专利名称:用于以高品质和高数量制造重组蛋白的人类宿主细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于以高品质和高数量制造重组蛋白的人类宿主细胞，且更具体来说，涉及通过使用基因工程技术使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的人类宿主细胞，其中所述人类宿主细胞具有所需稳定特征以有效地用于制造异源重组蛋白。
背景技术：
迄今为止，大部分用于人类用途的基于重组蛋白的药物是使用非人类哺乳动物细胞制造的，例如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CH0)细胞、小鼠黑色素瘤(mousemelanoma,NS0)细胞·和小鼠杂交瘤(SP2/0)细胞。已试图使用人类细胞系来制造治疗性重组蛋白，例如使用人类胚肾293细胞来制造活化蛋白C(西格斯(Xigris))(礼来公司(EliLylly), 2001)、使用纳马瓦(Namalwa)细胞来制造干扰素_β (威康研究实验室(WellcomeResearch Laboratory)，1999)、利用HKBll细胞来制造截短重组因子VIII和多种抗体(曹(Cho)等人，2003，生物技术进展(Biotech.Prog) 19:229-232)和利用PER.C6细胞来制造多种抗体和病毒DNA (法劳(Fallaux)等人，1998，人类基因疗法(Human Gene Therapy)，9:1909-1917)(约翰(Jones)等人，2003，生物技术进展(Biotechnol.Prog.) 19:163-168 和谢(Xie)等人，2003，生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.) 83:45-52)。
美国专利第6，136，599号和韩国专利第627，753号揭示使用人类宿主细胞HKB11细胞来制造难以在CHO细胞中表达的蛋白质(曹(Cho)等人，2003，生物技术进展(Biotech.Prog) 19:229-232)(曹(Cho)和陈(Chan)，2002，生物医学科学(BiomedicalScience) 9:631-638)。美国专利第6，358，703B1号和韩国专利第616，028号揭示一种利用HKB 11细胞来制造截短重组因子VIII的方法。HKB细胞是一种来源于HH514-16的细胞系且包含在B细胞固定和病毒产生方面有缺陷的埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus,EBV)的基因组(拉布森(Rabson)等人，1983，美国科学院院报(PNAS USA) 87:3660-3664)。HKB细胞显示诸如高密度生长、高转染效率和简单MTX诱导性扩增、目标蛋白的大量分泌和IgM表达消除等特征，这些特征适于制造治疗性蛋白质。然而，观察到，在细胞培养期间EBV趋向于从HKB细胞中丢失(张(Chang)等人，2002，病毒学杂志(J Virol.) 76:3168-3178)。这种趋势表明HKB可能变得不含EBV，从而无法保持各种用于有效表达异源基因的有益性质。
因为EBV基因组并不以游离基因体形式存在，但可插入纳马瓦细胞的染色体中(松尾(Matsuo)等人，科学(Science) 1984 年 12 月 14 日:1322-1325，亨德森(Henderson)等人，1983，美国科学院院报(PNAS USA) 80:1987-1991和罗斯(Rose)等人，2002，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.) 40:2533-25440)，所以本发明者已开发一种新颖人类宿主细胞系，其使用纳马瓦细胞保留EBV来源的特征而无病毒产生。
发明内容
[0005]技术问题
本发明的一个目标是提供一种通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的新颖人类宿主细胞系，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。
本发明的另一个目标是提供一种人类宿主细胞用于制造重组蛋白的用途。
技术解决方案
根据本发明的一方面，提供一种通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的人类宿主细胞，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。
根据本发明的另一方面，提供一种人类宿主细胞用于制造重组蛋白(包含单克隆抗体)的用途。
现将参考附图更充分地描述本发明，在附图中显示本发明的例示性实施例。
根据本发明的一实施例的人类宿主细胞是通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。
所述人类胚肾来源的细胞可包含人类胚肾细胞、来源于人类胚肾细胞的细胞、来源于另一种人类胚肾来源的细胞的细胞和由任何上文所提及的细胞进行有丝分裂得到的细胞。本文中所使用的‘来源于’意欲包含(但不限于)正常的细胞有丝分裂和诸如转染、细胞融合或用于改变细胞或制造具有新颖特征的细胞的其它基因工程或细胞生物学技术等过程。具体来说，人类胚肾来源的细胞可为293来源的细胞，且优选为293细胞。所述293细胞展现高转染效率和高蛋白质生产率水平，但在无血清悬浮培养物中出现聚集。
染色体中有EBV基因组插入的人类B细胞来源的细胞可包含人类B细胞、来源于人类B细胞的细胞、来源于另一种人类B细胞的细胞或由细胞有丝分裂得到的细胞。本文中所使用的‘来源于’意欲包含(但不限于)正常的细胞有丝分裂、转染、细胞融合或用于改变细胞或制造具有新颖特征的细胞的其它基因工程或细胞生物学技术。具体来说，染色体中具有EBV基因组的人类B细胞来源的细胞可为纳马瓦细胞。所述纳马瓦细胞具有低转染效率，但在悬浮培养物中生长良好，而且无聚集。
技术解决方案
EBV基因组一般以游离基因体形式存在于B细胞中，但可插入诸如纳马瓦细胞等一些B细胞的染色体中。使用这些优越和独特的特征，本发明的一实施例提供一种稳定人类宿主细胞，其尽管具有病毒信息，但不会产生病毒，可进行制备。因为EBV基因组基因中oriP表达载体所需的埃-巴二氏核抗原I (Epstein-Barr nuclear antigen I, EBNAI)基因和抗细胞凋亡所需的BHRFl和BALFl基因(卡布拉斯(Cabras)等人，2005，临床病毒学杂志(J ClinicalVirology) 34:26-34)在纳马瓦细胞中表达，所以这些基因有效地用作宿主细胞中的病毒信息。另外，因为仅在游离型基因组中表达的作为裂解周期(lytic cycle)基因诱导初始蛋白质表达的BZLFl基因(康垂曼(Countryman)等人，1987，病毒学杂志(J Virol),61 =3672-3679)和 LMP2 基因(盛普(Sample)等人，病毒学杂志(J Virol)63:933-937)并不在纳马瓦细胞中表达，所以可制备不产生病毒的安全宿主细胞(M.伯纳斯柯尼(M.Bernasconi)等人.病毒学杂志(Virology Journal), 2006, 3:43-57)。
本发明实施例的人类宿主细胞是通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组插入其染色体中。因此，所述人类宿主细胞是具有人类胚肾来源的细胞(例如293细胞)与人类B细胞来源的细胞(例如纳马瓦细胞)两者的有益性质的新颖细胞系。通过选择293细胞作为人类宿主细胞的一种融合搭配物，可改良人类宿主细胞的转染效率和蛋白质生产率。另外，通过选择纳马瓦细胞作为融合搭配物，(i)容易维持培养物的悬浮状态；(ii)宿主细胞是安全的，不会产生病毒粒子；
(iii)因为EBNAl蛋白在宿主细胞中连续表达，所以oriP表达载体中不需要包含EBNAl基因；(iv)细胞凋亡可通过诸如BHRFl和BALFl等病毒bcl_2同源基因来抑制。
此外，人类B细胞来源的细胞(例如纳马瓦细胞)可为具有HAT敏感性和G418抗性的细胞。为了制备本发明实施例的具有人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞两者的有用性质的人类宿主细胞，需要在细胞融合后对具有两种细胞的有用性质的克隆进行基因型选择的过程。因为人类胚肾来源的细胞(即293细胞)具有HAT抗性和G418敏感性，所以选择具有HAT敏感性和G418抗性的人类B细胞来源的细胞(例如纳马瓦细胞)作为人类胚肾来源的细胞的融合搭配物。
根据本发明的一实施例，使用293细胞和纳马瓦细胞来开发通过使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的新颖人类宿主细胞。首先，在补充有胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和6-硫鸟嘌呤的培养基中培养纳马瓦细胞系以获得具有HAT敏感性的纳马瓦细胞作为与293细胞融合的搭配物。测量纳马瓦细胞对含HAT培养基的敏感性，同时增加6-硫鸟嘌呤的浓度，历时数个月的选择期。用pSV2neo质粒转染HAT敏感性纳马瓦细胞群体，且选择对G418具有抗性的细胞群体用作293细胞的融合搭配物。接着，根据 RH.肯尼特(Kennett RH.)细胞融合(Cell fusion).酶学方法(Methods Enzymol) 58:345-359 ；1979中所揭示的使用聚乙二醇(PEG)的方法进行293细胞与HAT敏感性纳马瓦细胞的融合。然而，细胞融合并不限于所述方法且可根据所属领域中常用的方法来进行。
根据本发明的一实施例的通过使293细胞与纳马瓦细胞融合产生的人类宿主细胞被称为F2N(293与纳马瓦的融合细胞)。预期因为EBV基因组以整合到F2N染色体中的形式存在，所以在长期培养期间EBV基因组不会从F2N细胞中丢失，这与在其它特征方面与F2N细胞类似的HKB细胞不同。为了证明这种情况，选择数个F2N克隆且培养于无血清悬浮培养基中超过I年。结果，在培养于无血清悬浮培养基中超过I年的所有细胞群体中都观察到EBNAl的表达(参见图5和6)，这说明即使长时间培养F2N细胞，EBV基因组也不会从F2N细胞中丢失。
为了在F2N克隆中选择具有高转染效率的克隆，用表达IgG的pCT132载体(参见图3)转染F2N克隆的细胞,且使用酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)对转染子进行分析以评估抗体产生效率(参见图4A到4C)。一般来说，F2N细胞的转染效率高于293细胞。此外，选择克隆之一，具有高转染效率且在无血清悬浮培养基中生长良好的F2N78，接着在2008年4月11日保藏于韩国典型菌种保藏中心(KoreanCollection for Type Cultures,KCTC))(生物资源中心(Biological Resource Center),韩国生物科学与生物技术研究所(Korean Research Institute of Bioscience andBiotechnology),大田市儒城区 111 Kwahack-ro (lllKwahack-ro, Yuseong-gu, Daejeon))(保藏编号:KCTC11309BP)。
为了鉴别通过使293细胞与纳马瓦细胞融合产生的F2N细胞是否具有所需有益性质，使用从F2N78细胞中提取的mRNA进行反转 录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction, RT-PCR)以鉴别 EBNAl、Ig-μ、Ig-κ 和 N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)的表达。结果显示F2N78克隆表达EBNAl和GnTIII，但不表达IgM(参见图6)。为了鉴别EBNAl、IgM和α (2,6)唾液酸转移酶(α (2，6) ST)的表达，进行免疫荧光法(IF)。结果显示F2N78表达EBNAl和α (2，6) ST，但不表达IgM (参见图5)。在这点上，EBNAl的表达表明F2N克隆中存在EBV基因组，且GnTIII和α (2，6) ST的表达表明糖基化分布类似于人类。IgM的不表达表明在纳马瓦细胞中观察到的免疫球蛋白的表达在由细胞融合获得的F2N细胞中受到抑制。由F2N克隆(尤其由F2N78细胞)制造治疗性重组单克隆抗体需要这些特征。
因此，根据本发明的一实施例的人类宿主细胞组成性表达EBNAl蛋白，表达产生类似于人类的糖基化分布所涉及的酶，并且不表达IgM蛋白。
根据本发明的一实施例的人类宿主细胞提供EBNAl的稳定表达。EBNAl是大小为约3kb的基因并且是oriP表达载体在细胞中自主复制的必要元件。如果EBNAl以顺式或反式形式与oriP表达载体一起存在于细胞中，那么oriP表达载体可在人类细胞中正常复制。然而，如果EBNAl不与oriP表达载体分开存在(呈反式形式)，而是存在于oriP表达载体中(呈顺式形式)，那么可能会因为表达载体太大而使载体DNA不易进行操作，并且包含EBNAl基因在内的所有基因都可能无法有效地转移到细胞中并进行表达。然而，因为EBNAl蛋白由整合到F2N78细胞染色体中的EBV基因组组成性表达，所以oriP质粒在载体构建时不需要具有EBNAl基因。因此，oriP表达载体可被有效地操作，并且载体中所含的基因可容易地进行表达。
根据本发明的一实施例的人类宿主细胞也组成性表达与类似于人类的糖基化分布相关的酶。因为由根据本发明的一实施例的人类宿主细胞制造的蛋白质具有类似于人类的糖基化分布，所以相较于由诸如CHO细胞等非人类细胞制造的蛋白质，所述蛋白质可具有较低活体内免疫原性和较长活体内半衰期，从而改良基于蛋白质的药物的功效。
另外，本发明的一实施例的人类宿主细胞不表达在纳马瓦细胞中表达的IgM蛋白。因此，根据本发明的 一实施例的人类宿主细胞具有用于制造治疗性重组单克隆抗体的必要特征。
为了鉴别F2N78细胞的抗细胞凋亡活性，用不同浓度的丁酸钠处理F2N78细胞。一般来说，在细胞培养期间，丁酸钠使受CMV或SV40启动子调节的基因的表达增加(李(Lee)等人，1993，细胞(Cell) 72:73_84，考科特(Cockett)等人，1990，生物技术(Bio/technology) 8:662-667,张(Chang)等人，1999,自由基研究(Free Rad Res) 30:85-91,和高尔曼(Gorman)等人，1983,核酸研究(Nucl Acid Res) 11:7631-7648)。丁酸钠还阻滞细胞周期或诱导细胞分化，从而导致细胞凋亡(库斯特(Cuisset)等人，1998，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophy Res Commun) 246:760_764，库斯特(Cuisset)等人，1998,生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophy Res Commun) 246:760764)。然而，根据本发明的一实施例的F2N78细胞显示即使在丁酸钠处理下细胞凋亡也会减少，并且在一些情况下，生长速率比对照组(用OmM 丁酸钠处理的F2N78)高。作为对照组的纳马瓦细胞显示在丁酸钠处理后细胞存活力降低并且在所有条件下细胞生长都受到抑制，而293细胞在暴露于高浓度的丁酸钠时显示细胞凋亡(参见图9A到9D)。
为了鉴别F2N78细胞的抗细胞凋亡细胞生长，使用RT-PCR证实EBV基因组中所含的病毒bcl-2同源基因BHRFl和BALFl的表达。如图10中所示，BHRFl在未经处理与用丁酸钠处理的纳马瓦细胞中都表达。另一方面，BHRFl不在未经处理或用丁酸钠处理的F2N78细胞中表达。然而，在不考虑用丁酸钠处理的情况下，BALFl在纳马瓦细胞与F2N78细胞中都表达。BHRFl与BALFl两者都不在作为对照组的293细胞中表达。据报导，当BALFl与BHRFl两者同时表达时，BALFl抑制BHRFl的抗细胞凋亡活性(贝娄(Bellows)等人，2002，病毒学杂志(J Virol.) 76:2469_2479，马歇尔(Marshall)等人，1999，病毒学杂志(JVirol.) 73 =5181-5185) 这一特征可见于纳马瓦细胞中。因此，显示仅BALFl在F2N78细胞中表达的上述结果可证明F2N78细胞具有抗细胞凋亡活性，应阐明其潜在机制。所述抗细胞凋亡细胞生长模式也在其它F2N克隆中观察到。
因此，根据本发明的一实施例的人类宿主细胞当在丁酸钠存在下培养时显示抗细胞凋亡活性。本发明指示根据本发明的一实施例的人类宿主细胞即使当培养基中不添加丁酸钠时，也可在长期分批培养期间对天然存在的细胞凋亡具有抗性。
比较由CHO和F2N78产生的两种产生抗体的细胞系以鉴别当用丁酸钠处理时细胞的抗体生产率。与未用丁酸钠处理的对照组相比，用丁酸钠处理的CHO来源的克隆的细胞生长速率降低50%，且CHO来源的克隆的生产率加倍(参见图11)。另一方面，与未用丁酸钠处理的对照组相比，用丁酸钠处理的F2N78来源的克隆的细胞生长速率增加达2倍，且F2N78来源的克隆的生产率增加4到5倍(参见图12)。上述结果表明用丁酸钠处理的F2N78细胞的抗细胞凋亡影响抗体生产率的增加。
为了在F2N78细胞中使用oriP表达载体鉴别抗体生产率，用两种不同的oriP表达载体pCT132和pCT125转染F2N78细胞，并随后比较抗体生产率。当pCT125在质粒中包含EBNAl编码序列时，pCT132在质粒中不包含EBNAl编码序列。如图7中所示，与用pCT125转染的细胞相比，用PCT132转柒的细胞展现类似或较高的抗体生产率。一般来说，宜使用瞬时转染来制造少量新药开发过程中所需的蛋白质。因为根据本发明的一实施例的人类宿主细胞组成性表达EBNA1，所以细胞可适用于基于使用无EBNAl基因的表达载体(诸如PCT132表达载体)进行瞬时转染的新药开发。
根据本发明的一实 施例的人类宿主细胞可用于制造重组蛋白。可对人类宿主细胞进行基因工程改造以表达多种重组蛋白。所述重组蛋白可包含人类治疗性重组蛋白，例如治疗性单克隆抗体和除单克隆抗体以外的治疗性重组蛋白。
有利效果
本发明提供一种通过对人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞进行体细胞融合产生的人类宿主细胞，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因组整合到其染色体中。使用本发明的一实施例的人类宿主细胞，可在短时间内制造用于研究的蛋白质，并且可以高数量和高品质制造用于人类用途的基于异源重组蛋白的药物。
本发明的上述和其它特征和优点将通过参考附图来详细描述其例示性实施例而变得显而易见。
图1说明融合F2N细胞和选择F2N78克隆的过程。
图2A到2D说明在初始阶段F2N克隆的各种生长模式，其中在选择过程中移除如图2C和2D中所示的以聚集体形式生长的克隆。[0038]图3说明本文中所使用的表达载体的物理图。
图4A到4C说明为选择具有高IgG表达的F2N克隆所进行的瞬时转染的结果，其中图4A说明第一次筛选的结果，图4B说明从图4A中选择的17个克隆的第二次筛选的结果，并且图4C说明在最后所选的F2N78细胞与293细胞之间比较IgG生产率的结果。由三次重复实验获得图4C中所示的结果。
图5A说明Ig- μ和Ig- K的表达，且图5Β说明使用免疫荧光检验检测到的EBNAl和α (2，6)-ST的表达。
图6说明使用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测的Gntlll、Ig-μ和EBNAl在F2N78、纳马瓦和293细胞中的表达，其中使用CHO细胞作为阴性对照组。表I中显示对GntII1.1g-μ和EBNAl蛋白具特异性的引物。
图7是说明在F2N78细胞和293细胞中oriP表达载体(pCT125和pCT132)的抗体生产率的图。
图8是说明通过用pCT132对F2N78细胞进行瞬时转染所得的抗体生产率的图，所述PCT132是无EBNAl基因的表 达载体。由4次重复实验获得此处所示的结果。
图9A到9D是说明丁酸钠对CHO细胞(图9A)、纳马瓦细胞(图9B)、293细胞(图9C)和F2N78细胞(图9D)的细胞生长的影响的图，其中和4mM指示培养物中所用的丁酸钠浓度，且ImM-存活力、2mM-存活力和4mM_存活力指示用相应浓度的丁酸钠处理的培养物的细胞存活力。
图10说明使用RT-PCR检测的BHRFl和BALFl在用丁酸钠处理的F2N78、纳马瓦和293细胞中的表达，其中0、1和4指示分别添加到各培养基中的丁酸钠的浓度(mM)。表I中写出RT-PCR中所用的引物组。
图11是说明丁酸钠对CH0#247细胞的抗体生产率的影响的图。
图12是说明丁酸钠对F2N78_Ig细胞的抗体生产率的影响的图。
具体实施方式
下文将参考以下实例更详细地描述本发明。以下实施例仅出于说明性目的且不希望限制本发明的范围。
材料与方法
1.细胞和质粒
人类胚肾(293)细胞(ATCC CRL-1573)和纳马瓦细胞(ATCC CRL-1432)是从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)获得。图3说明本文中所使用的表达载体的分解图。
2.转染
使用电穿孔和基于阳离子聚合物的方法来进行转染。
电穿孔:将对数生长的3X IO6个细胞再悬浮于300 μ I含有12 μ g质粒pSV2neo载体(2 μ g)和具有基质连接区(matrix attached region, MAR)序列的载体(10 μ g)的RPMI 1640培养基中。使用GenePulse II电穿孔仪(伯乐公司(Bio-Rad)) (220V/960微法拉(microfarad))进行电穿孔。将转染子悬浮于生长培养基中并培养72小时。接着，将细胞培养于补充有lmg/mlG418和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的选择性培养基中约14天。发现经转染的细胞活跃地生长，而对照组细胞在选择性培养基中不生长。选择经转染的细胞且另外培养于补充有lmg/ml G418的选择性培养基中。通过使用新霉素基因特异性引物进行聚合酶链反应(PCR)来鉴别新霉素基因的存在。
基于阳离子聚合物的方法:根据制造商的说明书，使用Lipofectamine LTX(英杰公司(Invitrogen), 15338-100)和 FreeStyle Max (英杰公司(Invitrogen), 16447-100)进行转染。当使用Lipofectamine LTX试剂时,在转染前一天,将细胞接种于6孔板中以使得在转染当天细胞的汇合度达到每孔50%到80%。在各孔中使用2.5yg DNA和6.25 μ ILTX进行转染。当使用FreeStyle Max试剂时，在悬浮培养物中进行转染。对于悬浮培养物的转染，接种生长于无血清培养基(FreeStyle 293表达培养基,英杰公司(Invitrogen),12338，下文称为FreeStyle 293培养基)或EX-CELL 293无血清培养基(西格马公司(Sigma)，14571C，下文称为EX-CELL 293培养基)中的细胞以使得在转染当天细胞浓度被调整到每I毫升含I X IO6个细胞。在OptiPRO SFM II (英杰公司(Invitrogen)，12309)培养基中进行转染，而DNA和FreeStyle Max试剂的添加比率是1:1。
3.免疫荧光法(TF)
为了检测EBNAl 的表达，应用抗补体免疫突光法(ant1-complementimmunofIluroescence, ACIF)(瑞德曼(Reedman)和基利恩(Klein), 1973,以及福莱森(Fresen)和楚尔 豪森(zur Hausen), 1976)。首先,将细胞涂抹在载玻片上且在_20°C下使用甲醇固定5分钟。作为第一反应抗体，使用具有高抗EBNA效价的人类血清与所述细胞反应。接着，用人类补体(血清蛋白)处理细胞以扩增信号形式EBNAl，并且使用接合荧光物质的抗人类补体C3抗体(接合FITC的抗人类补体C3抗体，美国生物公司(USBiological)，C7850-14C)检测EBNAl染色。用1:1比率的甘油溶液与磷酸盐缓冲液处理所得载片。
为了检测Ig-μ和Ig-κ的表达，以与上述相同的方式，用接合荧光物质的抗人类IgM抗体(接合FITC的经亲和力纯化的山羊抗人类IgM，具有μ链特异性，西格马公司(Sigma),F5384)和接合荧光物质的抗人类κ链(山羊体内产生的经亲和力纯化的荧光素抗人类K链，威克特公司(Vector)，F1-3060)处理细胞。
为了检测a (2，6)ST蛋白的表达，以与上述相同的方式，用接合荧光物质的西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(接合FITC的西洋接骨木(接骨木树皮)_SNA_1，EY实验室(EY laboratories), F-2602)处理细胞。
4.EBNAUGnTII1、Ig-μ、BALFl、BHRFl 的 RT-PCR
使用RNeasy .Plus Mini试剂盒(恰根公司(Qiagen), 74134)从细胞中提取mRNA，并且使用OneSt印RT-PCR试剂盒(恰根公司(Qiagen)，210212)进行RT-PCR。各引物序列显示于下表I中。使用GeneAmp PCR系统9700 (应用生物系统公司(AppliedBiosystems))进行RT-PCR，且用于RT-PCR的阶段和条件如下:⑴反转录(I个循环，50°C下30分钟)；(ii)反转录酶失活和cDNA变性(I个循环，95°C下15分钟)；(iii) PCR扩增(35个循环，94°C下30秒，52°C下I分钟和72°C下30秒；和(iv)延伸(I个循环，72°C下10分钟)。使用琼脂糖凝胶电泳鉴别RT-PCR的产物。
表I.RT-PCR中所用的引物序列
权利要求
1.一种人类宿主细胞，其特征在于所述细胞i)组成性表达EBNAl蛋白；ii)不表达IgM蛋白；iii)持续产生类似于人类的糖基化分布；以及iv)表达BALFl，但不表达BHRFl，其选自通过使293细胞与纳马瓦细胞融合产生的人类宿主细胞，其中所述人类宿主细胞是F2N78,以及 F2N78 的 KCTC 保藏编号是 KCTCl 1309BP。
2.根据权利要求
1所述的人类宿主细胞，其用于制造重组蛋白。
3.根据权利要求
2 所述的人类宿主细胞，其中所述重组蛋白是单克隆抗体。
4.根据权利要求
2所述的人类宿主细胞，其中所述重组蛋白是除单克隆抗体以外的治疗性蛋白质。
专利摘要
本发明涉及一种通过使用基因工程技术使人类胚肾来源的细胞与人类B细胞来源的细胞融合产生的人类宿主细胞。具有良好保持的稳定特征的人类宿主细胞可有效地用于制造基于所需异源重组蛋白的药物。
文档编号GKCN102057038SQ200980121474
公开日2013年6月19日 申请日期2009年4月10日
发明者李炫周, 金锺默, 张珉硕 申请人:株式会社斯特利恩导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),