一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品和应用的制作方法

专利名称：一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及到水产动物养殖技术领域，特别涉及到一种防治对贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其应用，此种IgY可以用作防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的生物制剂和增强免疫功能的保健品。
背景技术：
1907年，Tyzzer在小鼠粘膜组织切片首次发现隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)，隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)成为一种世界性分布的人兽共患寄生虫病。该原虫广泛寄生于哺乳类、禽类、爬行类和两栖类等180种以上的人和动物，可致人类腹泻，尤其是婴幼儿和免疫功能低下或缺陷者致命性的腹泻。引起畜禽腹泻和呼吸道症状，导致生产性能下降或死亡。近年来，对隐孢子虫病研究已成为医学界、兽医学界研究关注的热点。
鸡的卵黄免疫球蛋白主要是IgG，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(Yolk Immunobudin G)，简称为IgY。IgY与哺乳动物的IgG在分子结构上相似，但其又具一些特有的生物学特性IgY的Fc区不与人或细菌Fc受体结合，IgY不激活哺乳类动物和人的补体系统，IgY不与人血清中抗哺乳动物抗体的抗体反应，如人的抗IgG抗体，IgY不与葡萄球菌蛋白A(SPA)或链球菌蛋白G(SPG)结合等；由某种特定病原抗原刺激产生的IgY是一种特异性的免疫球蛋白，对该病原具有针对性，从而可以用于特异性治疗，而且因其来源于鸡蛋，没有毒副作用、不存在药物残留、不存在环境污染，此外它的性能稳定，耐热、耐酸碱和高渗环境，便于贮存和加工，对于生产治疗性药物(如口服胶囊)和绿色功能性食品，无疑具有很大的优势。特别对于药物治疗效果不佳，或者没有可用于治疗的病原性疾病，可以用此方法生产IgY生物制剂进行针对治疗。
隐孢子虫病目前尚无特效治疗药物，虽然在世界范围内作了大量的药物筛选工作，但到目前为止，仍然没有进入临床应用的文献报道。关于抗隐孢子虫IgY抗体制备方法的研究，国内外罕见报道，本研究通过研制抗贝氏隐孢子虫(C.baileyi)IgY抗体，对制备免疫抗原、设计免疫程序，通过IgY抗体和血清抗体产生的动态规律、抗体应答的持久性，确立了最佳制备方法，为今后制备大量隐孢子虫特异性IgY抗体，或其它弱免疫原性病原特异性IgY抗体提供了最基础的技术。
公开号为CN1569229名称为抗口腔及上呼吸道感染IgY产品及其应用的专利申请，公开了涉及多种具有特异性抗感染功能的鸡卵黄免疫球蛋白IgY的制备技术、用于预防龋齿、治疗牙周病及口腔粘膜病、预防及治疗流行性感冒、治疗咽喉炎。公开号为CN1583792名称为一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用的专利申请，公开了涉及到水产动物养殖技术领域，特别涉及到一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其制备方法。其特征是将对虾白斑综合症病毒类的一种或多种灭活毒株/减毒毒株/基因亚单位免疫原/核酸免疫原制成单一抗原或复合抗原，以产蛋禽类作为生物反应器，免疫获得抗对虾白斑综合症特异性IgY，该IgY可单独或与肽聚糖、益生素及中草药组合共同作为饲料添加剂、药用浸浴剂或虾池泼洒剂的活性成分应用于对虾病害防治。本发明的效果和益处是该IgY通过被动免疫机制发挥作用，直接抑杀病毒，增强虾体免疫力，在预防和治疗对虾白斑综合症具有效果显著、安全、环保、使用方便等优点。公开号为CN1602720名称为含鸡卵黄免疫球蛋白的蛋粉的生产方法的专利申请，公开了含鸡卵黄免疫球蛋白的蛋粉的生产方法，首先选择含有鸡卵黄免疫球蛋白鸡蛋消毒清洗；将蛋壳和蛋液分离，将收集到的蛋黄、蛋清液搅拌混合均匀制成蛋液，对蛋液过滤除去蛋液中的碎蛋壳及其它杂物；然后，对蛋液采用巴氏杀菌消毒，再采用离心喷雾干燥法或压力喷雾干燥法对蛋液进行干燥，干燥后的蛋粉通过装有每英寸24孔的筛网进行筛分，除去粗大颗粒，再经称量后包装即可。公开号为CN1620886名称为一种预防龋齿的冰淇淋的专利申请，公开了一种用于种预防龋齿的冰淇淋，由雪糕冰淇淋1000重量份、抗龋齿卵黄免疫球蛋白(Igy)0.1-50重量份、抗龋齿卵黄免疫球蛋白稳定剂和冷冻保护剂0.5-35重量份组成；该冰淇淋的制备方法为雪糕冰淇淋配料之后，于冷冻之前，将欲加入的IgY粉先用少量冷开水溶解，然后将稳定剂，保护剂加入混匀并在搅拌运动下呈细流倒入雪糕冰淇淋配料中，充分搅拌均匀，按一般制作雪糕冰淇淋规定的温度和时间冷冻，即得抗龋齿冷饮冰淇淋雪糕；公开号为CN1621090名称为特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及其制备方法及用途的专利申请，公开了一种特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及制备方法和用途。该冻干制剂的组份包括特异性免疫球蛋白、赋型剂和溶剂中溶质。其制备方法包括制备特异性病原体抗原；将该特异性病原体抗原加等量不完全福氏佐剂充分乳化作免疫原；用该免疫原对产蛋禽类动物进行强化免疫；从强化免疫后的产蛋禽类动物所产卵中提取特异性卵黄免疫球蛋白；将特异性卵黄免疫球蛋白与赋型剂、溶剂混合得到冻干原液；将冻干原液经冷冻干燥法制成特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂。本发明制备的卵黄免疫球蛋白制剂其特异性卵黄免疫球蛋白不易变性，可保持天然活性，加水溶解即可。该冻干制剂可用在制备由病原微生物引起的消化道感染疾病的药物或食品、保健品中。公开号为CN1646565名称为用于防治口腔疾病的IgY制备方法以及基于该IgY的牙膏的专利申请，公开了一种用于防治多种口腔疾病的卵黄免疫球蛋白的制备方法，以及以之为主要原料的安全牙膏。在制备IgY时，根据引致龋齿、牙周病、口臭的主要病原体，采用常规方法分别培养出主要的几种致病菌，用所培养的菌种制成复合抗原，然后用所述复合抗原对产蛋家禽(包括鸡、鸭、火鸡等)进行注射，再取家禽所生的免疫蛋的蛋黄制成所需的IgY。利用所述IgY制成牙膏。公开号为CN1201693名称为抗轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白产品及其应用和活性检测法的专利申请，公开了含有抗体活性的抗A组轮状病毒鸡卵黄免疫球蛋白(抗-ARV IgY)的产品，其制备方法采用含A组轮状病毒的抗原皮下注射免疫鸡10天后收集其所产卵的卵黄，通过已知的提取抗-ARV IgY粗品的方法得到粗品，再经下述步骤纯化a.将粗提抗-ARV IgY过DEA E-SephadexA↓[50]凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥再溶解；b.过SephadexG↓[200]凝胶色谱柱，加缓冲液洗脱，除盐，冷冻干燥得到抗-ARV I gY纯品。公开号为CN1526735名称为一种免疫球蛋白及其制备方法和应用的专利申请，公开了一种免疫球蛋白，采用无特定病原体产蛋母鸡分别进行肠道病毒70型和柯萨奇病毒A24型强化免疫；采用无菌磷酸缓冲液匀化免疫鸡卵卵黄，加入聚乙二醇6000，经离心15～20分钟，收集上清，加入聚乙二醇6000，离心20分钟，收集沉淀，用无菌磷酸缓冲液溶解沉淀，加入聚乙二醇6000，离心20分钟，完成脱脂；收集沉淀，进行PEGDEAE-Sephacel柱层析凝胶过滤脱盐、层析，采用磷酸缓冲液洗脱目的蛋白；50％饱和度硫酸铵浓缩目的蛋白；用无菌磷酸缓冲液在4℃～8℃下透析，获得提纯的特异性鸡卵抗体，即所需的免疫球蛋白。其它还有公开号为CN1435260、CN1439281、CN1250056、的专利申请，虽然公开了许多卵黄免疫球蛋白的制法和应用，但没有针对防治对贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其应用。

发明内容
本发明的目的是提供一种防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的卵黄免疫球蛋白生物制剂和增强免疫功能的卵黄免疫球蛋白保健品。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现1、一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，该产品可以从以下步骤所获得，首先从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊进行分离后用蔗糖梯度离心法纯化卵囊，并制备成贝氏隐孢子虫抗原，用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。
2、所述的从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊是指收集阳性畜粪便中卵囊，卵囊呈长卵圆形，测得卵囊大小为6.5μm x 4.7μm形状指数1.31，经3日龄鹌鹑盲传清除混有的鸡球虫卵囊。经本实验室建立动物感染模型及18sRNA序列比对分析，确定为贝氏隐孢子虫。以3日龄雏鸡传代扩增，以获取大量抗原。
3、所述的用蔗糖梯度离心法纯化卵囊是指，①配制蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌；②配制PBS缓冲液NaCL 8.0g，KCL 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaHPO4·12H2O2.9g，蒸馏水1000mL，调PH值7.4后灭菌；③将①蔗糖原液与②PBS缓冲液配制为a、1份蔗糖原液加入1份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为30.4称为1∶1蔗糖溶液；b、1份蔗糖原液加入2份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为25称为1∶2蔗糖溶液；c、1份蔗糖原液加入3份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为18.7称为1∶3蔗糖溶液；d、2份蔗糖原液加入7份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为16.8称为1∶3.5蔗糖溶液；e、1份蔗糖原液加入5份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为12.5称为1∶5蔗糖溶液；④卵囊用10mL直径1.2cm的玻璃离心管提纯，程序如下a、先加入2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；b、加入1∶2蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份a步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；c、加入1∶3蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份b步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中，再重复一次；d、加入1∶3.5蔗糖水1份，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1∶5蔗糖液1份，最上层加入1∶3蔗糖提取物卵囊悬液1份，再沿玻璃管壁缓慢加1份c步骤重复洗涤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，回收卵囊层悬浮液；⑤用PBS缓冲液稀释后以5μm滤膜微滤除菌，浓缩后加入终浓度为1000U/mL的双抗，4℃保存。
5、所述的制备成贝氏隐孢子虫抗原是指将纯化除菌后的贝氏隐孢子虫卵囊悬浮于PBS缓冲液中(108/mL)，冰浴超声波(80HZ)2min×5次破碎卵囊，再反复冻融5次(液氮与水浴37℃)，4℃，10,000rmin-1离心卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度法测蛋白浓度，-20℃保存备用；沉淀部分加入适量PBS缓冲液，以2倍体积的福氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原，乳化好的疫苗4℃保存。
6、所述的用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽是指鸡群的免疫，共免六次，每次间隔15～20d，抗原与2倍体积的佐剂混匀制成油乳剂，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，每次1mL/只，抗原含量分别为一免1×107个/只，二免2×107个/只，三免3×107个/只，四免3×107个/只，五免5×107个/只，六免5×107个/只，免疫注射方式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。
7、所述的收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液是指取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液(约10mL/枚)与灭菌单蒸水(D.W)按1∶9稀释，充分搅拌混匀，调PH值至5.1～5.4，置4℃，6h或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心(10,000rmin-1，4℃10min)，弃沉淀，获取上清液；8、所述的经水稀释硫酸铵盐析法纯化是指水稀释二步硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入50％饱和度的饱和硫酸铵，搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心(10,000rmin-1，4℃10min)，弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33.3％饱和度的饱和硫酸铵，同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS液(0.01M，pH7.4)中，置常规处理过的透析袋中透析，流水透析过夜，次日以1000倍以上的PBS液(0.01M，pH7.4)搅拌透析，3小时左右换液一次，透析3天，获抗体蛋白，加1000U/mL的双抗，-20℃冷藏。
9、所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品的用途，是用于防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的生物制剂。
10、所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品的用途，是作为增强免疫功能的保健品。
本发明的效果和益处是，应用本技术方案制备出的抗贝氏隐孢子虫病的特异性IgY直接作用于贝氏隐孢子虫病症的病原体，发挥特异性抑制作用，克服其它药物的使用对于病毒本身并无杀灭作用的缺点，生产成本亦很低。
具体实施例方式
高免贝氏隐孢子虫IgY抗体的制备方法一、免疫抗原的制备1、贝氏隐孢子虫卵囊的扩增与纯化收集市区某畜牧站阳性粪便中卵囊，呈长卵圆形，测得卵囊大小为6.5μm x 4.7μm也就是(5.4～7.8μm x 4.1～5.5μm)形状指数1.31，经3日龄鹌鹑盲传清除混有的鸡球虫卵囊，经本实验室建立动物感染模型及18sRNA序列比对分析，确定为贝氏隐孢子虫(C.baileyi)后，以3日龄健康雏鸡传代，大量扩增贝氏隐孢子虫卵囊。
参照Arrowood等方法，加以改进以蔗糖梯度离心法纯化卵囊。蔗糖原液配法蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌备用；PBS缓冲液NaCL 8.0g，KCL 0.2g，KH2PO40.2g，NaHPO4·12H2O 2.9g，蒸馏水1000mL，调PH值7.4后灭菌备用。
卵囊用10mL直径1.2cm的玻璃离心管提纯，程序如下先加入1∶1蔗糖溶液2份(约6mL)，再沿玻璃管壁缓慢加1份卵囊悬(约3mL)，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层，加2倍体积PBS液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PB液S中，然后依次用1∶2蔗糖溶液，1∶3蔗糖溶液(两次)，同上方法离心，收集每次卵囊层，以PBS液离心洗涤后悬浮，最后一次以1∶3.5蔗糖溶液3mL，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1∶5蔗糖溶液3mL，最上层加入1∶3蔗糖提取物卵囊悬液3mL，3000rmin-1，10min，回收卵囊层。每次离心后的样品分别取出显微镜观察各层样品的纯度，PBS液稀释后以5μm滤膜微滤除菌，血细胞计数板计数，浓缩后加入终浓度为1000U/mL的双抗，4℃保存备用。
表1蔗糖溶液的种类及浓度

2、抗原的制备将纯化除菌后的C.baileyi卵囊悬浮于PBS液中(108个/mL)，冰浴超声波(80HZ)2min×5次破碎卵囊，再反复冻融5次(液氮与水浴37℃)。4℃，10,000rmin-1离心卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度法测蛋白浓度，-20℃保存备用；沉淀部分加入适量PBS液，和2倍体积的福氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原，福氏佐剂参照文献方法制备，乳化好的疫苗4℃保存备用。
二、鸡群免疫1、设置不同的实验组，确定免疫程序试验动物由市郊某蛋鸡场提供150日龄，初开产海兰蛋鸡40只，分成5组，每组8只。分组免疫情况如下。
第一组共免二次，一免，抗原含量为5×107个卵囊/2mL.只-1，弗氏完全佐剂；间隔六周后二免，抗原含量为5×107个卵囊/2mL.只-1，弗氏不完全佐剂，免疫注射方式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。
第二组共免六次，每次间隔15～20d，抗原含量分别为一免1×107个/只，二免2×107个/只，三免3×107个/只，四免3×107个/只，五免5×107个/只，六免5×107个/只，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，免疫注射方式同上。
第三组共免四次，每次间隔15～20d，每免抗原含量均为1×107个/只，一免、二免用弗氏完全佐剂外，三免、四免用弗氏不完全佐剂，免疫注射方式同上。
第四组卵囊计数1×107个.只-1，活卵囊经口灌喂165日龄海兰灰蛋鸡。
第五组以空白疫苗即PBS溶液(0.01M，pH7.4)与2倍体积的佐剂混匀制成油乳剂，每次2mL/只，免六次，每次间隔15～20d，一免二免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，免疫注射方式同上。
2、建立间接ELISA方法，检测与监测各免疫鸡群组的抗体水平建立间接ELISA法测定各组鸡群的血清和卵黄抗体水平按常规操作步骤在聚丙乙烯微量板上进行。取前述可溶性抗原，用包被液(0.05M，pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释成适当浓度，每孔100μL，4℃过夜，以PBST(0.01M，pH7.4PBS加入0.05％吐温-20，以下同)洗涤6次；1％BSA-PBST封闭37℃ 1h，洗涤；加入以1％BSA-PBST适当稀释的待检血清或卵黄液，并以已知阴性血清或卵黄液(未免前采集样品)作阴性对照，洗涤；加入HRP-兔抗鸡IgG标记二抗，37℃孵育后洗涤；以四甲基联苯胺(TMB)底物溶液，室温显色，2M硫酸终止反应。酶联免疫检测仪在450nm波长下测定吸光值，观察结果。
表2五个实验组血清抗体效价比较

从一免第15d开始采集各免疫组鸡只的血清和鸡蛋，每间隔15d采样一次，直至六免结束，应用间接ELISA方法检测各组的血清抗体和卵黄抗体水平。由表2可见，一、二、三组在一免后15d均可测到低水平的抗体，但在二免后各组抗体上升水平差异极显著。第一组一免后抗体水平缓慢上升，间隔6周的二免并未使抗体水平显著提高；第三组抗体水平始终维持低水平状态；第四组活卵囊感染组与第五组空白免疫组均未检测到抗体；第二组为本次抗体水平上升较好的实验组，免疫抗原的梯度递增的免疫程序，刺激产生高水平的特异性抗体，在六免后达到峰值区域，并能持续3个月左右。因此我们选择第二组的免疫程序。对第二组的血清抗体与卵黄抗体水平消长规律进行了比较，由图1可见，第二组母鸡免疫后血清抗体逐渐上升，四免后升幅更为显著，在六免后15d，血清抗体水平达到峰值区域(1∶180000～1∶213000)，持续8周左右逐渐下降。卵黄抗体的消长趋势与血清抗体的基本一致，但其抗体水平明显高于同期血清抗体水平，二者差异极显著(P＜0.01)。这可能是免疫抗原免疫母鸡，刺激产生的血清抗体中主要是IgG，也有少量IgM、IgA，间接ELISA检测方法主要能测到血清中的IgG，另一方面，血液流经卵巢时，由于卵黄膜表面有大量的IgG受体，使得IgG在卵细胞中蓄积，形成卵黄抗体IgY的浓集，从而导致卵黄抗体的间接ELISA检测效价明显高于血清效价。
四、卵黄抗体(IgY)的收集纯化与测定1、IgY抗体的收集与预处理参照相关文献以酸化水稀释-硫酸铵盐析法，收集纯化卵黄中的IgY抗体。卵黄的预处理取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液(约10mL/枚)与灭菌单蒸水按1∶9稀释，充分搅拌混匀，调PH值至5.1～5.4，置4℃，6h或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心(10,000rmin-1，4℃10min)，弃沉淀，获取上清液。
2、IgY抗体的提纯上述预处理上清，加入50％饱和度的饱和硫酸铵，搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心(10,000rmin-1，4℃10min)，弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33.3％饱和度的饱和硫酸铵，同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS液(0.01M，pH7.4)中，置常规处理过的透析袋中透析，流水透析过夜，次日以1000倍以上的PBS液(0.01M，pH7.4)搅拌透析，3小时左右换液一次，透析3天，获抗体蛋白，加1000U/mL的双抗，-20℃冷藏备用。
3、IgY抗体的纯度测定采用SDS-PAGE方法进行，参照文献分别配制8％分离胶、5％浓缩胶，装入电泳仪，浓缩胶电压80V，当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到140V，染料前沿到达距分离胶底部1cm时关闭电源，置固定液，考马氏亮兰R-250染色液中染色，室温4小时或过夜，转至脱色液中脱色，至凝胶背底透明，蛋白条带清晰，判读结果并拍照。
4、IgY抗体的蛋白质含量测定采用紫外分光光度计检测所提IgY抗体的蛋白含量，计算纯化蛋白的回收率。
5、结果以酸化水稀释-硫酸铵盐析法收集纯化卵黄中的IgY抗体。以SDS-PAGE分析纯化抗体所达到的纯度，未提纯时呈现11条以上清晰蛋白条带，纯化后的IgY抗体主要有2条蛋白条带，即60～67KD的重链，31～40KD的轻链。本次实验获得的IgY抗体经紫外分光光度计检测蛋白粗略含量为9.44mg/mL卵黄液，说明此方法具有很好的纯化回收效果。
四、卵黄抗体(IgY)的特异性测定1、免疫荧光法测定IgY的特异性免疫荧光反应程序1)将提纯后的贝氏隐孢子虫卵囊混悬液滴加于载玻片上的反应孔内，每孔7～10μl，以加满不溢出为好，风干。置甲醇中于4℃固定10min，取出风干，以PBS液(0.01M，pH7.4)浸泡清洗3次，每次3min，最后用蒸馏水浸泡脱盐，风干后作为荧光抗体染色标本，2)将提纯的阳性IgY和阴性IgY7～10μL分别滴于抗原标本孔内，置湿盒内于37℃作用60min。用PBS漂洗3次，每次5min，轻轻振荡，最后一次风干。
3)加上合适稀释度的FITC标记羊抗鸡IgY，置湿盒内于37℃作用60min。
4)用PBS漂洗3次，每次5min，轻轻振荡，最后用蒸馏水漂洗脱盐5min，风干，于荧光显微镜下观察、照相。
免疫荧光反应结果见图3，阳性IgY可识别C.baileyi卵囊，呈现弥漫性亮绿荧光反应，而阴性IgY不能识别C.baileyi卵囊，说明本次获得的IgY抗体具有抗C.bailey特异性。
2、间接ELISA法测定IgY的特异性将阳性鸡抗C.baileyi卵黄液作1∶100～1∶1600稀释，每个稀释度加入等量稀释度的C.baileyi可溶性抗原，37℃孵育阻断30min后，再进行ELISA测定，同时设相应对照，结果见图4，C.baileyi可溶性抗原与将阳性鸡抗C.baileyi卵黄液进行阻断试验时，各稀释度的阳性卵黄抗体效价明显降低，其OD值与阴性对照接近。
抗贝氏隐孢子虫特异性IgY抗体的人工感染试验动物治疗试验隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种全球性的人兽共患寄生虫病。引起畜禽腹泻和呼吸道症状，而且在人类，对免疫功能低下或缺陷者，尤其是婴幼儿和AIDS患者，引发致命性的腹泻，甚至危及生命。隐孢子虫病已被列为引起人类最常见的6种腹泻疾病之一。2003年，该病被列为我国须重点防范的两个重要寄生虫病之一。近年来，隐孢子虫病的研究成为一个新的热点。目前，国内外，已有120余种药物在实验室和临床试验中用于治疗隐孢子虫病的感染，迄今尚未有公认的特效药和治疗方法，筛选和研制越来越引起人们的重视。本研究将制备的抗贝氏隐孢子虫(C.baileyi)特异性IgY抗体，进行实验动物人工感染治疗试验。
一、材料与方法1、试验前预备1)Sheather蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌备用。
2)PBS缓冲液NaCL 8.0g，KCL g，KH2PO40.2g，NaHPO4·12H2O 2.9g，蒸馏水定容至1000mL，调PH值7.2～7.4后灭菌备用。
3)孔雀绿染色液孔雀绿染料1.6g，十二烷基磺酸钠1.0g，蒸馏水100mL溶解混匀。
4)抗贝氏隐孢子虫(C.baileyi)特异性IgY抗体制备，前述。
5)阴性对照IgY与特异性IgY的提取、纯化，前述。采用酸化水稀释粗提IgY，而后分别用50％和33％饱和度的饱和硫酸铵溶液盐析纯化，并用紫外分光光度计测所提IgY抗体的蛋白浓度。
6)IgY活性效价的测定采用间接ELISA法测定，前述。
7)隐孢子虫卵囊为本实验室保存传代的固始鸡源贝氏隐孢子虫卵囊。以Sheather蔗糖原液和PBS缓冲液配成1∶2蔗糖溶液粗提取，血细胞计数板计数，悬浮于PBS缓冲液中，加入双抗1000IU/mL，保存于4℃冰箱备用。
8)试验动物由市郊某孵化厂提供0日龄罗曼小公鸡120只，隔离饲养至3日龄，粪检寄生虫虫卵阴性后，选择健康活泼者用于试验。
二、试验方法1、试验分组分五个试验，五组试验雏鸡分笼饲养于无隐孢子虫环境中，各组之间保证无交叉污染，正常饲喂全价雏鸡饲料，0.2％双杀王自由饮水。
第一试验组感染对照组，经嗉囊感染C.baileyi卵囊3×106个·只-1，饲料饮水正常饲喂。
第二试验组阴性IgY治疗组，经嗉囊感染C.baileyi卵囊3×106个·只-1，感染后第11d，开始以阴性IgY抗体进行治疗，每日灌喂量2000μg/只，连续用10d，饲料饮水正常饲喂。
第三试验组阳性IgY大剂量治疗组，经嗉囊感染C.baileyi卵囊3×106个·只-1，感染后第11d，开始以阳性IgY抗体治疗，每日灌喂量2000μg/只，连续用10d，饲料饮水正常饲喂。
第四试验组阳性IgY中剂量治疗组，经嗉囊感染C.baileyi卵囊3×106个·只-1，感染后第11d，以IgY抗体治疗，每日灌喂量1000μg/只，连续用10d，饲料饮水正常饲喂。
第五试验组阳性IgY小剂量治疗组，经嗉囊感染C.baileyi卵囊3×106个·只-1，感染后第11d，以IgY抗体治疗，每日灌喂量500μg/只，连续用10d，饲料饮水正常饲喂。
2、观察指标1)各组鸡群排出卵囊的变化规律自人工感染后24h后，每间隔1d收集新鲜粪便，用饱和蔗糖水漂浮法收集卵囊和孔雀绿染色血细胞计数板检查计数，观察不同组的排卵规律，包括潜隐期、高峰期、持续期、卵囊强度，并计算每克粪便的卵囊个数(OPG)。
①饱和蔗糖水漂浮法收集卵囊收集称重各组粪便5g，加入50mL自来水浸泡，玻璃棒搅拌均匀，以80目滤筛除去大粪渣，滤液以3000r·min-1离心10min，弃去上清，在余下的沉淀中加饱和蔗糖溶液，搅匀，3000r·min-1离心5min，然后用铁丝环蘸取表层漂浮液6～8次，置于清水中，如此重复操作2次后，离心收集卵囊，以PBS缓冲液定容至5mL。
②孔雀绿染色血细胞计数板计数卵囊数用移液管分别吸取0.2mL卵囊悬液和0.8mL孔雀绿染液，置1mL导出管中充分混匀，放置5min后，注入血细胞计数器，在40×10光学显微镜下计数，按如下公式计算每克粪便中卵囊个数(OPG)＝[A/4×5×5×104]/M(A为卵囊总数，M为粪便重量)。
2、临床症状的观察试验过程中观察和记录各组临床症状(食欲、饮欲、粪便、精神状态及呼吸症状)，以下述标准观察判定(-)无临床异常。(+)精神一般，食欲欠佳，但无腹泻症状。(++)精神较差，食欲低下，有轻度腹泻症状。(+++)精神沉郁，无食欲，且有中度腹泻和呼吸道症状。(#)精神极度沉郁，食欲趋于废绝，并有重度的腹泻及呼吸困难。
3、对体重增重的影响感染前和试验结束时，对各试验组鸡只称重，计算各组的平均增重值，以衡量治疗过程中对体重增重的影响。
计算公式各组平均增重＝试验结束时平均体重-试验开始时均重。
三、结果与分析1、各组排卵囊规律观察结果试验期间，5个试验组潜隐期均为3d。感染对照组(第一组)与阴性IgY治疗组(第二组)排卵囊高峰期出现在感染后第11～17d，两组组在潜隐期、高峰期、持续期、排卵囊强度基本一致，无明显差(见图1)。阴性IgY治疗组与阳性IgY治疗的三个不同剂量组进行比较(见图2)，发现在3个治疗组在第11d的排卵囊高峰初期时，经嗉囊灌服阳性IgY抗体制剂后第2d，卵囊排出量显著持续下降，且随治疗剂量的增大而下降越快第三组鸡群OPG值下降67％(OPG；31×104个/g粪便)，9d后排卵囊转阴(OPG0)；第四组鸡群OPG值下降58％(OPG40×104个/g粪便)，13d后排卵囊转阴；第五组鸡群OPG值下降41％(OPG56×104个/g粪便)，15d后排卵囊转阴。
阳性IgY治疗的三个实验组与阴性治疗对照组相比(见图2)，OPG值下降了55～79％，卵囊转阴提前了5～11d。在不同治疗剂量上，大剂量治疗组(第三组2000μ/g只·日)与中剂量治疗组(第四组1000μg/只·日)比较，OPG值下降36％，粪排卵囊转阴提前了3d，与小剂量治疗组(第五组500μg/只日)比较，OPG值下降53％，粪排卵囊转阴提前了7d。分析结果表明，抗C.baileyi特异性阳性IgY在实验动物人工感染治疗试验中显示良好的疗效，能显著减少鸡群OPG值，且IgY抗体剂量的大小与治疗效果成正比。
2、临床症状的观察结果五个试验组在感染C.baileyi卵囊后的第7d(第一个OPG峰值)，各组部分鸡只出现轻度下痢症状，精神稍差；感染后第11d，第三、第四和第五组用不同剂量的抗C.baileyi特异性IgY抗体进行治疗，第二组以阴性IgY抗体作同步对照治疗，临床上观察各组开始出现呼吸道症状，个别鸡鸣叫沙哑，精神较差，食欲低下，有腹泻症状；第13d临床上观察第一、第二组开始出现显著的呼吸道症状，腹泻，个别鸡伸颈喘鸣、咳嗽啰音，精神、食欲不振，第三、第四和第五组仅见采食、饮水欠佳，轻度腹泻症状，第五组较第三、四组精神稍差；感染后第19d，第一、第二组呼吸道症状症状缓解，但精神不振，食欲欠佳，轻度腹泻症状，第三、第四和第五组无临床临床可见症状，饮水、采食正常(见表1)。
表1试验组临床症状观察

3、对体重增重的影响观察记录各组感染前后生长增重的情况。各组感染前后体重变化见表2。
表2各组鸡感染前后平均体重变化情况表


实验结果表明，雏鸡感染贝氏隐孢子虫影响生长增重。应用抗C.baileyi特异性IgY治疗隐孢子虫病能减少OPG值，缓解临床症状，提高饲料的转化率，分析原因可能是特异性的IgY可能存在阻止隐孢子虫子孢子钻入肠上皮细胞的某些机制，降低虫体寄生在肠道上皮细胞内的虫荷数，恢复肠上皮黏膜吸收养分功能，阳性IgY治疗组鸡只增重高于阴性治疗组。
近二十年来，对于隐孢子虫病防治，先后有抗球虫药、抗原虫药、抗蠕虫药、广谱抗生素和磺胺类药用于治疗隐孢子虫病，均不能有效控制隐孢子虫的感染。国内外研究者还应用一些生物制剂如高免初乳、高免血清、抗隐孢子虫特异性单克隆抗体(McAb)、牛转移因子、裂解肽及白介素等等进行免疫治疗取得一些疗效，但对其疗效众说不一。国内研究者运用一些中草药制剂(大蒜素制剂、苦参合剂等)治疗隐孢子虫病取得一定疗效，但因缺少严格的临床对照组，对其疗效不能确实。
本研究以抗隐孢子虫特异性的卵黄抗体进行隐孢子虫病治疗试验，在雏鸡感染贝氏隐孢子虫排卵囊的高峰初期进行口服治疗，阳性IgY治疗的三个实验组与阴性治疗对照组相比，OPG值下降了55～79％，排卵囊提前了5～11d转阴；临床症状上对照组开始出现显著的消化道和呼吸道症状(腹泻，个别鸡伸颈喘鸣、咳嗽啰音，精神、食欲不振等)，而三个治疗组基本无明显可见临床症状，饮水、采食正常；对体重增重的影响，雏鸡感染贝氏隐孢子虫影响生长增重，治疗组鸡群平均增重明显高于对照组，有文献报道(鲍嘉铭等，2001；陈兆国等，1995)用大蒜素治疗鸡感染隐孢子虫病，仅可使卵囊排放量轻度减少，但增重较差，临床症状缓解不明显，无明显的治疗效果，分析原因可能是大蒜素气味较重，影响鸡的采食。而卵黄抗体制剂进行治疗不存在这些问题，其不仅口感好，无不良气味刺激，在增强免疫力的同时，还有特异的针对疗效。
目前，对卵黄抗体的研究不断深入，IgY技术已成为生物技术领域和医药研究中的新热点，卵黄抗体(IgY)是禽类蛋黄中含有的一种免疫球蛋白，IgY抗体化学性质稳定，产量高、成本低，以及动物种系距离的优势，更适合用于生产特异性抗体，开发为治疗疾病的“绿色药物”，功能性食品，增强免疫功能的保健品。


图1、第二组血清抗体与卵黄抗体消长规律；图2、图中M低分子量标准蛋白质A提纯后鸡IgYB鸡的IgGC未提纯的IgY(8％分离胶5％浓缩胶)IgY抗体的纯化效果图3、间接免疫荧光反应对IgY抗体特异性测定(10×40)阴性IgY抗体；图4、间接免疫荧光反应对IgY抗体特异性测定(10×40)阳性IgY抗体；图5、IgY的阻断试验ELISA测定OD值曲线图；图6、感染对照组与阴性IgY治疗组比较；
图7、阴性IgY治疗组与阳性IgY治疗组比较。
权利要求
1.一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，该产品可以从以下步骤所获得，首先从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊进行分离后用蔗糖梯度离心法纯化卵囊，并制备成贝氏隐孢子虫抗原，用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊是指收集阳性畜粪便中卵囊，卵囊呈长卵圆形，测得卵囊大小为6.5μm ×4.7μm形状指数1.31，经3日龄鹌鹑盲传清除混有的鸡球虫卵囊。
3.根据权利要求2所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于进行分离是指用饱和蔗糖溶液漂浮法收集卵囊，27％(W/V)的蔗糖溶液粗提卵囊，以3日龄雏鸡传代扩增，经本实验室建立动物感染模型及18sRNA序列比对分析，确定为贝氏隐孢子虫。
4.根据权利要求1、3所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于用蔗糖梯度离心法纯化卵囊是指，①配制蔗糖原液蔗糖500g，蒸馏水320mL溶解后，高压灭菌；②配制PBS缓冲液NaCL 8.0g，KCL0.2g，KH2PO40.2g，NaHPO4·12H2O 2.9g，蒸馏水1000mL，调PH值7.4后灭菌；③将①蔗糖原液与②PBS缓冲液配制为a、1份蔗糖原液加入1份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为30.4称为1∶1蔗糖水；b、1份蔗糖原液加入2份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为25称为1∶2蔗糖水；c、1份蔗糖原液加入3份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为18.7称为1∶3蔗糖水；d、2份蔗糖原液加入7份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为16.8称为1∶3.5蔗糖水；e、1份蔗糖原液加入5份PBS缓冲液后蔗糖浓度(W/W％)为12.5称为1∶5蔗糖水；④卵囊用10 mL直径1.2cm的玻璃离心管提纯，程序如下a、先加入1∶1蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；b、加入1∶2蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份a步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中；c、加入1∶3蔗糖水2份，再沿玻璃管壁缓慢加1份b步骤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin1，10min，以吸管吸出卵囊层悬浮液，加入2倍体积PBS缓冲液离心洗涤2次，沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中，再重复一次；d、加入1∶3.5蔗糖水1份，沿管壁加于离心管中，然后沿管壁缓缓加入1∶5蔗糖液1份，最上层加入1∶3蔗糖提取物卵囊悬液1份，再沿玻璃管壁缓慢加1份c步骤重复洗涤沉淀悬浮于适量PBS缓冲液中的卵囊悬浮液，3000rmin-1，10min，回收卵囊层悬浮液；⑤用PBS缓冲液稀释后以5μm滤膜微滤除菌，浓缩后加入终浓度为1000U/mL的双抗，4℃保存。
5.根据权利要求4所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于制备成贝氏隐孢子虫抗原是指将纯化除菌后的贝氏隐孢子虫卵囊悬浮于PBS缓冲液中(108/mL)，冰浴超声波(80HZ)2min×5次破碎卵囊，再反复冻融5次(液氮与水浴37℃)，4℃，10,000rmin-1离心卵囊处理液15min，上清作为检测用抗原，紫外分光光度法测蛋白浓度，-20℃保存备用；沉淀部分加入适量PBS缓冲液，以2倍体积的福氏完全或非完全佐剂乳化，作为免疫用抗原，乳化好的疫苗4℃保存。
6.根据权利要求5所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽是指鸡群的免疫， 共免六次，每次间隔15～20d，抗原与2倍体积的佐剂混匀制成油乳剂，除一免用弗氏完全佐剂外，其余均用弗氏不完全佐剂，每次2mL.只-1，抗原含量分别为一免1×107个.只-1，二免2×107个.只-1，三免3×107个.只-1，四免3×107个.只-1，五免5×107个.只-1，六免5×107个.只-1，免疫注射方式为鸡翅下及大腿内侧肌肉多点肌肉注射。
7.根据权利要求6所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液是指取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液(约10mL/枚)与灭菌单蒸水(D.W)按1∶9稀释，充分搅拌混匀，调PH值至5.1～5.4，置4℃，6h或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心(10,000rmin-1，4℃10min)，弃沉淀，获取上清液；
8.根据权利要求7所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，其特征在于经水稀释硫酸铵盐析法纯化是指水稀释二步硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入50％饱和度的饱和硫酸铵，搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心(10,000rmin-1，4℃10min)，弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33.3％饱和度的饱和硫酸铵，同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS液(0.01M，pH7.4)中，置常规处理过的透析袋中透析，流水透析过夜，次日以1000倍以上的PBS液(0.01M，pH7.4)搅拌透析，3小时左右换液一次，透析3天，获抗体蛋白，加1000U/mL的双抗，-20℃冷藏。
9.根据权利要求8所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品的用途，其特征在于用于防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的生物制剂。
10.根据权利要求8所述的防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品的用途，其特征在于作为增强免疫功能的保健品。
全文摘要
本发明的目的是提供一种防治贝氏隐孢子虫引起的原发病的卵黄免疫球蛋白生物制剂和增强免疫功能的卵黄免疫球蛋白保健品。本发明的目的是通过如下技术方案来实现一种防治贝氏隐孢子虫病的卵黄免疫球蛋白产品，该产品可以从以下步骤所获得，首先从贝氏隐孢子虫阳性粪便中收集卵囊进行分离后用蔗糖梯度离心法纯化卵囊，并制备成贝氏隐孢子虫抗原，用贝氏隐孢子虫抗原免疫母产卵禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，离心取上清液，经水稀释硫酸铵盐析法纯化得到卵黄免疫球蛋白。应用本技术方案制备出的抗贝氏隐孢子虫病的特异性IgY直接作用于贝氏隐孢子虫病症的病原体，发挥特异性抑制作用。
文档编号A61P33/02GK101081299SQ200610017840
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者张龙现, 邵兆霞, 宁长申, 菅复春, 赵金凤, 刘红英, 马超峰 申请人:河南农业大学