一种防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白的制作方法

专利名称:一种防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，涉及到水产动物养殖技术领域：
，特别涉及到一种防治对安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其应用、。
背景技术：
1907年，Tyzzer在小鼠粘膜组织切片首次发现隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)，隐 包子虫病(Cryptosporidiosis)成为一种世界性分布的人兽共患寄生虫病。该原虫广泛寄生于哺乳类、禽类、爬行类和两栖类等240种以上的人和动物，可致人类腹泻，尤其是婴幼儿和免疫功能低下或缺陷者致命性的腹泻。本病主要引起畜禽腹泻和呼吸道症状，导致生产性能下降或死亡。近年来，对隐孢子虫病研究已成为医学界、兽医学界研究关注的热点。
卵黄抗体(egg yolk immunoglobulins, IgY)是禽类B淋巴细胞在抗原物质剌激下所产生并沉积在卵黄中的能与抗原发生特异性反应的一种球蛋白，主要是免疫球蛋白G，是禽类在长期进化过程中形成的用于提高雏禽抵抗力的物质。IgY与哺乳动物的IgG在分子结构上相似，但其又具一些特有的生物学特性IgY的Fc区不与人或细菌Fc受体结合，IgY不激活哺乳类动物和人的补体系统，IgY不与人血清中抗哺乳动物抗体的抗体反应，如人的抗IgG抗体，IgY不与葡萄球菌蛋白A(SPA)或链球菌蛋白G(SPG)结合，这在免疫诊断中具有重要意义。
病原特异性IgY抗体，由于其对病原的针对性，从而可以用于特异性治疗，而且因其来源于鸡蛋，没有毒副作用、不存在药物残留、不存在环境污染，对于生产绿色食品，无疑具有很大的优势。特别对于药物治疗效果不佳，或者没有可用于治疗的病原性疾病，可以用此方法生产IgY生物制剂。
隐孢子虫病目前尚没有有效治疗药物，虽然在世界范围内作了大量的药物筛选工作，但到目前为止，仍然没有进入临床应用的文献报道。关于抗隐孢子虫IgY抗体制备方法的研究，国内外罕见报道，本研究通过研制抗安氏隐孢子虫(C. andersoni) IgY抗体，制备包含不同抗原成分的免疫抗原，通过IgY抗体和血清抗体产生的动态规律、抗体应答的持久性，确立了最佳制备方法，为今后制备大量隐孢子虫特异性IgY抗体，或其它弱免疫原性病原特异性IgY抗体提供了最基础的技术。
公开号为CN1569229名称为抗口腔及上呼吸道感染IgY产品及其应用的专利申请，公开了涉及多种具有特异性抗感染功能的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备技术、用于预防龋齿、治疗牙周病及口腔粘膜病、预防及治疗流行性感冒、治疗咽喉炎。公开号为CN1621090名称为特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及其制备方法及用途的专利申请，公开了一种特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及制备方法和用途。该冻干制剂的组份包括特异性免疫球蛋白、赋型剂和溶剂中溶质。其它还有公开号为CN1583792、 CN1602720CN1620886、 CN1646565、 CN1201693的专利、，虽然公开了许多卵黄免疫球蛋白的制法和应用，但没有针对防治对安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其应用。
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发明内容
本发明的目的是提供一种防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现一种防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋
白，其制作步骤如下
a.从安氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊，
b.然后将收集的卵囊进行分离；
C用蔗糖梯度离心法纯化分离后的卵囊；
d.然后将卵囊制备成安氏隐孢子虫抗原；
e.用安氏隐孢子虫抗原免疫产卵禽，然后收集其所产禽卵；
f.从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。
步骤a中所述的卵囊是指收集阳性畜粪便中卵囊，卵囊呈长卵圆形，卵囊大小为6.21 9. liimX5. 12 7. 25 ii m。
步骤b中所述的进行分离是指用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊，27% (W/V)的蔗糖溶液粗提卵囊。
步骤c中所述的用蔗糖梯度离心法纯化分离后的卵囊是指
①配制蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌；
②配制PBS缓冲液NaCL 8. Og， KCLO. 2g， KH2P040. 2g， Na2HP04 12H202. 9g，蒸馏
水1000mL，调ra值7. 4后灭菌；
③将蔗糖原液与PBS缓冲液配制为
③将蔗糖原液与PBS缓冲液配制为
a、 1份蔗糖原液加入1份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为30. 4称为1 : 1蔗糖水；
b、 1份蔗糖原液加入2份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为25称为1 : 2蔗糖水；
c、 1份蔗糖原液加入3份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为18. 7称为1 : 3蔗糖水；
d、2份蔗糖原液加入7份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为16. 8称为1 : 3. 5蔗糖水；
e、 1份蔗糖原液加入5份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为12. 5称为1 : 5蔗糖水；
卵囊用10mL直径1. 2cm的玻璃离心管提纯，程序如下
a、先加入l : l蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份卵囊悬浮液，3000rmin-l，10min，以吸管吸出卵囊层，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；
b、加入l : 2蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份a步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-l， 10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；
5[0030] c、加入l : 3蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份b步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-l， 10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中，再重复一次；
d、加入l : 3.5蔗糖水1份，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1 : 5蔗糖液l份，最上层加入l : 3蔗糖提取物卵囊悬液l份，再沿玻璃管壁缓慢加l份c步骤重复洗涤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-l，10min，回收卵囊层悬浮液；
⑤用PBS缓冲液稀释后以5 ii m滤膜微滤除菌，浓縮后加入终浓度为1000U/mL的
双抗，4t:保存。
步骤d中所述的制备成颗粒性安氏隐孢子虫抗原的方法为将纯化除菌后的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于PBS缓冲液中(108/mL)，冰浴超声波(80HZ)2minX5次破碎卵囊，再反复冻融5次(液氮与水浴37°C ) ， 4°C ， 10， OOOrmin-l离心卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度法测蛋白浓度，_20°〇保存备用；沉淀部分加入适量PBS缓冲液，以2
倍体积的福氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原，乳化好的疫苗4t:保存；
步骤d中所述的制备成可溶性安氏隐孢子虫抗原的方法为将提纯的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于0. 5% SDS中，煮沸lh。 4°C 8，900r min-l离心10min，弃去沉淀。上清液加5倍体积的丙酮，-20°〇过夜，沉淀。8， 900r min-l离心10min，将白色沉淀重悬于高压过的PBS溶液中，测定其蛋白浓度。抗原以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原。
步骤e中所述的用安氏隐孢子虫抗原免疫产卵禽是指鸡群的免疫，共免六次，每次间隔15 20d，抗原与2倍体积的佐剂混匀制成油乳剂，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，每次2mL.只-1。颗粒性抗原组含量分别为一免1X107个'只-1，二免1X107个 只-l，三免1. 5X107个 只-1，四免1. 5X107个 只-l，五免2. 5X107个*只-l，六免2. 5X 107个*只-1，免疫注射方式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。可溶性抗原组含量分别为一免40 ii g 只-1， 二免40 ii g 只-1，三免80 ii g 只-1，四免80ii g 只-l，五免120ii g 只-l，六免120ii g 只-l，免疫注射方式同颗粒性抗原组。[0036] 步骤f中所述的从禽卵中收集蛋黄是指取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液与灭菌单蒸水(D.W)按l : 9稀释，充分搅拌混匀，调ra值至5. 1 5. 4，置4°C ， 6h或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心(10，000rmin-l，4°C 10min)，弃沉淀，获取上清液；经水稀释硫酸铵盐析法是指纯化水稀释二步硫酸铵盐析法，将预处理上清液，加入50%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4t:作用2h以上，离心(10， 000rmin-l，4。C 10min)，弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4t:作用2h以上，离心(10， 000rmin-l，4°C 10min)，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，流水透析过夜，次日以1 : 1000以上的PBS缓冲液搅拌透析，3h左右换液一次，透析3d，获抗体蛋白，加1000U/mL的双抗，-2(TC冷藏。[0037] 所述的防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品是用于防治安氏隐孢子虫及其它隐孢子虫引起的原发病的生物制剂。
所述的防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品是作为增强免疫功能的保健
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6[0039] 本发明的效果和益处是，应用本技术方案制备出的抗安氏隐孢子虫病的特异性 IgY直接作用于安氏隐孢子虫病症的病原体，发挥特异性抑制作用，克服其它药物的使用对 于病毒本身并无杀灭作用的缺点，生产成本亦很低。

[0040]图1为本发明PCR扩增产物电泳结果；
图2为本发明PCR产物Sspl酶切结果；
图3为本发明隐孢子虫卵囊颗粒性免疫原；
图4为本发明两个实验组卵黄抗体ELISA效价比较；
图5为本发明卵黄抗体抗体的蛋白电泳分析；
图6为本发明卵黄抗体抗体的免疫印迹分析；
图7为本发明阴性卵黄治疗对照组；
图8为本发明阳性卵黄治疗组；
图9为本发明感染对照组；
图10为本发明感染对照组与阴性卵黄治疗组OPG值比较曲线；
图11为本发明阴性卵黄治疗组与抗贝氏隐孢子虫卵黄治疗组OPG值比较曲线；
图12为本发明阴性卵黄治疗组与抗贝安氏隐孢子虫卵黄三个治疗组OPG值比较曲线。
具体实施方式
[0052]实施例1
一种防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其制作步骤如下
a.从安氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊，所述的卵囊是指收集阳性畜粪便中卵
囊，卵囊呈长卵圆形，卵囊大小为6. 21 9. liimX5. 12 7. 25 y m。[0055]b.然后将收集的卵囊进行分离；所述的进行分离是指用饱和蔗糖溶液漂浮法收
集卵囊，27% (W/V)的蔗糖溶液粗提卵囊。[0056]c.用蔗糖梯度离心法纯化分离后的卵囊；所述的用蔗糖梯度离心法纯化分离后
的卵囊是指[0057]①配制蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌；
②配制PBS缓冲液NaCL 8. 0g， KCLO. 2g， KH2P04 0. 2g， Na2HP04 12H202. 9g，蒸
馏水1000mL，调ra值7. 4后灭菌；
③将蔗糖原液与PBS缓冲液配制为
a、 1份蔗糖原液加入1份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为30. 4称为1 : 1蔗 糖水；
b、 1份蔗糖原液加入2份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为25称为1 : 2蔗糖 水；
c、 1份蔗糖原液加入3份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为18. 7称为1 : 3蔗 糖水；
d、2份蔗糖原液加入7份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为16. 8称为1 : 3. 5蔗糖水；
e、 1份蔗糖原液加入5份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为12. 5称为1 : 5蔗 糖水；
卵囊用10mL直径1. 2cm的玻璃离心管提纯，程序如下
a、先加入l : l蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份卵囊悬浮液，3000rmin-l， 10min，以吸管吸出卵囊层，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓 冲液中；
b、加入l : 2蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份a步骤沉淀悬浮于适量PBS缓 冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-l， 10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓 冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；
c、加入l : 3蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份b步骤沉淀悬浮于适量PBS缓 冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-l， 10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓 冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中，再重复一次；
d、加入l : 3.5蔗糖水1份，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1 : 5蔗 糖液l份，最上层加入l : 3蔗糖提取物卵囊悬液l份，再沿玻璃管壁缓慢加l份c步骤重 复洗涤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-l，10min，回收卵囊层悬浮 液；
⑤用PBS缓冲液稀释后以5 ii m滤膜微滤除菌，浓縮后加入终浓度为1000U/mL的
双抗，4t:保存。
d.然后将卵囊制备成安氏隐孢子虫抗原；所述的制备成颗粒性安氏隐孢子虫抗 原的方法为将纯化除菌后的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于PBS缓冲液中(108/mL)，冰浴超声波 (80HZ)2minX5次破碎卵囊，再反复冻融5次(液氮与水浴37°C ) ，4°C， 10， OOOrmin-1离心 卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度法测蛋白浓度，-20°〇保存备用；沉 淀部分加入适量PBS缓冲液，以2倍体积的福氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原，
乳化好的疫苗4t:保存。
e.用安氏隐孢子虫抗原免疫鸡，然后收集其所产禽卵；所述的用安氏隐孢子虫抗 原免疫产卵禽是指鸡群的免疫，共免六次，每次间隔15 20d，抗原与2倍体积的佐剂混匀 制成油乳剂，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，每次2mL.只-1。颗粒性 抗原组含量分别为一免1X107个*只-l，二免1X107个*只-l，三免1. 5X107个.只-1， 四免1. 5 X 107个 只-1 ，五免2. 5 X 107个 只-1 ，六免2. 5 X 107个 只-1 ，免疫注射方 式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。可溶性抗原组含量分别为一免40ii g 只-1， 二免40ii g 只-1，三免80ii g 只-1，四免80ii g 只-1，五免120ii g 只-1，六免 120ii g 只-l，免疫注射方式同颗粒性抗原组。
f.从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化 得到卵黄免疫球蛋白。所述的从禽卵中收集蛋黄是指取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒 后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液与灭菌单蒸水(D.W)按l : 9稀释，充 分搅拌混匀，调ra值至5. 1 5. 4，置4°C ， 6h或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵 黄脂质后，离心(10，000rmin-l，4°C 10min)，弃沉淀，获取上清液；经水稀释硫酸铵盐析法 是指纯化水稀释二步硫酸铵盐析法，将预处理上清液，加入50%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4°C作用2h以上，离心(10，000rmin-l，4°C 10min)，弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入
33%饱和硫酸铵，搅拌均匀，41:作用2h以上，离心(10， 000rmin-l，4°C 10min)，获取沉淀溶
于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，流水透析过夜，次日以1 : 1000以上的PBS缓冲液
搅拌透析，3h左右换液一次，透析3d，获抗体蛋白，加1000U/mL的双抗，-2(TC冷藏。
所述的防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品是用于防治安氏隐孢子虫及
其它隐孢子虫引起的原发病的生物制剂。
实施例2
步骤d中，所述的制备成可溶性安氏隐孢子虫抗原的方法为将提纯的安氏隐孢子 虫卵囊悬浮于0. 5% SDS中，煮沸lh。 4°C 8，900r min-l离心10min，弃去沉淀。上清液 加5倍体积的丙酮，-20°〇过夜，沉淀。8， 900r min-l离心10min，将白色沉淀重悬于高压 过的PBS溶液中，测定其蛋白浓度。抗原以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免 疫用抗原。步骤e中，用安氏隐孢子虫抗原免疫鹅。其他步骤同实施例l. 所述的防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品是作为增强免疫功能的保健
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以上实施例中提到的鸡，鹅可以是鹆子，鸭，鹌勢等禽类。
本发明的实验报告如下
高免安氏隐孢子虫IgY抗体的制备方法
l材料与方法
1. 1卵囊的扩增与纯化收集某牛场阳性粪便中卵囊，呈长卵圆形，测得卵囊大小为 7. 25iimX6. 33iim(6.21 9. liimX5. 12 7. 25 y m)形状指数1. 22，用饱和蔗糖溶液漂 浮法收集卵囊，27% (W/V)的蔗糖溶液粗提卵囊，18sRNA序列比对分析，确定为安氏隐孢子 虫(C. andersoni)。
参照Arrowood等方法，加以改进以蔗糖梯度离心法纯化卵囊。蔗糖原液配 法蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌备用；PBS缓冲液NaCL 8. 0g， KCLO. 2g， KH2P040. 2g， NaHP04 12H20 2. 9g，蒸馏水1000mL，调PH值7. 4后灭菌备用。
表1蔗糖液的种类及浓度
种类原液PBS缓冲液蔗糖浓度(W/W%)
1: 11130.4
1: 21225
1: 31318.7
1: 3.52716.8
1: 51512.5
卵囊用10mL直径1. 2cm的玻璃离心管提纯，程序如下先加入1 : 1蔗糖水2份 (约6mL)，再沿玻璃管壁缓慢加1份卵囊悬(约3mL)，3000rmin-l，10min，以吸管吸出卵 囊层，加2倍体积PBS离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS中，然后依次用1 : 2蔗糖水， 1 : 3蔗糖水(两次)，同上方法离心，收集每次卵囊层，以PBS离心洗涤后悬浮，最后一次
9以l : 3.5蔗糖液3mL，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入l : 5蔗糖液3mL，最上 层加入l : 3蔗糖提取物卵囊悬液3mL，3000rmin-l，10min，回收卵囊层。每次离心后的样 品分别取出显微镜观察各层样品的纯度，PBS稀释后以5ym滤膜微滤除菌，血细胞计数板 计数，浓縮后加入终浓度为1000U/mL的双抗，4t:保存备用。
1. 2抗原的制备颗粒性抗原将纯化除菌后的C. andersoni卵囊悬浮于PBS液中 (108/mL)，冰浴超声波(80HZ) 2minX 5次破碎卵囊，再反复冻融5次(液氮与水浴37°C )。 4°C， 10， OOOrmin-l离心卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度法测蛋白 浓度，_201:保存备用；沉淀部分加入适量PBS液，以2倍体积的福氏完全或非完全佐剂乳 化，作为免疫用抗原，福氏佐剂参照文献方法制备，乳化好的疫苗fC保存备用。 可溶性抗原将提纯的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于0. 5 % SDS中，煮沸lh。 4°C 8，900r min-l离心10min，弃去沉淀。上清液加5倍体积的丙酮，_201:过夜，沉淀。 8，900r "min-l离心10min，将白色沉淀重悬于高压过的PBS溶液中，测定其蛋白浓度。抗 原以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原。提纯的安氏隐孢子虫卵囊 悬浮于0. 5% SDS中，煮沸lh。 4°C 8， 900r *min-l离心10min，弃去沉淀。上清液加5倍体 积的丙酮，-2(TC过夜，沉淀。8， 900r min-1离心10min，将白色沉淀重悬于高压过的PBS 溶液中，测定其蛋白浓度。抗原以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用可溶 性抗原。
1. 3鸡群的免疫试验动物由市郊某蛋鸡场提供150日龄海兰蛋鸡24只，分成3组， 每组8只。分组免疫情况如下。
第一组颗粒性抗原组，共免六次，每次间隔15 20d，抗原与2倍体积的佐剂混 匀制成油乳剂，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，每次lmLv口、-l，抗原 含量分别为一免1 X 107个 只-1， 二免1 X 107个 只-1，三免1. 5X 107个 只_1，四免 1. 5 X 107个. 只-1 ，五免2. 5 X 107个 只-1 ，六免2. 5 X 107个 只-1 ，免疫注射方式为 鸡颈背下皮肤及胸部肌肉多点肌肉注射。
第二组可溶性抗原组，共免六次，每次间隔15 20d，抗原与2倍体积的佐剂混 匀制成油乳剂，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，每次lmLv口、-l，抗原 含量分别为一免40 ii g 只-1， 二免40 ii g 只-l，三免80 ii g 只-1，四免80 ii g 只-1， 五免120iig'只-l，六免120iig'只-l，免疫注射方式同上。 第三组对照组，不做免疫。
1. 4抗体效价的检测采用间接ELISA法测定各组鸡群的血清和卵黄抗体水平，按 常规操作步骤在聚丙乙烯微量板上进行。取前述可溶性抗原，用包被液(0. 05M，pH9.6碳酸 盐缓冲液)稀释成适当浓度，每孔100iiL，4。C过夜，以PBST(0. OIM， pH7. 4PBS加入0. 05% 吐温-20，以下同)洗涤6次；1% BSA-PBST封闭37°C lh，洗涤；加入适当稀释的待检血清 或卵黄液，并以已知阴性血清或卵黄液(未免前采集样品)作阴性对照，37t:作用lh，洗涤； 加入工作浓度1 :1000稀释的HRP-兔抗鸡IgG标记二抗，37t:作用lh后洗涤；以四甲基联 苯胺(TMB)底物溶液，室温显色10 15min，2M硫酸终止反应。酶联免疫检测仪在450nm 波长下测定吸光值(A450)。
1. 5IgY抗体的收集纯化与测定
1. 5. 1IgY抗体的分离纯化参照相关文献以酸化水稀释二步盐析法，收集纯化卵黄
10中的IgY抗体。卵黄的预处理取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋 清及卵黄衣膜，获得卵黄液(约10mL/枚)与灭菌单蒸水(D.W)按1 : 9稀释，充分搅拌混 匀，调ra值至5. 1 5. 4，置4°C ， 6h或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后， 离心(10，000rmin-l，4。C 10min)，弃沉淀，获取上清液。
水稀释二步硫酸铵盐析法上述预处理上清，加入50%饱和硫酸铵，搅拌均匀， 4。C作用2h以上，离心(10， OOOr 'min-l，4。C 10min)，弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀， 加入33%饱和硫酸铵，同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置常规处理过的透 析袋中，流水透析过夜，次日以1 : 1000以上的PBS搅拌透析，3h左右换液一次，透析3d， 获抗体蛋白，加入1000U mL的双抗，-2(TC冷藏备用。
1. 5. 2IgY抗体的纯度测定用SDS-PAGE方法，鉴定盐析方法纯化抗体所达到的纯 度。参照文献分别配制8X分离胶，5X浓縮胶，装入电泳仪，浓縮胶电压80V，当染料前沿进 入分离胶后，将电压提高到130，染料前沿到达距分离胶底部lcm时关闭电源，置考马斯亮 兰R-250染色液，室温染色4h或过夜，转至脱色液中脱色，至凝胶背底透明，蛋白条带清晰，
判读结果并拍照后，置保存液4t:保存。
2结果与讨论
2. 1牛隐孢子虫卵囊的PCR-RFLP鉴定
图1中M :DL 2000Marker ;1， 2分别为DY1，DY2的PCR产物；P为C. baileyii阳性 对照；N为阴性对照
用巢式PCR成功扩增了 2个通过形态学初步定为牛安氏隐孢子虫分离株的
18SrDNA基因的部分片段。扩增结果见图1。
图2中M :DL 2000Marker ;1，2分别为DY1， DY2
2个分离株DY1，DY2第二次PCR产物用Sspl进行酶切鉴定(图6)，酶切片段大小 为450bp和396bp，为安氏隐孢子虫。
2. 2牛安氏隐孢子虫抗原的制备
牛安氏隐孢子虫在制备颗粒性抗原过程中经过反复冻融和超声裂解，大部分卵囊 已破碎，可以在400倍显微镜下看到破碎的卵囊壁和子孢子(见图3)。
图3中l一卵囊壁；2—子孢子
各免疫组鸡群血清和卵黄抗体水平的持续性观察比较
本次试验中用颗粒性抗原和可溶性抗原免疫待产母鸡。从一免第15d开始采集各 免疫组鸡只的血清和鸡蛋，每间隔15d采样一次，直至免疫后180d，应用间接ELISA方法检 测各组的血清抗体和卵黄抗体水平(见表2、图4)。
颗粒性抗原和可溶性抗原组的卵黄抗体水平在首免后7d即可检测到抗体，但效 价偏低。五免前，卵黄抗体水平上升较慢。从六免开始，抗体水平开始较快增长。两个组试 验鸡只均在首免后135d抗体效价达到最高。其高峰期持续60d以上，在180d还能检测到 较高的抗体滴度，免疫抗原梯度递增的免疫程序，使得抗原持续剌激机体产生高水平特异 性抗体(见图4)。
表2两个组血清抗体ELISA效价比较
11时间 组别
_颗粒性抗原组_可溶性抗原组
Id 0 0
15d 1: 100 1: 100
30d 1: 100 1: 200
45d 1: 200 1: 400
60d 1: 400 1: 800
75d 1: 800 1: 1600
卯d 1: 1600 1: 6400
105d 1:6400 1:12800
120d 1:12800 1:25600
135d 1:25600 1:51200
150d 1:12800 1:51200
165d 1:6400 1:25600
180d 1:3200 1:12800
见表2所示血清抗体先于卵黄抗体产生，血清抗体的消长趋势与卵黄抗体的基本 一致。在抗体高峰期，血清抗体的水平要低于卵黄抗体水平。
2. 3IgY抗体的纯化效果
以水稀释-盐析法纯化卵黄中的IgY抗体，经还原法SDS-PAGE电泳后，免疫球蛋 白裂解为重链和轻链，从图5可以看出，重链分子量约68KD，轻链约26KD，分别为IgY的重 链和轻链，已知IgY的分子结构是2H+2L结构，从而推断全分子的相对分子质量为约190KD， 与文献报道的IgY分子量约为180-200KD相符。同时SDS-PAGE电泳显示基本没有杂带，纯 度高。本次实验获得的IgY抗体，经SDS-PAGE分离后，未提纯时呈现10条以上清晰蛋白条 带，是因为还含有其他相对分子质量的蛋白条带，主要的有96KD、74KD、62KD、49KD和23KD 等蛋白条带，提纯后能获得较纯的抗体。紫外分光光度计测定提取的抗C.andersoni IgY 抗体的蛋白浓度为9. 21mg mL。
图5中M-Marker蛋白质分子量标准(低)，l，2-提纯的IgY，3-未提纯的IgY
2. 4免疫印迹法对IgY抗体的抗原定位
图6中M-Marker蛋白质分子量标准(低)；1-牛安氏可溶性抗原；2-阳性卵黄； 3_阴性卵黄
对反复冻融和超声处理的牛安氏隐孢子虫离心后上清进行蛋白电泳和 western-bloting反应，抗牛安氏隐孢子虫特异性IgY的反应情况如图6所示。IgY抗体不 止有一条反应带，可与牛安氏隐孢子虫可溶性蛋白的分子量为26KD和68KD的条带反应，而
12阴性卵黄没有反带。
抗C. andersoni特异性卵黄抗体对自然感染奶牛的治疗试验
隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种全球性的人兽共患寄生虫病。引起畜禽
腹泻和呼吸道症状，而且在人类，对免疫功能低下或缺陷者，尤其是婴幼儿和AIDS患者，引
发致命性的腹泻，甚至危及生命。隐孢子虫病已被列为引起人类最常见的6种腹泻疾病之
一。2003年，该病被列为我国须重点防范的两个重要寄生虫病之一。近年来，隐孢子虫病的
研究成为一个新的热点。目前，国内外，已有100余种药物在实验室和临床试验中用于治疗
隐孢子虫病的感染，迄今尚未有公认的特效药和治疗方法，筛选和研制越来越引起人们的
重视。本研究制备抗安氏隐孢子虫(C. andersoni)特异性IgY抗体，进行实验动物人工感
染治疗试验，现报告如下。
l材料与方法
1. l试验前预备
(l)Sheather蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌备用。
(2) PBS缓冲液NaCL 8. Og，KCL g，KH2P040. 2g， NaHP04 12H20 2. 9g，蒸馏水定容
至1000mL，调ra值7. 2 7. 4后灭菌备用。
(3)孔雀绿染色液孔雀绿染料1. 6g，十二烷基磺酸钠1. 0g，蒸馏水100mL溶解混匀。
1. 2抗安氏隐孢子虫(C. andersoni)特异性IgY的制备
1. 2. 1安氏隐孢子虫(C. andersoni)卵囊抗原的制备颗粒性抗原参照Arrowood 等(1987)、胡景辉等方法，加以改进以蔗糖梯度离心法纯化卵囊，低速离心结合5ym滤膜 微滤除菌，将纯化除菌后的C. andersoni卵囊冰浴超声波破碎卵囊，再反复冻融，获得颗粒 性抗原，以福氏完全或不完全佐剂乳化，制备免疫用抗原。
可溶性抗原提纯的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于0. 5 % SDS中，煮沸lh。 4°C 8，900r min-l离心10min，弃去沉淀。上清液加5倍体积的丙酮，_201:过夜，沉淀。 8，900r "min-l离心10min，将白色沉淀重悬于高压过的PBS溶液中，测定其蛋白浓度。抗 原以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原。
1. 2. 2免疫产蛋母鸡市郊某蛋鸡场提供150日龄海兰蛋鸡24只，分颗粒性抗原组、 可溶性抗原组和对照组。颗粒性抗原组首免含量为1X107个，只-l，二免lX107个*只-1， 三免1. 5X107个*只-1，四免1. 5X107个*只_1，五免2. 5X 107个*只-l，六免2. 5X107 个 只-1 ，免疫注射方式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。，每次免疫间隔15 20d， 除首免用福氏完全佐剂，其余各免均用福氏不完全佐剂，免疫方式为鸡翅下和大腿内侧肌 肉多点肌肉注射。可溶性抗原组抗原含量分别为一免40ii g *只_1，二免4011 g *只-l，三 免80 ii g 只-1，四免80 ii g 只-1，五免120 ii g 只-1，六免120 ii g 只-1，免疫注射方 式同上。对照组以空白疫苗(PBS液与福氏佐剂乳化)作相对应的免疫。六免后，开始收集
鸡蛋，保存于4t:冰箱备用。
1. 2. 3阴性对照IgY与特异性IgY的提取、纯化采用酸化水稀释粗提IgY，而后分 别用50%和33%饱和度的饱和硫酸铵溶液盐析纯化，并用紫外分光光度计测所提IgY抗体 的蛋白浓度。
1. 2. 4IgY活性效价的测定采用间接ELISA法测定。[0133] 1.3试验用牛
对郑州市郊某牛场进行流行病学调查，确定阳性牛安氏隐孢子虫感染牛6头，连 续粪检3天，观察牛安氏隐孢子虫卵囊排出变化，卵囊排出量稳定再确定治疗方案。 1.4试验分组
动物感染治疗试验将6头牛分成三个试验组，分组用药情况如下
第一试验组感染对照组，阳性牛2头，饲料饮水正常供给。
第二试验组阴性卵黄治疗组，阳性牛2头，通过灌胃给予阴性卵黄治疗，每日每 头灌喂18个鸡蛋量的阴性卵黄，连续用3d，饲料饮水正常供给。
第三试验组阳性卵黄治疗组，阳性牛2头，通过灌胃给予阳性抗牛氏隐孢子虫卵 黄治疗，每日每头灌喂18个鸡蛋量的阳性卵黄，连续用3d，饲料饮水正常供给。 1.6试验方法与观察指标
1. 6. 1排出卵囊的变化规律
自感染牛安氏隐孢子虫的牛灌服卵黄24h后，每天收集每个组新鲜粪便，连续 60d，用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊、孔雀绿染色、血细胞计数板检查计数，观察不同组的 排卵规律，包括潜隐期、高峰期、持续期、卵囊强度，并计算每克粪便的卵囊数(OPG)，操作步 骤如下
(1)饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊分别称各组每头牛粪便5g，加入50mL自来水 浸泡，玻璃棒搅拌均匀，以80目滤筛除去大粪渣，滤液以3000r min-l离心10min，弃去上 清，沉淀加入饱和蔗糖溶液，搅匀均匀，3000r *min-l离心10min，然后用铁丝环蘸取液面表 层6 8次，置于清水中，如此重复操作3次后，离心浓集卵囊，以PBS缓冲液定容至5mL。 (2)孔雀绿染色血细胞计数板计数卵囊数用移液管分别吸取上一步的卵囊悬 液0. 2mL与0. 8mL孔雀绿染液，置1. 5mL离心管中充分混匀，放置5min后，混匀取适量注 入血细胞计数器，在400X光学显微镜下计数，计算公式每克粪便中卵囊个数(OPG)= [A/4X 5 X 5 X 104] /M(A为卵囊总数，M为粪便重量)。
1.6. 2临床症状的观察
试验过程中观察和记录各组临床症状(食欲、饮欲、粪便、精神状态)，以下述标准
观察判定(-):无临床异常。(+):精神一般，食欲欠佳，但无腹泻症状。(++):精神较差，食
欲低下，有轻度腹泻症状。(+++):精神沉郁，食欲低下，有腹泻症状。(#):精神沉郁，反应迟
钝，食欲显著低下。(++◎):精神沉郁，食欲低下，有明显的呼吸道症状。
2结果与分析
2. 1各组排卵囊规律观察结果
阴性卵黄治疗组排卵囊规律本试验组共有2头牛，牛号分别为1026和5054，其 OPG值和排卵囊规律如图7。从图7中可以看出，本组两头牛在本次治疗过程中经历2个排 卵囊高峰，与第一个高峰相比，第二个高峰排卵囊强度要大，高峰持续时间要长。但是，两个 高峰的区别不大。
阳性卵黄治疗组排卵囊规律阳性卵黄治疗组两头牛牛号分别为5089和5091，其 0PG值和排卵囊规律如图8。从图8可以看出，两头牛基本都经历两个排卵囊周期，灌服抗 安氏高免卵黄后，第一个高峰期排卵囊量显著减少，由于药效的持续时间可能有限，第二个 高峰期排卵囊量大幅度增多。[0151]
感染对照组排卵囊规律6049和6061两头牛在两个高峰期的排卵囊强度和持续
时间基本一致，差别不大，如图9。
抗隐孢子虫特异性卵黄抗体的交叉保护试验
隐孢子虫(Cryptosporidium spp)是一种世界广泛存在的可引起人兽共患传播 的寄生性原虫，它不仅能感染野生动物和家养畜禽，还能感染人，特别是免疫抑制人群。尽 管隐孢子虫可以感染各个年龄段的人群，但是仅在感染儿童和免疫抑制病人时才能引起严 重的后果。隐孢子虫病不仅能使正常人发生自限性腹泻，还能导致像艾滋病患者这类免疫 抑制人群迁延性致死性腹泻。自从20世纪70年代隐孢子虫病确诊以来，已证实隐孢子虫 病在新生畜禽的腹泻中扮演着重要角色。隐孢子虫病的主要临床表现为精神沉郁、食欲减 退、腹痛直至腹泻，并伴有大量卵囊的排出。最终，造成体重下降和生长发育迟缓。目前，尽 管很多药物已经用于治疗隐孢子虫病，但是尚未见公认有效的治疗药物用于控制隐孢子虫 病。卵黄抗体的研究是近年来生物技术领域：
和医药研究的新热点，卵黄抗体在治疗其它疾 病上已有广泛运用。目前，抗隐孢子虫特异性高免卵黄抗体已用于隐孢子虫病的治疗研究。 本研究利用制备的抗安氏隐孢子虫(C. andersoni)特异性高免卵黄及本实验室制备的抗 贝氏隐孢子虫(C.baileyii)特异性高免卵黄进行动物隐孢子虫感染的交叉保护试验，现 报告如下
l材料与方法
1. l试验前预备
(l)Sheather蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌备用。
(2) PBS缓冲液NaCL 8. 0g， KCL g， KH2P04 0. 2g， NaHP04 12H20 2. 9g，蒸馏水定
容至1000mL，调ra值7. 2 7. 4后灭菌备用。
(3)孔雀绿染色液孔雀绿染料1. 6g，十二烷基磺酸钠1. 0g，蒸馏水100mL溶解混匀。
1. 2抗安氏隐孢子虫(C. andersoni)特异性IgY的制备
1. 2. 1安氏隐孢子虫(C. andersoni)卵囊抗原的制备颗粒性抗原参照Arrowood 等(1987)、胡景辉等方法，加以改进以蔗糖梯度离心法纯化卵囊，低速离心结合5ym滤膜 微滤除菌，将纯化除菌后的C. andersoni卵囊冰浴超声波破碎卵囊，再反复冻融，获得颗粒 性抗原，以福氏完全或不完全佐剂乳化，制备免疫用抗原。
可溶性抗原提纯的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于0. 5 % SDS中，煮沸lh。 4°C 8，900r min-l离心10min，弃去沉淀。上清液加5倍体积的丙酮，_201:过夜，沉淀。 8，900r "min-l离心10min，将白色沉淀重悬于高压过的PBS溶液中，测定其蛋白浓度。抗 原以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原。
1. 2. 2免疫产蛋母鸡市郊某蛋鸡场提供150日龄海兰蛋鸡24只，分颗粒性抗原组、 可溶性抗原组和对照组。颗粒性抗原组首免含量为1X107个，只-l，二免lX107个*只-1， 三免1. 5X107个*只-1，四免1. 5X107个*只_1，五免2. 5X 107个*只-l，六免2. 5X107 个 只-1 ，免疫注射方式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。，每次免疫间隔15 20d， 除首免用福氏完全佐剂，其余各免均用福氏不完全佐剂，免疫方式为鸡翅下和大腿内侧肌 肉多点肌肉注射。可溶性抗原组抗原含量分别为一免40ii g *只_1，二免4011 g *只-l，三 免80 ii g 只-1，四免80 ii g 只-1，五免120 ii g 只-1，六免120 ii g 只-1，免疫注射方
15式同上。对照组以空白疫苗(PBS液与福氏佐剂乳化)作相对应的免疫。六免后，开始收集
鸡蛋，保存于4t:冰箱备用。
1. 2. 3阴性对照IgY与特异性IgY的提取、纯化采用酸化水稀释粗提IgY，而后分 别用50%和33%饱和度的饱和硫酸铵溶液盐析纯化，并用紫外分光光度计测所提IgY抗体 的蛋白浓度。
1. 2. 4IgY活性效价的测定采用间接ELISA法测定。 1.3试验鸡
河南省宝丰市郊某孵化厂提供1日龄罗曼小公鸡105只，隔离饲养，连续粪检3d 寄生虫，虫卵阴性后，选择健康活泼者用于试验。 1.4试验分组
本次动物感染治疗试验共105只雏鸡，分成七个试验组，分笼饲养于无隐孢子虫 环境中，各组之间保证无交叉污染，正常饲喂全价雏鸡饲料，O. 2%双杀王，0. 2%克球粉自 由饮水，分组感染卵囊量和用药情况如下
第一试验组阳性抗安氏隐孢子虫卵黄大剂量治疗组，经食道嗉囊感染C. baileyi 卵囊1. 7X106个 只-l，感染后第3d进行卵黄抗体治疗，每日灌喂量2000 ii g 只-l，连 续用10d，饲料饮水正常供给。
第二试验组阳性抗安氏隐孢子虫卵黄中剂量治疗组，经食道嗉囊感染C. baileyi 卵囊1. 7X106个 只-l，感染后第3d进行卵黄抗体治疗，每日灌喂量1000 ii g 只-l，连 续用10d，饲料饮水正常供给。
第三试验组阳性抗安氏隐孢子虫卵黄小剂量治疗组，经食道嗉囊感染C. baileyi 卵囊1. 7X106个*只-l，感染后第3d进行卵黄抗体治疗，每日灌喂量500ii g *只-l，连续 用10d，饲料饮水正常供给。
第四试验组阳性抗贝氏隐孢子虫IgY治疗保护组，经食道嗉囊感染C. baileyi卵 囊1. 7X106个 只-l，感染后第3d进行IgY抗体治疗，每日灌喂量1000 ii g 只-l，连续 用10d，饲料饮水正常供给。
第五试验组阴性卵黄治疗对照组，经食道嗉囊感染C. baileyi卵囊1.7X106 个 只-l，感染后第3d进行阴性卵黄治疗，每日灌喂量1000 ii g 只-l，连续用10d，饲料 饮水正常供给。
第六试验组感染对照组，经食道嗉囊感染C. baileyi卵囊1. 7X 106个 只_1，
饲料饮水正常供给。
第七试验组空白对照组，饲料饮水正常供给。
1.5试验方法与观察指标
1. 5. 1排出卵囊的变化规律
自感染鸡贝氏隐孢子虫的雏鸡灌服卵黄24h后，每天收集每个组新鲜粪便，连续 25d，用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊、孔雀绿染色、血细胞计数板检查计数，观察不同组的 排卵规律，包括潜隐期、高峰期、持续期、卵囊强度，并计算每克粪便的卵囊数(OPG)，操作步 骤如下
(1)饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊分别称各组鸡粪便5g，加入50mL自来水浸泡， 玻璃棒搅拌均匀，以80目滤筛除去大粪渣，滤液以3000r min-l离心10min，弃去上清，沉淀加入饱和蔗糖溶液，搅匀均匀，3000r *min-l离心10min，然后用铁丝环蘸取液面表层6 8次，置于清水中，如此重复操作3次后，离心浓集卵囊，以PBS缓冲液定容至5mL。 (2)孔雀绿染色血细胞计数板计数卵囊数用移液管分别吸取上一步的卵囊悬 液0. 2mL与0. 8mL孔雀绿染液，置1. 5mL离心管中充分混匀，放置5min后，混匀取适量注 入血细胞计数器，在400X光学显微镜下计数，计算公式每克粪便中卵囊个数(OPG)= [A/4X 5 X 5 X 104] /M(A为卵囊总数，M为粪便重量)。
1.6. 2对体重增重的影响
感染前和试验结束时，对各试验组鸡只称重，计算各组的平均增重值，以衡量治疗 过程中对体重增重的影响。计算公式各组平均增重=试验结束时平均体重_试验开始时 均重。
2结果与分析
2. 1各组排卵囊规律观察结果
感染对照组和阴性卵黄治疗对照组比较感染对照组和阴性卵黄治疗组相比较， 潜隐期、高峰期和持续期基本一致，在排卵囊强度方面，阴性卵黄治疗组较感染对照组稍有 降低，考虑可能是阴性卵黄中的免疫球蛋白对隐孢子虫有一定的抑制作用(如图IO所示)。 阴性卵黄治疗组和抗贝氏隐孢子虫IgY治疗保护组抗贝氏IgY治疗组与阴性卵 黄治疗组相比，高峰期OPG值下降70% ，从感染后第10 16天抗贝氏IgY治疗组OPG值下 降幅度为81 % 34% ，抗贝氏IgY治疗组感染后第20天停止排卵囊，抗贝氏高免卵黄治疗 组较阴性卵黄对照组排卵囊持续时间减少2天(见图11)。
阴性卵黄治疗组与抗安氏隐孢子虫高免卵黄三个治疗剂量组比较从图12可以 看出，与阴性治疗组相比，抗安氏高免卵黄3个治疗组排卵囊强度减小，卵囊排出时间縮 小，高峰期OPG值均较低。
抗安氏高免卵黄大剂量治疗组高峰期0PG值下降58X，从感染后第10 16d OPG值下降幅度为74% 63%，第20天停止排卵囊，较阴性卵黄对照组排卵囊持续时间减 少2d。
抗安氏高免卵黄中剂量治疗组高峰期0PG值下降42X，从感染后第10 16d 0PG值下降幅度为70X 65X，第20d停止排卵囊，较阴性卵黄对照组排卵囊持续时间减少 2天。
抗安氏高免卵黄小剂量治疗组高峰期OPG值下降18%，从感染后第10 16d
OPG值下降幅度为50% 44%，排卵囊持续时间和阴性卵黄对照组一样。
2. 2对体重增重的影响观察记录各组感染前后生长增重的情况。各组感染前后体
重变化见表3。
表3各组鸡体重变化
17组别试验前平均体重 g g试验后平均体重平均增重g
第一组(15只)58.53200.36141.83
第二组(15只) 5 8.53203.72145.19
第三组(15只)58.53198.18139.65
第四组(15只)58.53223.09164.5.6
第五组(15只)58.6213.5154.9
第六组(15只)58.6184.4125.8
第七组(15只)58.33 '227.36169.03
观察、记录各组试验前后增重的情况。各组试验前后体重变化见表13。试验结果 表明，雏鸡感染贝氏隐孢子虫影响增重。第六组，感染对照组鸡群的平均增重明显低于另外 六个组，分析原因可能是第六组虫体寄生体内的时间长，虫体寄生的强度也大，大量虫体的 寄生破坏消化道黏膜吸收养分功能，降低饲料利用率，影响鸡体增重。抗贝氏隐孢子虫卵黄 保护组的平均增重高于抗安氏隐孢子虫卵黄抗体治疗组，但差异不显著，且阴性卵黄对照 治疗组的平均增重还略高于安氏卵黄治疗组。各个组增重均较空白对照组低，可见隐孢子 虫感染对雏鸡的增重还是有一定影响的。 3小结
隐孢子虫病是一种重要的人兽共患原虫病。隐孢子虫病可以致使新生畜禽发生急 性经常性腹泻，艾滋病人的长期腹泻10% 20%是由隐孢子虫引起的。患隐孢子虫病的人 畜主要症状是精神沉郁、腹痛、腹泻，并伴有大量卵囊的排出，并导致体重下降和增重缓慢。 已经有大量药物如磺胺类、化学类、抗生素类药物用于隐孢子虫病的防治，国内还用中药做 了尝试，但疗效不够确实，特别是化学类药物还容易产生抗药性。因此，广大科研工作者展 开了隐孢子虫免疫防治方法的研究，在疫苗、高免初乳、高免卵黄、单克隆抗体和高免血清 等研究方面还取得了 一定的成果。
卵黄抗体(IgY)是禽类蛋黄中含有的一种免疫球蛋白，近年来对卵黄抗体的研究 不断深入，IgY技术已成为生物技术领域：
和医药研究中的新热点，IgY抗体化学性质稳定， 产量高、成本低，以及动物种系距离的优势，更始应于生产特异性抗体，能够开发为功能性
食品，增强免疫功能的保健品和新药。卵黄抗体是一种多克隆抗体，在试验一中所做的卵黄 抗体特异性鉴定表明该抗体具有较好的属特异性，并且隐孢子虫不同有效种之间存在抗原 交叉。因此，通过研究抗不同隐孢子虫特异性卵黄抗体对同种隐孢子虫或者同一抗隐孢子 虫高免卵黄对不同有效种隐孢子虫的保护意义重大。本实验已确实两种卵黄抗体都对同一 种隐孢子虫有治疗作用，对于一些不易扩增的隐孢子虫，特别是人隐孢子虫的防治提供了 重要参考。
权利要求
一种防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是制作步骤如下a.从安氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊，b.然后将收集的卵囊进行分离；c.用蔗糖梯度离心法纯化分离后的卵囊；d.然后将卵囊制备成安氏隐孢子虫抗原；e.用安氏隐孢子虫抗原免疫产卵禽，然后收集其所产禽卵；f.从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。
2. 根据权利要求
l所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是步骤a 中所述的卵囊是指收集阳性畜粪便中卵囊，卵囊呈长卵圆形，卵囊大小为`6.21 9. liimX5. 12 7. 25 ii m。
3. 根据权利要求
2所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是步骤b中所 述的进行分离是指用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊，27% (W/V)的蔗糖溶液粗提卵囊。
4. 根据权利要求
3所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是步骤c中所 述的用蔗糖梯度离心法纯化分离后的卵囊是指① 配制蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌；② 配制PBS缓冲液NaCL 8. 0g， KCLO. 2g， KH2P04 0. 2g， Na2HP04 12H202. 9g，蒸馏水 1000mL，调PH值7. 4后灭菌;③ 将蔗糖原液与PBS缓冲液配制为a、 1份蔗糖原液加入1份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为30. 4称为1 : 1蔗糖水；b、 1份蔗糖原液加入2份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为25称为1 : 2蔗糖水；c、 1份蔗糖原液加入3份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为18. 7称为1 : 3蔗糖水；d、 2份蔗糖原液加入7份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为16. 8称为1 : 3. 5蔗糖水；e、 1份蔗糖原液加入5份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W% )为12. 5称为1 : 5蔗糖水； 卵囊用10mL直径1. 2cm的玻璃离心管提纯，程序如下a、 先加入1 : 1蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份卵囊悬浮液，3000rmin—、 lOmin， 以吸管吸出卵囊层，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液 中；b、 加入l : 2蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份a步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲 液中的卵囊悬浮液，3000rmin—、 10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液 离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；c、 加入l : 3蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加l份b步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲 液中的卵囊悬浮液，3000rmin—、 10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液 离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中，再重复一次；d、 加入l : 3.5蔗糖水1份，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1 : 5蔗糖液 1份，最上层加入1 : 3蔗糖提取物卵囊悬液1份，再沿玻璃管壁缓慢加1份c步骤重复洗 涤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin—、 10min，回收卵囊层悬浮液； 用PBS缓冲液稀释后以5 ii m滤膜微滤除菌，浓縮后加入终浓度为1000U/mL的双抗，4t:保存。
5. 根据权利要求
4所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是步骤d中所 述的制备成颗粒性安氏隐孢子虫抗原的方法为将纯化除菌后的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于 PBS缓冲液中(107mL)，冰浴超声波(80HZ) 2minX 5次破碎卵囊，再反复冻融5次(液氮与 水浴37°C ) ， 4°C ， 10， OOOrmin—1离心卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度 法测蛋白浓度，-2(TC保存备用；沉淀部分加入适量PBS缓冲液，以2倍体积的福氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原，乳化好的疫苗4t:保存；
6. 根据权利要求
5所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是步骤d中所 述的制备成可溶性安氏隐孢子虫抗原的方法为将提纯的安氏隐孢子虫卵囊悬浮于0.5% SDS中，煮沸lh。 4°C 8， 900r 'min—1离心10min，弃去沉淀。上清液加5倍体积的丙酮，_20°C 过夜，沉淀。8， 900r min—1离心10min，将白色沉淀重悬于高压过的PBS溶液中，测定其蛋 白浓度。抗原以2倍体积的弗氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原。
7. 根据权利要求
6所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是步骤e中所 述的用安氏隐孢子虫抗原免疫产卵禽是指鸡群的免疫，共免六次，每次间隔15 20d，抗原 与2倍体积的佐剂混匀制成油乳剂，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂， 每次2mL.只—、颗粒性抗原组含量分别为一免lXl(f个v口、—、二免lXl(f个v口、—、三免 1. 5X 107个*只—、四免1. 5X 107个*只—、五免2. 5X 107个*只—、六免2. 5X 107个*只—、 免疫注射方式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。可溶性抗原组含量分别为一免 40 ii g 只—、二免40 ii g 只—、三免80 ii g 只—、四免80 ii g 只—、五免120 ii g 只—、 六免120 ii g 只—、免疫注射方式同颗粒性抗原组。
8. 根据权利要求
7所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是步骤f中 所述的从禽卵中收集蛋黄是指取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液与灭菌单蒸水(D.w)按i : 9稀释，充分搅拌混匀，调ra值至5. 1 5.4，置4t:，6h或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心 (10， OOOrmin—、4t: 10min)，弃沉淀，获取上清液；经水稀释硫酸铵盐析法是指纯化水稀释 二步硫酸铵盐析法，将预处理上清液，加入50%饱和硫酸铵，搅拌均匀，41:作用2h以上，离 心(10， OOOrmin—、 4°C 10min)，弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33%饱和硫酸铵， 搅拌均匀，4t:作用2h以上，离心(10， OOOrmin—、4t: 10min)，获取沉淀溶于原卵黄液体积的 PBS中，置透析袋中，流水透析过夜，次日以1 : 1000以上的PBS缓冲液搅拌透析，3h左右 换液一次，透析3d，获抗体蛋白，加1000U/mL的双抗，-2(TC冷藏。
9. 根据权利要求
7所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是所述的防治 安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品是用于防治安氏隐孢子虫及其它隐孢子虫引起的 原发病的生物制剂。
10. 根据权利要求
7所述的防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其特征是所述的防治 安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品是作为增强免疫功能的保健品。
专利摘要
本发明提供了一种防治安氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品及其应用。一种防治隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白，其制作步骤如下a.从安氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊，b.然后将收集的卵囊进行分离；c.用蔗糖梯度离心法纯化分离后的卵囊；d.然后将卵囊制备成安氏隐孢子虫抗原；e.用安氏隐孢子虫抗原免疫产卵禽，然后收集其所产禽卵；f.从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。应用本技术方案制备出的抗安氏隐孢子虫病的特异性IgY直接作用于安氏隐孢子虫病症的病原体，发挥特异性抑制作用，克服其它药物的使用对于病毒本身并无杀灭作用的缺点，生产成本亦很低。
文档编号A61P33/00GKCN101735320SQ200810231068
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月25日
发明者宁长申, 张龙现, 菅复春, 马超锋 申请人:河南农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan