专利名称：：类鼻疽检测试剂盒及检测方法
技术领域：
：本发明属于细菌抗原的检测
技术领域：
，具体为一种类鼻疽假单胞菌(Swr狄oWer/a;weMctomfl//e/)的检测鉴定试剂盒，同时还涉及对类鼻疽假单胞菌进行检测的方法。它既可以应用于医院对发热病人临床样品的定性检测，也可以应用于对类鼻疽疫原地进行大规模的流行病学调査。可广泛应用于医学和生物学研究领域。
背景技术：
：类鼻疽是由类鼻疽假单胞菌(5"rA力oWeria;^et/Gb鹏W")引起的一种新发现的感染性疾病；现在被认为是澳大利亚和东南亚一些国家的比较重要的公共卫生问题(ChenWT，ChenYS，ChyeSM,etal.SeroprevalenceofmelioidosisindiabeticpatientsinTaiwan.JMicrobiolImmunolInfect2005;38(4):267-70.)。类鼻疽的临床症状有肺炎、皮肤和软组织化脓、脑积水、肝和脾化脓以及脓血症，肺炎是其主要的临床症状，一半的类鼻疽病人都会有肺炎症状的发生，容易误诊为肺结核或者其他疾病。类鼻疽伯克霍尔德菌是一种革兰氏阴性短杆菌，是一种高致死率的环境病原菌，近年来我们发现病例致死率达50%以上，而且入院误诊率高达100%，类鼻疽病的及时诊断和治疗是降低病死率的最有效措施。最近的流行病学调査表明，类鼻疽假单胞菌的疫原地主要分布于南北纬20度之间的广大赤道国家和地区(RajaNS，AhmedMZ,SinghNN.Melioidosis:anemerginginfectiousdisease.JPostgradMed2005;51(2):140-5.)，包括我国的广东、广西、台湾和海南等省(YangS.MelioidosisresearchinChina.ActaTrop2000;77(2):157-65.)。类鼻疽假单胞菌主要生存在疫原地的稻田、橡胶园和水源地附近。虽然人们对类鼻疽假单胞菌的疫原地进行了广泛的调査，4但是类鼻疽假单胞菌在全球的分布情况还是不清楚。目前对类鼻疽假单胞菌疫原地的调査方法现在还是以分离、培养、鉴定的方法作为主要方法，是金标准。但是这种方法从土壤的釆集到最终的细菌鉴定结果需要至少一个月的时间，而且需要大量的人力物力。这是不能对类鼻疽假单胞菌在地球上详细分布情况进行流行病学调查的主要原因。目前类鼻疽的临床检验常用细菌分离培养法。主要是对患者的脓液和血液样品进行培养后分离鉴定。此方法虽有"金色指标"之称，但其技术复杂、费时长(通常需l周)，不适合用于早期诊断。免疫学方法虽能达到快速诊断目的，但其灵敏度和特异性变化较大，容易出现假阳性，且某些底物具有致癌作用，使临床应用受到一定限制。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据己经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检査，而且由于一天之内可以检査几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一禾中早期诊断的良好方法(SermswanRW,WongratanacheewinS,AnuntagoolN,SirisinhaS.Comparisonofthepolymerasechainreactionandserologictestsfordiagnosisofsepticemicmelioidosis.AmJTropMedHyg2000;63(3-4):146-9.)。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种类鼻疽假单胞菌的检测试剂盒，通过直接检测临床样品培养物进行类鼻疽假单胞菌鉴定的ELISA试剂盒，能快速、灵敏、准确的检测到类鼻疽假单胞藺。本发明的另一个目的是在于提供了一种直接检测土壤培养物中类鼻疽假单胞菌的抗原检测的方法，方法易行，操作简便，可以应用于大规模对类鼻疽疫原地的流行病学调查。为了解决上述任务，本发明采取以下措施表达了一种类鼻疽假单胞菌的特异性抗原，并用这种抗原免疫小鼠，获得针对类鼻疽假单胞菌特异性非常高的单克隆抗体，用此单克隆抗体和针对类鼻疽假单胞菌的多克隆抗体研制成类鼻疽假单胞菌检测试剂盒。该试剂盒包括预包被反应板、酶标抗体、洗液20X、底物溶液A,B和终止液。使用该试剂盒，首先将样品放入5ml含有粘杆菌素和庆大霉素的LB液体培养基过夜培养，然后取培养液上清100ul用于ELISA检测。其发明过程是1.从中国兽医兽药监查所购买了一株类鼻疽假单胞菌的标准菌株CMCC53001(标准株)。并设计了一对表达类鼻疽假单胞菌鞭毛抗原的引物，5'-AAAAGAATTCGCGTCGGCGCTGCMCAGGAACTCG-3'5'-AAAAAAGCTTTTACATCGCCTGGTACGCGCCCGTCTGC-3，引物末端加上了fearI和历y^III酶切位点。PCR扩增后得到588bp的扩增产物，产物核苷酸序列为SEQIDNO.1。酶切后连接到Pet28a表达载体(Novagon)上，得到重组载体Pet28a-/7允表达载体。诱导表达后得到23KD的含有组氨酸标签的鞭毛蛋白，BALB/c小鼠，获得抗鞭毛蛋白的1株特异性单克隆抗体。用全菌体免疫新西兰大白兔获得全菌体多克隆抗体。2，用类鼻疽假单胞菌的单克隆抗体和全菌体多抗研制了一种类鼻疽检测试剂盒，该试剂盒包括酶联板一块(96孔)，酶联板的包被将单克隆抗体用碳酸盐缓冲液(50mMPH9.6)稀释到5yg/ml，100y1/孔包被反应板。4'C冰箱中孵育过夜。洗涤液0.02Mol/LPH7.4Tris—HCl缓冲液。洗涤两次。加入125u1/孔的封闭液(lOmM磷酸盐缓冲液含1%(质量比)的牛血清白蛋白(BSA)。室温(20-25'C，以下相同)放置8个小时。丢掉封闭液，37'C烤箱8个小时后封板。得到预包被反应板。酶标抗体1X20ml/瓶。酶标抗体的制备(HRP标记多克隆抗体)称取5mg服P溶解于1ml蒸馏水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaI(V溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对lraMra4.4的醋酸钠缓冲液透析，4。C过夜。力口20ul0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化捏RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mgIgG(抗体，或SPA5mg)在lml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4°C2小时。将上述液装入透析袋中，对O.15MPH=7.4PBS透析，4。C过夜。检测液A:1X10ml/瓶。检测液B:1X10ml/瓶。购买自济南天和生物科技有限公司。浓洗涤液1X30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。浓洗涤液的配制NaCl137腿ol/L，KC12.7誦ol/L,Na，O,,4.3画1/L,KH2P041.4腿ol/L，向烧杯中加入约40ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加浓盐酸将pH值调节至8.0，然后加入去离子水将溶液定容至50ml。.终止液1X10ml/瓶(2NH2S04)。终止液量取20ml98%H2S04,缓缓加至80ml双蒸水中即可。3、一种试剂盒在制备检测类鼻疽假单胞菌中的试剂的方法，其步骤是ELISA试剂使用前试剂的配制1)、LB液体培养基LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5ml/支分装到的试管中，高压(1034X105Pa)下蒸气灭菌(至少20分钟)消毒；庆大霉素和粘杆菌素的配制用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20'C保存。2)、取5ml/支LB试管，分别加入庆大霉素和粘杆菌素到100ug/ml。3)、取临床样品1g加入试管中，37°C150rpm/min24hous。4)、取IOOul培养液上清用于检测；5)、取酶联板(96孔)，加样每孔加入100u1待测菌液，设阴性对照孔(LB)。置37°C60min;洗液冲洗五次。6)、酶标加入100ul酶标抗体，37°C30min后洗液冲洗五次。7)、显色每孔加底物溶液各一滴显色(检测液A与检测液B)，置室温37'C30min,左右(可根据显色情况而定)。8)、终止每孔加终止液50ul。结果判定-比色法选波长450nm，空白孔校零。用酶联免疫检测仪对每孔进行比色，并记录其OD值。样品孔OD值^1.00时，该孔样品为阳性。反之为阴性。阴性对照7孔OD值<0.10。本试剂盒的特异性检测，对20种病原菌培养液的检测结果如下(表1)。表l,对本实验室所保存的20种病原菌培养物进行检测，除了肠球菌有弱反应外，别的病原菌均没有明显反应。OD值为三次反应得平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>敏感度检测为了确定该ELISA检测试剂盒检测土壤中类鼻疽假单胞菌的数量，我们稀释了四个细菌梯度分别接种到类鼻疽假单胞菌为阴性的稻田土壤中，然后在LB培养基中培养72小时后，用试剂盒检测菌液，结果该试剂盒的最低检测浓度为6-10CFU/g土壤样品。本发明与现有技术相比，具有下列优点(1)特异性高。通过对多种细菌的特异性检测结果表明，特异性达到100%。(2)敏感度高，可以检测到土壤中6-10CFU/g的类鼻疽假单胞菌。(2)可一次性处理96个样品，适用于大规模流行病学调查。(3)也可以对少量临床样品进行定性检测。(4)检测速度快。相对于传统的培养检测方法，此方法可以在28小时内给出检测结果。具体实施例方式实施例1:用类鼻疽假单胞菌的单克隆抗体和全菌体多抗研制了一种类鼻疽检测试剂盒，该试剂盒包括酶联板一块(96孔)，酶联板的包被将单克隆抗体3#用碳酸盐缓冲液(50mMPH9.6)稀释到5iig/ml，100y1/孔包被反应板。4'C冰箱中孵育过夜。洗涤液O.02Mol/L7.4Tris—HCl缓冲液。洗涤两次。加入125y1/孔的封闭液(10mM磷酸盐缓冲液含P/。(质量比)的牛血清白蛋白(BSA)。室温(20-25'C，以下相同)放置8个小时。丢掉封闭液，37'C烤箱8个小时后封板。得到预包被反应板。酶标抗体1X20ml/瓶。酶标抗体的制备(HRP标记多克隆抗体)称取5mg服P溶解于1ml蒸馏水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1MNal04溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对lmMHI4.4的醋酸钠缓冲液透析，4。C过夜。加'20ul0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化程RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mgIgG(抗体，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4rag/mlNaBH4液，混匀，再置4°C2小时。将上述液装入透析袋中，对O.15MPH7.4PBS透析，4'C过夜。检测液A:1X10ml/瓶。检测液B:1X10ml/瓶。购买自济南天和生物科技有限公司。浓洗涤液1X30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。浓洗涤液的配制NaCl137誦1/L，KC12.7腸1/L，Na2HP044.3函1/L，KH2P041.4腸1/L，向烧杯中加入约40ml的去离子水，充分搅拌溶解。滴加浓盐酸将pH值调节至8.0，然后加入去离子水将溶液定容至50ml。终止液1X10ml/瓶(2NH2S04)。终止液量取20ml98%H2S04,缓缓加至80ml双蒸水中即可3、ELISA试剂使用前试剂的配制LB液体培养基LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5ml/支分装到的试管中，高压(1034X105Pa)下蒸气灭菌(至少20分钟)消毒。庆大霉素和粘杆菌素的配制用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20。C保存。一种试剂盒在制备检测类鼻疽假单胞菌中的试剂的方法，该检测方法包括下列步骤1)、ELISA试剂使用前试剂的配制LB液体培养基LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5inl/支分装到的试管中，高压(1034X105Pa)下蒸气灭菌(至少20分钟)消毒；庆大霉素和粘杆菌素的配制用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20。C保存。2)、取5ml/支LB试管，分别加入庆大霉素和粘杆菌素到100yg/ml。3)、取临床样品1g加入试管中，37°C150rpm/min24hous。4)、取IOOul培养液上清用于检测；(其检测步骤是)5)、取酶联板(96孔)，加样每孔加入飾1待测菌液，设阴性对照孔(LB)。置37°C60min;洗液冲洗五次。6)、酶标加入100ii1酶标抗体，37°C30min后洗液冲洗五次。7)、显色每孔加底物溶液各一滴显色(检测液A与检测液B)，置室温37°C30min左右(可根据显色情况而定)。8)、终止每孔加终止液50yl。结果判定比色法选波长450nm,空白孔校零。用酶联免疫检测仪对每孔进行比色，并记录其OD值。样品孔OD值S1.00时，该孔样品为阳性。反之为阴性。阴性对照孔OD值〈0.10。实施例2:一种直接检测土壤培养物中类鼻疽假单胞菌的抗原检测的方法，该检测方法包括下列步骤(对已经鉴定过的154份广西省采集土壤样品进行检测)1.用一次性汤匙取1g土壤样品，接于添加了庆大霉素和粘肝菌素的5mlLB2.37。C，150rpm/min，24hours。3.取土壤培养液1ml，静置1hour，取上清100y1用于ELISA检测。4.取与反应96孔板一块，分别加入检测样品100ul,设置一个阴性对照(100ulLB培养液)，置37。C60min;5.洗液冲洗五次，后加入100y1酶标抗体，37°C30min后洗液冲洗五次。6.每孔加底物溶液各一滴检测液(A与B)，置室温37°C30rain左右(可根据显色情况而定)。7.每孔加终止液50ul。测0D450值。8.样品孔0D值^1.00时，该孔样品为阳性。反之为阴性。9.结果分离培养的方法检测到13个样品含有类鼻疽假单胞菌，并且细菌的含量从23—521CFU/g土壤。而用本试剂盒检测得到相同试验结果。敏感度100%,特异性100%。实施例3:一种直接检测发热病人血液中类鼻疽假单胞菌抗原检测的方法，该检测方法包括下列步骤1.将发热病人的血液1ml注入添加了庆大霉素和粘肝菌素的5mlLB试管中。2.37°C，150rpm/min，24hours。3.取血液培养液lml，静置lhour,取上清100ul用于ELISA检测。4.取与反应96孔板一块，分别加入检测样品100ul，设置一个阴性对照(100ulLB培养液)，置37°C60min;5.洗液冲洗五次，后加入100ul酶标抗体，37°C30rain后洗液冲洗五次。6.每孔加底物溶液各一滴检测液(A与B)，置室温37°C30min左右(可根据显色情况而定)。7.每孔加终止液50nl。测0D450值。8.结果，血液样品0D值为2.301，阴性对照为0.023，此病人为类鼻疽假单胞菌感染。应该立即进行抗生素治疗。12SEQUENCELISTING《110>中国科学院武汉病毒研究所<120>类鼻疽检测试剂盒及检测方法'<130>类鼻疽检测试剂盒及检测方法<160>1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>588<212>DNA<213>Bulbinesucculenta〈400〉1gcgtcggcgctgcaacaggaactcgcgcagcagatctcggaagtgaaccgtatcgcttcg60cagacgaactacaacggcaa'gaacatcctcgacggctcggcaggcacgctgagcttccag120gtcggcgcgaacgtcggccagacggtctccgtcgacctcacgcaaagcatgtcggcggcg180aagatcggcggcggcatggttcagacgggccagacgctcggcacgatcaaggtggcgatc240gactcgagcggcgcggcctggtcgtcgggcagcaccggccaggagacgacgcagatcaac300gtcgtgtcggacggcaagggcggcttcacgttcaccgatcagaacaaccaggcgctgtcg360tcgacggccgtgaccgccgtgttcggctcgtcgaccgccggcacgggcacggcggcctcg420ccgtcgttccagacgctggcgctgtcgacttcggcaaccagcgcgctgtccgcgacggac480caggcgaacgccacggcgatggttgcgcagatcaacgcggtcaacaagccgcaaacggtc540tcgaacctcgacatcagcacgcagacgggcgcgtaccaggcgatgtaa588权利要求1，一种类鼻疽假单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括酶联板一块，酶联板的包被将单克隆抗体3#用碳酸盐缓冲液稀释到5μg/ml，100μl/孔包被反应板，4℃冰箱中孵育过夜，洗涤液洗涤两次，加入125μl/孔的封闭液的牛血清白蛋白，室温放置8个小时，丢掉封闭液，37℃烤箱8个小时后封板，得到预包被反应板；酶标抗体1×20ml/瓶，酶标抗体的制备，称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中，于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋中，对1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化程RP的PH升高到9.0～9.5，然后加入10mgIgG在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4℃2小时，将上述液装入透析袋中，PBS透析，4℃过夜；检测液A1×10ml/瓶，检测液B1×10ml/瓶；浓洗涤液1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍，浓洗涤液的配制NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，向烧杯中加入约40ml的去离子水，搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH值调节至8.0，然后加入去离子水将溶液定容至50ml；终止液1×10ml/瓶，终止液量取20ml98％H2SO4，加至80ml双蒸水中。2、权利要求1所述的一种试剂盒在制备检测类鼻疽假单胞菌中的方法，其步骤是1)、ELISA试剂使用前试剂的配制LB液体培养基LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加水至1L，5ml/支分装到的试管中，高压下蒸气灭菌消毒；庆大霉素和粘杆菌素的配制用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20'C保存；2)、取5ml/支LB试管，分别加入庆大霉素和粘杆菌素到100ug/ml;3)、取临床样品1g加入试管中，37°C150rpm/min24hous;4)、取100iU培养液上清用于检测；5)、酶联板加样每孔加入100iil待测菌液，设阴性对照孔，置37°C60min;洗液冲洗五次；6)、酶标加入IOOtil酶标抗体，37°C30min后洗液冲洗五次；7)、显色每孔加底物溶液各一滴显色检测液A与检测液B,置室温37°C15min;8)、终止每孔加终止液50u1。全文摘要本发明公开了一种类鼻疽检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括预包被反应板、酶标抗体、洗液20×、底物溶液A，B和终止液。使用该试剂盒，首先将样品放入5ml含有粘杆菌素和庆大霉素的LB液体培养基过夜培养，然后取培养液上清100μl用于ELISA检测。检测包括取LB试管，分别加入庆大霉素和粘杆菌素；取临床样品加入试管中；取培养液上清用于检测，加样，每孔加入待测菌液，设阴性对照孔；洗液冲洗五次；酶标加入酶标抗体，冲洗；显色每孔加底物溶液各一滴显色A与B；终止每孔加终止液。本发明检测速度快，操作方便安全，省时效率高，从而达到了早期诊断和治疗类鼻疽的感染；也可以应用于类鼻疽假单胞菌疫原地进行大规模的流行病学调查。文档编号G01N33/543GK101504412SQ20091006113公开日2009年8月12日申请日期2009年3月17日优先权日2009年3月17日发明者蔡全信,袁志明,郑大胜,阎建平,马广强申请人:中国科学院武汉病毒研究所