专利名称:猪链球菌毒力因子的多重pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域：
的多重PCR检测试剂盒及其检测方法，具体是一种猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
猪链球菌(Str印tococcus suis, SS)是一种重要的人畜共患病病原，在全世界广 泛分布，引起仔猪的脑膜炎，关节炎，心内膜炎，败血症，肺炎以及断奶仔猪的猝死，并可感 染人。根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型(1 34型及1/2型)。SS2，SS7， SS9是其中最重要的致病菌株，尤其以SS2流行最广，致病性最强。1991年在广东省首次分 离鉴定到SS2，随后于1998年和2005年分别在江苏和四川部分地区暴发人感染SS2并致人 死亡。
猪链球菌分为致病株和非致病株。致病株引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血 症、肺炎等严重的临床症状，可致猪突然死亡，而且可引起人的感染并致死；非致病株常见 于正常的猪的呼吸道，不引起临床症状。研究表明猪链球菌的致病性取决于其毒力因子，猪 链球菌的主要毒力因子包括荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、谷 氨酸脱氢酶(gdh)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)、溶血素(sly)、毒力相关序列 (orf2)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因。其中，cps基因可用于 区分猪链球菌的血清型，gdh基因由于有很低的点突变率和高度保守性的特点常被用来作 为猪链球菌感染的诊断抗原，gdh和cps同时又都是毒力因子。猪链球菌的致病性强弱取 决于其毒力因子，特别是mrp和印f常作为判断致病性的指标之一。欧美等国家对部分毒 力因子的分布情况已有报道，发现多种基因型，且致病性最强的基因型为cps2/印f+/mrp+/ sly+，国内这方面的研究还不多。
经对现有技术的文献检索发现，公开号为CN1896279A的中国发明专利申请披露 了 一种猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒，但该试剂盒并不能检测猪链球菌7型和9 型的分型。近年来，虽无SS7、SS9所引起的猪链球菌病暴发流行，但国内外均有从病猪体内 分离到SS7或SS9的报道，进一步的研究表明SS7、SS9有致病性，混合感染时在SS2致病或 暴发流行中发挥协同作用，因此研制能够涵盖7种猪链球菌主要毒力因子(mrp、epf, sly、 gdh,gapdh,orf2和fbps)和3种猪链球菌主要致病性血清型(2、7、9型)的多重PCR检测 试剂盒十分必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种猪链球菌毒力因子的多重PCR 检测试剂盒及其检测方法。本发明所建立的多重PCR检测方法特异、灵敏，且具有简便快捷 的优点；试剂盒稳定性可靠，能用于临床样品的快速检测及猪链球菌的分子流行病学调查 研究。
第一方面，本发明涉及一种猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包含如下组分2 XPCR核心试剂预混物，猪链球菌2、7、9型阳性对照DNA，DL2000分子量参 照溶液，ddH20和如下10种引物对
引物对1:
碱基序列如SEQ ID NO 1所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 2所示的下游引物；
引物对2:
碱基序列如SEQ ID NO 3所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 4所示的下游引物；
引物对3:
碱基序列如SEQ ID NO 5所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 6所示的下游引物；
引物对4:
碱基序列如SEQ ID NO 7所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 8所示的下游引物；
引物对5:
碱基序列如SEQ ID NO 9所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 10所示的下游引物；
引物对6:
碱基序列如SEQ ID NO :11所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 12所示的下游引物；
引物对7:
碱基序列如SEQ ID NO 13所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 14所示的下游引物；
引物对8:
碱基序列如SEQ ID NO 15所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 16所示的下游引物；
引物对9:
碱基序列如SEQ ID NO 17所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 18所示的下游引物；
引物对10:
碱基序列如SEQ ID NO 19所示的上游引物，
碱基序列如SEQ ID NO 20所示的下游引物。
第二方面，本发明还涉及一种前述试剂盒的检测方法，包括如下步骤
步骤一，提供待测样品的DNA ；
步骤二，取试剂盒，采用常规PCR方法扩增待测样品的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳 法检测扩增结果，根据结果进行判定；
所述根据结果进行判定具体为，以猪链球菌2型阳性DNA作为对照，若对照未扩增出以下全部条带，则重新检测；若对照扩增出以下全部条带，则结果判定如下
若扩增出387bp和688bp，则gdh和cps2J阳性，为猪链球菌2型，[0042]若扩增出25Ibp和688bp，则gdh和cps7H阳性，为猪链球菌7型，
若扩增出507bp和688bp，则gdh和cps9D阳性，为猪链球菌9型，
若扩增出316bp，则mrp阳性，
若扩增出626bp，则印f阳性，
若扩增出720bp，则fbps阳性，
若扩增出57 Ibp，则gapdh阳性，
若扩增出858bp，则orf 2阳性，
若扩增出443bp，则sly阳性；
无对应条带，则判断为阴性。
优选地，所述PCR方法中扩增参数具体为95 V 5min, 94 V 30s, 56 V 30s, 72°C 40s, 36 个循环，72°C 8min。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明所建立的多重PCR检测方 法，在完成2、7、9分型的同时可实现对其7个主要毒力因子的检测，通过与其他常见病原 菌的比较证明PCR反应的特异性强；敏感性实验结果显示单个靶基因的PCR检测下限可达 2. 69 X IO2CFU,三个多重PCR体系可检测的下限为2. 69 X IO3CFU,证明该法灵敏度高，减小 了假阴性以及漏检的概率。本发明所建立的多重PCR检测方法不仅特异、灵敏，在3个体系 及多对引物组合后，具有简便快捷的优点；且试剂盒稳定性可靠，能用于临床样品的快速检 测及猪链球菌的分子流行病学调查研究。
图1为试剂盒检测结果电泳判电泳图；
图2为猪链球菌2型阳性对照所有毒力因子单重PCR扩增结果；
图3为不同细菌量PCR扩增产物电泳图；其中A和B分别为不同细菌量cps2J基因单重和PCR III多重PCR扩增产物电泳图；
图4为不同细菌PCR扩增产物电泳图，其中A和B分别为不同细菌cps2J基因单 重和PCR III多重PCR扩增产物电泳图；
图5为DL2000Marker的DNA分子量标准。
具体实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例涉及的试剂盒及检测方法如下
1、试剂盒
本实施例的多重PCR检测试剂盒，包括10个冻存管、50个PCR反应管和说明书。10 个冻存管具体为代号分别为M(2个)、C2、C7、C9、D、H、P1、P2、P3的冻存管，冻存管M装有 2 X PCR核心试剂预混物(dNTP、Taq DNA聚合酶混合物和MgCl2溶液，市购)，冻存管C2、C7和C9分别装有30 μ 1猪链球菌2、7、9型阳性对照DNA溶液，冻存管D装有0. 5ml的DL2000 分子量参照溶液(市购)，冻存管H装有1. 5ml的ddH20，冻存管Pl、P2、P3分别装有PCR体 系I、II、和III所用引物的干粉混合物；所有冻存管均保存于-20°C。
2、试剂盒的检测方法
步骤一，分别向装有引物的干粉混合物冻存管Pl加入3152 μ 1 ddH20、P2加入 2080 μ 1 (ΜΗ20、Ρ3ΜΛ2464μ1 ddH20，溶解引物(引物溶解的ddH20与分装管自备)，使用 前把所有冻存管室温下放置，待管内液体融化后，迅速转至冰上进行下一步操作；其中，
Pl中的引物为
扩增基因cps2J 的引物对为 C2U-I (SEQ ID NO 1), C2D-I (SEQ ID NO 2)，
扩增基因cps7H 的引物对为 C7U-I (SEQ ID NO 3)，C7D-I (SEQ ID NO 4)，
扩增基因cps9D 的引物对为 C9U-I (SEQ ID NO 5)，C9D-I (SEQ ID NO 6)，
扩增基因gdh 的引物对为 gl-I (SEQ ID NO 7)，g2_I (SEQ ID NO 8)；
P2中的引物为
扩增基因mrp 的引物对为 ml_II (SEQ ID NO 9)，m2_II (SEQ ID NO 10)，
扩增基因epf 的引物对为 el_II(SEQ ID NO :11)，e2_II (SEQ ID NO 12),
扩增基因fbps 的引物对为 fl-II (SEQ ID NO 13)，f2_II (SEQ ID NO 14)；
P3中的引物为
扩增基因gapdh 的引物对为 hl-III(SEQ ID NO 15)，h2_III (SEQ ID NO 16),
扩增基因orf2 的引物对为 ol-III(SEQ ID NO 17)，o2_III (SEQ ID NO 18),
扩增基因sly 的引物对为 sl_III(SEQ ID NO 19)，s2_III (SEQ ID NO :20)。
步骤二，取冻存管M中溶液12. 5 μ 1分别加入3个PCR反应管，之后再依次分别 加入溶解后的引物溶液PI、Ρ2、Ρ3各4 μ L，做好标记后，用冻存管H中ddH20调节终体积至 22μ 1，立即加入待测样品DNA模板，混合均勻后进行检测；
阳性对照操作相同，猪链球菌2、7、9型分型检测时，模板分别对应冻存管C2、C7和 C9中溶液；每一个分型的管分别加2、7、9型对照DNA，最后扩增出来的目的条带是gdh和2、 7、9型中的一至两种。
步骤三，将3个PCR反应管按以下条件在PCR仪上进行扩增首先95°C 5min,之后 进行36个热循环，每个循环具体为94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 40s ；最后72°C 8min ；
步骤四，将扩增后的产物在110V电压下进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物和冻存 管D内DL2000分子量参照的点样量为10 μ 1每孔，电泳时间33min，电泳完毕后用凝胶成像 系统分析；
步骤五，结果判定
(1)猪链球菌 2 型阳性对照 DNA 可扩增出 cps2J、gdh、mrp、印f、fbps、gapdh、orf2、 sly全部片段，作为毒力因子判定的阳性对照，若阳性对照可扩增出全部条带，3个多重PCR 体系结果判定如下
PCR I
若扩增出387bp和688bp，则判定gdh和cps2J阳性，为猪链球菌2型(图1A，1号 泳道)；
若扩增出25Ibp和688bp，则判定gdh和cps7H阳性，为猪链球菌7型(图1A，2号泳道)；
若扩增出507bp和688bp，则判定gdh和cps9D阳性，为猪链球菌9型(图1A，3号 泳道)；
如图IA所示，
1 号泳道出现 2 个条带，为 cps2J(387bp)+gdh(688bp)；
2 号泳道出现 2 个条带，为 cps7H(251bp)+gdh(688bp)；
3 号泳道出现 2 个条带，为 cps9D(507bp)+gdh(688bp)；
PCRII
若扩增出316bp，则判定mrp阳性；
若扩增出626bp，则判定印f阳性；
若扩增出720bp，则判定fbps阳性；
如图IB 所示，1 号泳道出现 3 个条带，为 mrp(316bp)+印f(626bp)+fbps(720bp)；
PCRIII
若扩增出57Ibp，则判定gapdh阳性；
若扩增出858bp，则判定orf2阳性；
若扩增出443bp，则判定sly阳性；
如图IC 所示，1 号泳道出现 3 个条带，为 gapdh(571bp)+orf2(858bp)+sly(443b P)；
无对应条带或条带大小不吻合，则判断为阴性；
(2)猪链球菌 2 型阳性对照 DNA 可扩增出 cps2J、gdh、mrp、印f、fbps、gapdh、orf2、 sly全部片段，作为毒力因子判定的阳性对照，在阳性对照未扩增出全部条带的情况下，需 重新检测并判定，如图2所示，图2中，各泳道为l-cps2J、2-mrp、3-印f、4-fbps、5-gdh、 6-orf2、7_sly、8-gapdh0
实施例2
本实施例涉及的材料如下
金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、大肠杆菌(ATCC25922)、无乳链球菌(ATCC10556)、粪肠球菌(ATCC29212)和空肠弯曲杆菌(ATCC33560)可购自商业公司，如上 海复蒙基因生物科技有限公司，公司地址上海市邯郸路229号复旦大学内。
四川分离株ZY05719(猪链球菌2型)，江苏分离株HA9801(猪链球菌2型)已在 多篇文章中公开，如《沈艳，华修国，崔立等.猪链球菌2型两代表性分离株感染小型猪后对 部分免疫指标的影响[J].畜牧兽医学报，2008，39 (12) ；1721 1730》中公开，相关菌株可 通过公开的商业渠道取得，如青岛中国动物卫生与流行病学中心，地址青岛市南京路369 号邮编:266032o
猪链球菌2型参考菌株(S735)、猪链球菌7型参考菌株(8704)、猪链球菌9型参考 菌株(2083)购自青岛中国动物卫生与流行病学中心。其中猪链球菌2型参考菌株(S735) 已在文章中公幵(Marie-Claude Jobin, Julie Brassard, Sylvain Quessy^. Acquisition of Host Plasmin Activity by the Swine Pathogen Streptococcus suisSerotype 2， Infection and Immunity, January 2004，p. 606 610，Vol. 72，No. 1) ；SH29 株已在《赵 冉，孙建和，陆承平，多重PCR鉴定猪链球菌2型毒力菌株，上海交通大学学报农业科学版，2006年24卷6期，503 506》中公开。
猪链球菌接种于2mlTHB肉汤培养基，37°C振荡培养过夜；其他细菌接种于2ml肉汤增菌培养基，37°C振荡培养过夜。之后进行如下实验
1、敏感性试验
SH29株接种2ml THB肉汤培养基，37°C振荡培养过夜，取1. 5ml菌液离心后用 0. Olmol/mL的PBS洗2遍后，作10倍连续系列稀释，进行平板计数后，取各稀释度的菌液进 行单重和多重PCR的敏感性试验。将不同稀释度的猪链球菌2型SH29株进行平板计数后， 推算出原SS2菌液的浓度是2. 69X 107CFU/mL。提取DNA进行单重和多重PCR的敏感性试 验，结果显示单重PCR敏感性可达IO2CFU,多重PCR敏感性可达IO3CFU (图3A、3B)，
图3A中，泳道1到8所对应的浓度分别为2. 69 X IO7CFU, 2. 69 X IO6CFU, 2. 69 X IO5CFU, 2. 69 X IO4CFU, 2. 69 X IO3CFU, 2. 69 X IO2CFU, 2. 69 X IO1CFU, 2. 69 X IO0CFU ；
图3B中，泳道1到6所对应的浓度分别为2. 69 X IO5CFU, 2. 69 X IO4CFU, 2. 69 X IO3CFU, 2. 69 X IO2CFU, 2. 69 X IO1CFU, 2. 69 X IOciCFUq
2、特异性试验
以SS2阳性对照为模板，分别用金黄色葡萄球菌(购自ATCC)、大肠杆菌、空肠弯曲 杆菌、粪肠球菌、无乳链球菌的DNA为模板，分别进行cps2J基因的单重PCR以及采用建立 的PCR方法进行扩增。除阳性模板可扩增出对应的条带外，以金黄色葡萄球菌(ATCC)、大肠 杆菌、空肠弯曲杆菌、粪肠球菌、无乳链球菌DNA为模板检测，结果显示单个靶基因的PCR和 多重PCR均未出现出特异性的扩增条带(图4A、4B)。
图4A为不同细菌cps2J单重PCR结果电泳图；其中各个泳道为
M. DL2000，1. 2 型阳性对照，2. HA9801，3. 8704(SS7) ,4.金黄色葡萄球菌(ATCC)， 5.大肠杆菌DH5a，6.空肠弯曲杆菌；
图4B为不同细菌PCRII多重PCR结果电泳图；其中各个泳道为
M. DL2000，1.2 型阳性对照，2. HA9801，3. ZY05719，4.金黄色葡萄球菌(ATCC)， 5.大肠杆菌DH5a，6.空肠弯曲杆菌，7.粪肠球菌，8.无乳链球菌。
权利要求
一种猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包含如下组分2×PCR核心试剂预混物，猪链球菌2、7、9型阳性对照DNA，DL2000分子量参照溶液，ddH2O和如下10种引物对引物对1碱基序列如SEQ ID NO1所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO2所示的下游引物；引物对2碱基序列如SEQ ID NO3所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO4所示的下游引物；引物对3碱基序列如SEQ ID NO5所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO6所示的下游引物；引物对4碱基序列如SEQ ID NO7所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO8所示的下游引物；引物对5碱基序列如SEQ ID NO9所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO10所示的下游引物；引物对6碱基序列如SEQ ID NO11所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO12所示的下游引物；引物对7碱基序列如SEQ ID NO13所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO14所示的下游引物；引物对8碱基序列如SEQ ID NO15所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO16所示的下游引物；引物对9碱基序列如SEQ ID NO17所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO18所示的下游引物；引物对10碱基序列如SEQ ID NO19所示的上游引物，碱基序列如SEQ ID NO20所示的下游引物。
2.一种根据权利要求
1所述的猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒的检测方法， 其特征在于，包括如下步骤步骤一，提供待测样品的DNA;步骤二，取试剂盒，采用常规PCR方法扩增待测样品的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳法检 测扩增结果，根据结果进行判定；所述根据结果进行判定具体为，以猪链球菌2型阳性DNA作为对照，若对照未扩增出以下全部条带，则重新检测；若对照扩增出以下全部条带，则判定如下 若扩增出387bp和688bp，则gdh和cps2J阳性，为猪链球菌2型， 若扩增出25Ibp和688bp，则gdh和cps7H阳性，为猪链球菌7型， 若扩增出507bp和688bp，则gdh和cps9D阳性，为猪链球菌9型， 若扩增出316bp JUmrp阳性， 若扩增出626bp，则印f阳性， 若扩增出720bp JlJfbps阳性， 若扩增出57Ibp，则gapdh阳性， 若扩增出858bp，则orf2阳性， 若扩增出443bp，则sly阳性； 无对应条带，则判断为阴性。
3.根据权利要求
2所述的猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒的检测方法，其特 征是，所述PCR方法中扩增参数具体为95°C 5min，94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 40s，36个循环， 72 °C 8min。
专利摘要
一种生物技术领域：
的猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒及其检测方法；该试剂盒包含碱基序列如SEQ ID NO1～SEQ ID NO20所示的核酸；该试剂盒的检测方法包括如下步骤步骤一，提供待测样品的DNA；步骤二，取试剂盒，采用常规PCR方法扩增待测样品的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增结果，根据结果进行判定；所述判断具体为，以猪链球菌2型阳性DNA作为对照，若对照未扩增出全部条带，则重新检测；若对照扩增出全部条带，则进行结果判定。本发明所建立的多重PCR检测方法特异、灵敏，且具有简便快捷的优点；试剂盒稳定性可靠，能用于临床样品的快速检测及猪链球菌的分子流行病学调查研究。
文档编号C12Q1/68GKCN101812518SQ201010119005
公开日2010年8月25日 申请日期2010年3月8日
发明者华修国, 崔立, 朱爱玲, 杨志彪, 郑升博 申请人:上海交通大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan