专利名称：:一种修复多环芳烃污染场地的混合菌剂及制备方法和应用方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于治理环境中多环芳烃的混合菌剂及其应用方法，属于有机污染场地的生物修复领域。技术背景多环芳烃(PAHs)是一种在环境中普遍存在的持久性有机污染物，因其具有致癌、致畸、致突变的毒性效应，对人类健康和生态环境均具有潜在的危险。美国环保局和欧共体以将其列为优先控制的污染物，并把PAHs的16种化合物作为环境污染的监测参数。多环芳烃类化合物具有极低的水溶性，常规方法难以将其从环境中去除。微生物修复技术被认为是降解多环芳烃污染环境治理的重要手段之一。迄今为止，现有降解多环芳烃的微生物方法多是以单一或低环或高环的多环芳烃类化合物为目标降解物。经国家知识产权局专利检索系统检索结果表明，至2009年11月30日止，降解多环芳烃的微生物菌剂的专利有io项，其中多环芳烃厌氧降解的专利有两项，其他为好氧降解菌剂。多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用(公开号CN101195811)中，采用假单胞菌对萘、菲、芘、芴等有显著厌氧降解效果。多环芳烃厌氧降解混合菌群的富集与驯化删选方法及应用(公开号CN101440354)中，20_25d后，对萘、菲、芘、芴的降解速率范围为0.01-1.04mgL—1d—、一种多环芳烃高效降解菌系及其应用(公开号CN101196810)中，7d后GP3混合菌系对芘的降解率为75.7-99.5%。一种多环芳烃降解菌及其应用(公开号CN1844361A)中，鞘氨醇单胞菌属菌株GY2B对菲的降解速率在36h后为91.7-97.8%。一种用于修复多环芳烃污染土壤的污泥菌剂的制备方法(公开号CN101302483)中介绍了污泥菌剂的详细制备过程。一种产生生物乳化剂和降解多环芳烃的赤红球菌Em及用途(公开号CN1519312)中，该菌剂对蒽、菲、芘均有降解效果。一种高环多环芳烃降解菌及其应用(公开号CN101343616)中，利用宛氏拟青霉菌F6对多环芳烃单一和混合体系进行降解，3d后。对BkF和BbF的降解率分别为33.25%和22.64%。一种用于多环芳烃污染土壤修复的固定化细菌制备方法(公开号CN101177679)中，42d后微球菌对Pyr，BAP的降解率分别为30.7%和25.7%;动胶杆菌对Pyr，BAP的降解率分别为31.4%和21.9%。一种利用新微生物菌株降解土壤中多环芳烃芘的方法(公开号CN101492648)中，利用恶臭假单胞菌新菌株PL2，经过3-10天后，对芘的降解速率为50-70%。一种多环芳烃降解菌剂的制备方法(公开号CN101423807)中，利用新型菌株Mycobacterium,sp.，经过7天。对芘和菲的降解率分别为91.5%和95.2.由上可知，目前用于多环芳烃污染修复的菌剂多是利用一到两种细菌或真菌，针对某一种或低环或高环的多环芳烃进行降解，而实际上工业污染场地往往都是16种或更多的多环芳烃同时存在，因此降解效果差。
发明内容[0005]本发明的技术解决问题克服现有技术的不足，提供一种用于降解污染场地中各种多环芳烃污染物的微生物菌剂，利用混合细菌菌株在降解多环芳烃过程中的相互协同作用以及复合载体的高活性等特点，提高对多环芳烃污染物的降解效果。本发明还提供该微生物菌剂的制备和应用方法，包括制备该微生物菌剂所使用的菌种和发酵方法。本发明的技术解决方案一种用于多环芳烃污染土壤和水体的微生物菌剂，是由降解多环芳烃的细菌按一定比例混合发酵而得的混合细菌发酵液与固体载体按质量比0.51:l混合制成。本发明的微生物菌剂是由Bordetella属、Ochrobact進属、Frateuria属、Rhodococcus属、Achcromobacter属、Herbaspirillum属、Microbacterium属等的混合细菌发酵液与复合载体按o.51:l质量比的混合物，混合菌的有效活菌数为io8-io"个/ml。本发明的微生物菌剂的制备方法，将降解多环芳烃的Bordetella属、Ochrobactrum属、Rhodococcus属、Achcromobacter属、Herbaspiri1lum属、Microbacterium属细菌的一级种子液按照21101:40200:22102:20100:1:2的体积比混合发酵，而得的混合细菌发酵液与固体载体按质量比例0.51:i混合。其中，所述的降解多环芳烃的混合细菌发酵液的制备步骤如下[0010](1)菌种来源菌种从焦化工业污染场地的土壤中以16种单一多环芳烃为唯一碳源驯化筛选所得，分别为Bordetella属、0chrobactrum属、Rhodococcussp属、Achcromobacter属、Herbaspirillum属、Microbacterium属。[0012](2)—级种子液将上述菌种分别在牛肉青蛋白胨斜面培养基上活化36-48h后，转接到液体牛肉膏蛋白胨培养基中摇瓶活化36-48h，作为一级种子液。温度3(TC、转速150-200转/min。[0014](3)混合细菌发酵液将上述各菌种的一级种子液，总接种量2%_10%体积百分比转接到发酵培养基内培养24-48h。发酵条件为，罐温30-35。C、罐压0.02-0.06MPa、通气量1:1.01.5v/v/min、搅拌速度300转/min;所述的细菌发酵液中，混合细菌的有效活菌数为108-10"个/ml。上述步骤3中的发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基。所述的固体载体的制备如下将草炭土、活性炭、锯末和稻壳风干、研磨，过60目筛，按草炭土50%，活性炭30%，锯末10%，稻壳10%混合均匀。本发明的微生物菌剂的应用，在用于多环芳烃污染的水体和土壤环境进行降解处理时，还可以添加表面活性剂和水，搅拌均匀，洒在污染场地。上述应用时，微生物菌剂用于存在多环芳烃污染的土壤和水体中，菌剂按0.42%质量百分比的施用量施入污染介质，添加量也可根据土壤污染的程度进行适当调整。[0020]本发明与现有技术相比的优点在于(1)本发明将具有多环芳烃降解能力的细菌分别进行液体纯种活化，按同一发酵条件和同一发酵培养基内进行混合培养，获得高活性的细菌发酵液。4[0022](2)本发明中采用的复合载体质地疏松，营养丰富，便于微生物吸附和二次增殖，具有很高的生物活性。(3)本发明选取了针对高环和低环多环芳烃的降解菌，各种细菌的配比依据工业污染场地中多环芳烃的组成进行设置，显著提高了菌剂对目标污染物的降解能力。[0024](4)本发明提供的固体微生物菌剂具有在土壤中活性高、生长迅速、成本低、对环境不造成二次污染的特点，便于原位生物修复的应用。图1为本发明混合菌剂的制备示意图。具体实施方式本发明所述的细菌分离自焦化化工污染场地。[0027]实施例l混合细菌发酵液的制备采用的细菌为Bordetella属、Ochrobact:r咖属、Rhodococcus属、Achcromobacter属、Herbaspirillum属、Microbacterium属，将其分别经过斜面培养、摇瓶活化培养、发酵培养得到的细菌发酵液，具体操作步骤为[0029](1)斜面培养基采用常规方法制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，具体步骤为牛肉膏2.5g，蛋白胨5g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，pH7.2-7.4，琼脂1.5%_2%搅拌均匀，于121.3"C条件下灭菌25min。灭菌后做成斜面，分别在超净工作台上。无菌接种保臧的菌株到斜面试管上，菌种在25-3(TC培养36-48h，待菌苔长满斜面备用。[0031](2)种子液的制备液体培养基仍为牛肉膏蛋白胨培养基，将配制好的液体培养基分装入150-250ml三角瓶中，装液量为20-60ml，于121.3。C条件下灭菌30min。待冷却至4(TC左右，挑取一环斜面菌苔接种于三角瓶内，然后置于摇床上培养，调整摇床转速为150-250rpm，25-3(TC培养36-48h，待培养基混浊后装入发酵培养基内培养。[0033](3)混合细菌发酵液的制备将分别活化好的细菌的种子液，按Bordetella属、Ochrobactrum属、Rhodococcussp属、Achcromobacter属、Herbaspirill咖属、Microbacterium属以21:40:22:20:i:2;51:ioo:102:50:i:2;101:200:202:100:1:2的三种比例混合。按照5%-10%(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基即牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为牛肉膏2.5g，蛋白胨5g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，pH7.2_7.4。接种后置于发酵罐内发酵培养，发酵条件为，罐温30-35t:、罐压0.02-0.06MPa、通气量1:1.01.5v/v/min、搅拌速度300转/分钟.此条件下发酵36_48h，获得高活性的混合发酵液。上述三种比例混合细菌的有效活菌数分别为2.09X1011、1.97X1011和1.46X1010个/ml。实施例2液体菌剂的降解效率验证试验在4.4mg/L的多环芳烃液体培养基中，以2%的接种量分别加入实施例所述三种配比的混合细菌液，18d后，总多环芳烃的降解率分别为49.4%、50.9%和47.4%。[0037]实施例3固体复合菌剂的制备，如图l所示。[0038](1)复合载体的制备草炭土、活性炭取自北京市北京华力航科技发展有限公司，稻壳、锯末取自北京市房山农科所。将以上载体风干，研磨，过60目筛，按草炭土50%，活性炭30%，锯末10%，稻壳10%，以上载体均风干研磨，过60目筛，混合均匀后灭菌风干备用。[0041](2)混合细菌发酵液的制备，见实施例1.(3)混合细菌发酵液与复合载体按质量比0.51:1混合均匀，通风干燥后，混合菌的有效活菌数为108-10"个/克菌剂。实施例4固体复合菌剂的降解效率验证试验取某工业污染场地作为实验小区，小区面积2mX2m，翻土0-40cm，按0.4%的量施加固体菌剂，翻土以混合均匀，并同时设置不施加菌剂作对照，小区土壤中原始多环芳烃浓度见表1，30天后，施加菌剂的小区中多环芳烃的总降解率为59.68%，对不同种类多环芳烃的降解率见表l，而空白对照中多环芳烃的总降解率为32%。[0CH5]表1现场小区菌剂修复效率(单位mg/kg)[0046]<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[0047]本发明未详细阐述属于本领域公知技术。权利要求一种用于修复污染场地中多环芳烃的混合菌剂，其特征在于由混合细菌发酵液与固体载体混合得到；所述的混合细菌发酵液是由Bordetella属、Ochrobactrum属、Rhodococcus属、Achcromobacter属、Herbaspirillum属和Microbacterium属按照21～101∶40～200∶22～102∶20～100∶1∶2的体积比混合发酵而得的菌液；所述固体载体为草炭土、活性炭、锯末和稻壳按照50％∶30％∶10％∶10％的质量百分比混合均匀而成；所述固体载体为草炭土，活性炭，锯末和稻壳按照50％∶30％∶10％∶10％质量百分比混合均匀而成；所述多种细菌混合发酵液与固体载体按质量比0.5～1∶1混合即得固体混合菌剂，混合菌剂的有效活菌数达108-1011个/g。2.—种用于修复污染场地中多环芳烃的混合菌剂的制备方法，其特征在于将降角牟多环芳经的Bordetella属、Ochrobactrum属、Rhodococcus属、Achcromobacter属、Herbaspirillum属禾口Microbacterium属细菌的一级禾中子液按照21101:40200:22102:20ioo:i:2的体积比混合发酵，而得的混合细菌发酵液与固体载体按质量百分比o.51:i混合，其中，所述的降解多环芳烃的混合细菌发酵液的制备步骤如下(1)菌种来源菌种从焦化工业污染场地的土壤中以16种单一多环芳烃为唯一碳源驯化筛选所得，分别为Bordetella属、Ochrobactrum属、Rhodococcussp属、Achcromobacter属、Herbaspirillum属、Microbacterium属；(2)—级种子液将上述菌种分别在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化36-48h后，转接到液体牛肉膏蛋白胨培养基中摇瓶活化36-48h，作为一级种子液，温度3(TC、转速150-200转/min;(3)混合细菌发酵液将上述各菌种的一级种子液，总接种量2%-10%的体积百分比转接到发酵培养基内培养24-48h;发酵条件为，罐温30-35。C、罐压0.02-0.06MPa、通气量1:1.01.5v/v/min、搅拌速度300转/min;所述的细菌发酵液中，混合细菌的有效活菌数为1()8-10"个/g;所述的固体载体的制备如下将草炭土、活性炭、锯末和稻壳风干、研磨，过60目筛，按草炭土50%，活性炭30%，锯末10%，稻壳10%的质量百分比混合均匀。3.根据权利要求2所述的一种用于修复污染场地中多环芳烃的混合菌剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中的发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基。4.一种用于修复污染场地中多环芳烃的混合菌剂的应用方法，其特征在于按所述权利要求1得到的混合菌剂的0.42%质量百分比用量施入污染介质，混匀即可起到修复作用，该菌剂可用于污染场地中土壤和水体的多环芳烃污染修复。专利摘要一种用于污染场地中多环芳烃降解的混合菌剂及其制备方法，属于环境污染修复工程领域。该菌剂所用的菌种是由Bordetella属、Ochrobactrum属、Rhodococcus属、Achcromobacter属、Herbaspirillum属和Microbacterium属按照21～101∶40～200∶22～102∶20～100∶1∶2的比例混合发酵而得的菌液。该菌液与固体载体按质量比例0.5～1∶1混合即得固体菌剂，混合菌剂的有效活菌数达108-1011个/g。本发明的混合菌剂能高效去除污染场地土壤和水中的多环芳烃，且在场地中具有活性高，生长繁殖快，适应性强，对环境不造成二次污染等优点。文档编号C12N11/00GKCN101735996SQ200910242388公开日2010年6月16日申请日期2009年12月10日发明者廖晓勇,阎秀兰,马栋申请人:中国科学院地理科学与资源研究所导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan