式。优选地，原核表达载体为pET28b。
本发明不限定特定的宿主细胞。优选地，本发明中使用的宿主细胞为能够表达重组表达质粒的宿主细胞，且具有校正大肠杆菌密码子偏好性的特征。优选地，本发明中使用的宿主细胞为大肠杆菌Rosetta garni II (DE3)。
在本发明中，优选地培养宿主细胞的培养基为含抗生素基础培养基，培养温度为 35°C 37°C，培养时间为4 5小时，诱导温度为35°C 37°C，诱导时间为3 5小时，诱导物IPTG终浓度为0. 5 ImM。
筛选宿主细胞中高效表达的阳性表达菌株作为工程菌，重组杆菌溶素蛋白通过工程菌株诱导培养后离心收集菌体，超声破碎后离心收集沉淀清洗后得到包涵体蛋白，之后进一步复性得到。
本发明中，杆菌溶素活性的定义是在pH值7. 0和40°C条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μ g酪氨酸定义为一个酶活力单位，优选地，使用的活性的测定方法是取杆菌溶素溶液200μ 1，以浓度为2%酪蛋白底物缓冲液为底物，40°C恒温水浴20min，加入福林-酚试剂 Iml保温显色20min后，在波长660nm处进行比色测定，对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
本发明的方法与现有技术的方法相比具有很多优点1.方法简单，并且产量大。 因为本发明的方法中的杆菌溶素在细胞内聚集成包涵体形式，包涵体形式的蛋白没有生物活性，所以可以大量表达，获得很高的产量。而且直接将细胞破碎，即可得蛋白，方法简单。 2.易纯化，纯化出来的产品纯度很高。本发明的方法得到的杆菌溶素是包涵体蛋白，所以非常容易纯化。3.复性后的杆菌溶素的活力很高。本发明提供的复性液对杆菌溶素的复性可以起到很好的作用。
本发明运用基因工程技术表达纯化大量稳定的重组杆菌溶素蛋白，解决了糖化血糖检测试剂盒自主研发的瓶颈问题。
图1是纯化后的重组杆菌溶素。
图2是测定杆菌溶素的活性的标准曲线。
图3是根据本发明制备的杆菌溶素与现有技术的杆菌溶素的纯度比较。1 分子标记；2 对照产品A ；3 对照产品B ；4 本发明产品。
具体实施方式
实施例1 制备重组杆菌溶素蛋白
(1) PET28b-npr 载体的构建
根据SEQ ID NO 1序列(该序列来自于芽孢杆菌Bacillus caldolyticus，可从NCBI的genebank中获得，其基因序列号P23384，委托北京三博远志生物技术公司进行全基因合成，并且在序列两端分别加上Nde I和HindIII两个酶切位点，三博远志将合成的基因序列插在一个质粒上，首先，我们用Nde I和HindIII两个限制性内切酶将基因片段切下来，再用这两个酶去双酶切表达载体质粒pET28b (Novagen)，之后，用连接酶将这基因片段和空质粒连接起来，再将连接产物转化入DH5 α细胞里，之后，提取质粒，经过酶切鉴定后， 将构建好的表达载体转化入宿主菌Rosetta garni II (DE3)(购自Novagen)中。
(2) pET28b-npr 的表达
将带有pET28b-npr的菌株在LB培养基中表达。具体步骤a.取-72 °C保存的pET28b-npr菌株，在无菌条件下，用接种环挑取少许菌种，划平板，37 °C过夜培养单菌落。b.次日，挑取单菌落，转接入LB液体培养基(每个单菌落，接种5mlLB培养基)中， 37°C 200rpm过夜培养。c.第三日，取培养的菌体按1 %的接种量转接入LB液体培养基中， 370C 220rpm培养3-3. 5小时至0D600于0. 8左右，加入至终浓度为ImM的IPTG，37°C 220rpm 诱导4h。
(3)细胞的超声破碎
操作步骤a.将诱导完的500ml菌体离心，8000rpm 5min。b.将菌体加入 SOml1Tris-HCL充分重悬置于冰上，50%功率，5s/^s超声30min。c.将超声破碎完毕的菌体离心，15000rpm 40min，沉淀为BAC包涵体蛋白。d.将离心所得的上清和沉淀作SDS-PAGE 电泳，考察超声破碎菌体的情况。
(4)包涵体蛋白的洗涤
用40mlTris-CL缓冲液去充分悬浮沉淀，再超声5min，功率50%，k/5s，然后离心 15000rpm 20min
重复上面步骤两次，最后一次不用超声。
(5)包涵体蛋白的溶解
溶液准备
a. 6M的盐酸胍缓冲液称取574g盐酸胍溶于500mlIOOmMTris-CL(ρΗ8. 0)缓冲液，充分搅拌溶解，最后定容体积至1L。
b. 3M的盐酸胍缓冲液称取盐酸胍溶于500mlIOOmMTris-CL(ρΗ8. 0)缓冲液，充分搅拌溶解，最后定容体积至1L。
操作步骤向装有包涵体蛋白的50ml离心管中加入30ml的6M盐酸胍缓冲液，放在振荡摇床上，充分振荡30分钟。待包涵体蛋白完全溶解后，15000转离心30分钟，倒出上清。
将上清倒入透析袋里，将透析袋放入3M的盐酸胍缓冲液透析过夜。
(6)蛋白复性
溶液准备
复性液:1MTris-Cl (ρΗ7· 5), 50mM ZnCl2, IOOmM CaCl2,0. 25MArgo
具体步骤将在3M盐酸胍缓冲液透析过夜过的蛋白溶液取出来，测试其蛋白浓度，计算蛋白溶液中的蛋白含量，并按照蛋白量复性液体积=0. Img Iml的比例配制复性液。
稀释复兴准备一个滴定漏斗，并将漏斗固定在铁架子上，之后，将它们放入4°C
6层析冷柜中。在滴定漏斗中的塞子堵紧后，将蛋白溶液加入漏斗中，在漏斗下方放好配制好的复性液，在复性液里放入一个转子，并在复性液下方放上磁力搅拌器，打开搅拌器，使复性液旋转起来，这些都准备妥当后，缓慢旋转滴定漏斗上的塞子，使漏斗中的蛋白溶液以尽可能慢的速度滴入下方的复性缓冲液中。这样做的目的是使蛋白复性尽可能的充分完全。 蛋白溶液滴定完后，要继续复性至少M小时。
(7)蛋白浓缩
蛋白复性后，体积过大，因此需要浓缩，利用超滤系统将蛋白复性液浓缩至 200ml-300ml 左右。
实施例2 杆菌溶素活性检测
1、试剂准备
福林-酚试剂可直接购买
0. 4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液称取6. Mg，加去离子水定容体积至100ml，棕色
瓶避光保存。
0. 4mol/L碳酸钠溶液4. 24g碳酸钠，加去离子水定容体积至100ml。
2%酪蛋白底物缓冲液称取酪蛋白2g，置于IOOml三角瓶中，加入0.2mol/ LNa2HP0461ml，沸水浴中搅拌溶解，充分溶解后冷却过滤，之后加入39ml0. 2mol/L Na2HPO4, 混合均勻，即成PH7. 0的2%酪蛋白底物缓冲液
0. lmol/L盐酸1ml浓盐酸加水稀释成125ml的溶液。
标准酪氨酸溶液(300 μ g/ml)精确称取0. Ig酪氨酸，逐步加入0. lmol/L盐酸溶解后，用去离子水定容体积至IOOml放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释成300 μ g/ ml ο
2、操作步骤
酪氨酸标准曲线的绘制
取18个2ml离心管，分成6组(每组3个，平行样)，编号，按下表分别加入标准酪氨酸、去离子水、0. 4mol/L碳酸钠溶液和福林-酚试剂，混勻后，放入40°C水浴保温20min， 然后在分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0 μ g/ml酪氨酸溶液做空白对照。最后，以酪氨酸浓度为X轴，以读值为Y轴，画标准曲线。
权利要求
1.一种截短芽孢杆菌的杆菌溶素基因，该基因具有如SEQ ID NO :1所示的核酸序列。
2.一种截短芽孢杆菌的杆菌溶素蛋白，该蛋白具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一种制备重组杆菌溶素的方法，包括以下步骤1)根据SEQID NO :1所示的核酸序列进行全基因合成，从而得到SEQ ID N0:1所示的核酸序列的截短芽孢杆菌的杆菌溶素基因；2)用步骤1)获得的核酸序列与表达质粒进行重组，对重组子进行验证以确定重组表达质粒的序列正确；3)用步骤幻获得的重组表达质粒转化宿主细胞；4)培养宿主细胞获得杆菌溶素包涵体蛋白；5)将步骤4)得到的杆菌溶素包涵体蛋白通过复性液进行复性，得到有活性的可溶的重组杆菌溶素。
4.根据权利要求
3所述的制备重组杆菌溶素的方法，其特征在于步骤幻中所述的复性液包含 ρΗ7· 5 的 IM Tris-Cl、50mM ZnCl2、IOOmMCaCl2 和 0. 25M Argo
5.根据权利要求
3所述的制备重组杆菌溶素的方法，其特征在于所述表达载体为原核表达载体。
6.根据权利要求
5所述的制备重组杆菌溶素的方法，其特征在于所述原核表达载体为 pET^b。
7.根据权利要求
3所述的制备重组杆菌溶素的方法，其特征在于所述的宿主细胞表达所述重组表达质粒，并且校正大肠杆菌密码子偏好性。
8.根据权利要求
7所述的制备重组杆菌溶素的方法，其特征在于所述的宿主细胞为大肠杆菌 Rosetta-gami II (DE3)。
9.根据权利要求
3所述的制备重组杆菌溶素的方法，其特征在于培养所述宿主细胞的培养基为含抗生素基础培养基，培养温度为35°C 37°C，培养时间为4 5小时，诱导温度为35°C 37°C，诱导时间为3 5小时，诱导物IPTG终浓度为0. 5 ImM。
10.根据权利要求
3所述的制备重组杆菌溶素的方法，其特征在于步骤幻中所述的活性通过下述方法测定取杆菌溶素溶液200 μ 1，以浓度为2%酪蛋白底物缓冲液为底物， 40°C恒温水浴20min，加入福林-酚试剂Iml保温显色20min后，在波长660nm处进行比色测定，对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
专利摘要
本发明涉及重组杆菌溶素的表达和应用。本发明运用基因工程技术只截取杆菌溶素基因中的成熟肽部分，去掉分泌肽部分，表达纯化大量稳定的重组杆菌溶素包涵体，并对其进行复性，得到了有活性的稳定的杆菌溶素。基于上述方法，本发明提供一种具有如SEQ ID NO1所示的核酸序列的截短芽孢杆菌的杆菌溶素基因。本发明还提供了一种具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的截短芽孢杆菌的杆菌溶素蛋白。本发明还提供了基于上述序列制备重组杆菌溶素的方法。通过本发明的方法得到的杆菌溶素具有易纯化、产量大、活性高的特点。
文档编号C12N15/31GKCN102168095SQ201010609553
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月28日
发明者刘希, 王晶, 龚俊 申请人:北京九强生物技术股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan