用于检测家蚕蚕卵微孢子虫的lamp引物及快速检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及生物技术领域，更具体地，设及一种家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP检测引 物及其应用和家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 家蚕微粒子病是病原性的家蚕微抱子虫(Nosema bombycis，N.b)经食下传染或胚 卵（胎)传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病，也是目前影响我国蚕丝业持续稳定发展 的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的经济损失十分惨重。同时，野外昆虫微抱子 虫可交叉感染家蚕，并能在蚕体间W及不同蚕期间传播，导致大批蚕种报废，严重制约蚕种 贸易和蚕业可持续发展。各地区蚕业主管部口和相关生产单位投入大量人力、物力和财力， 采取传统显微镜镜检母蛾，淘汰带毒母蛾产下的蚕种的常规方法进行防治家蚕微粒子病， 但效果不佳。我国将家蚕微粒子病列为进出口动物检疫二类疫病的检疫名录。
[0003] 最初人们判别家蚕是否感染家蚕微粒子病主要根据显微镜下组织研磨液中的微 抱子虫的形态和大小进行的，运种方法也有效地遏制了世界各地蚕区微粒子病的流行，捶 救了世界的养蚕业。而对于家蚕蚕卵微抱子虫的检测主要是通过将产卵24h后的蚕卵浸酸 处理，待蚕卵解化收蚁后进行显微镜检测，运种方法不仅耗费了大量时间，而且显微镜镜检 的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，且很难将其他抱子类似物与家蚕微抱子虫抱 子区别开来。随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微抱子虫并且达到了 较高的灵敏度。目前用于家蚕微粒子病PCR检测的引物多是针对祀基因 SS化RNA的(Ter巧R S,Smith JE,Bouchon D,et al.Ultrastructural characterization and molecular taxonomy of Nosema granulosis sp.n.,a transovarially transmitted,feminizing (TTF)microsporidium.J.Eukaryot.Microbiol.1999,(46):492-499;Huang Wei-Fone, Tsai Shu-Jen,Lo Chu-Fang,et al.The novel organization and complete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis.Fungal Genetics and Biology, 2004.4U5) :473-481)但是刘吉平等(2004K刘吉平，曹阳，Smith J.E.等.模拟感染家蚕微 粒子病的PCR分子诊断技术研究.中国农业科学，2004,37( 12): 1925-1931)研究发现，基 于ieSrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微抱子虫，经常会有非目的条带及假阳性结果出 现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原微抱子虫基因组DNA有效扩增。
[0004] 本申请人根据长期的研究实验结果，针对家蚕微抱子虫转录组测序的结果，经测 序验证发现了家蚕微抱子虫S邱tin2基因（登录号:KJ451481.1)，发现WS邱tin2基因为祀 序列设计的PCR引物检测微抱子虫并无非特异性条带及假阳性结果。但是，使用该基因设计 的PCR引物对于家蚕微抱子虫检测方法操作步骤较多，且花费时间较长。况且，微抱子虫寄 生于蚕卵中，且蚕卵含量明显高于要检测的微抱子虫，在提取获得的DNA样品中，两者DNA同 时存在，家蚕蚕卵DNA对检测造成严重的干扰，因此，要想直接W蚕卵DNA为模板进行微抱子 虫的LAMP检测，对检测提出了更高的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是针对现有技术中检测蚕卵中是否感染家蚕微抱子虫 所存在的操作步骤多、花费时间长、干扰大等缺陷，设计出一组适用于家蚕蚕卵微抱子虫的 LAMP检测的检测引物，基于所述引物，可成功建立家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP检测方法。
[0006] 本发明要解决的另一技术问题是提供一种家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP快速检测方 法。
[0007] 本发明的目的通过W下技术方案予W实现：
[000引提供一组用于检测家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP引物，所述引物为Septin2-F3、 S邱tin2-B3、S巧tin2-FIP(Flc+F2)和S邱tin2-BIP(Blc+B2)，其序列分别如沈Q ID N0:1 ~ 4所示。
[0009] SEQ ID NO: 1:
[0010] Septin2-F3：5'-CCAATTTCACACCTCCGTT-3'
[0011] 沈Q ID NO:2
[0012] Septin2-B3:5'-ACACAAGCTCTAAATCGGTC-3 '
[0013] SEQ ID NO:3:
[0014] Septin2-FIP(Flc+F2)：
[0015] 5，-GTAAGTTTAATTGGCCCCAGGGATATTGTAACATCACCAAAAATAACCG-3,
[0016] SEQ ID N0：4：
[0017] Septin2-BIP(Blc+B2)：
[001 引 5'-GTTTAGGCTAAGGGAAATGCTTGTATAATATTCTTCTGTGGTTTCGA-3'
[0019] 在本发明方法的关键技术之一是引物的设计，基于引物的科学设计，才能成功实 现操作步骤少、花费时间短、干扰小、特异性强的LAMP检测，本申请人根据Septin2基因设计 了若干组引物，经过复杂和困难的筛选工作，并对运些引物的有效性、特异性、反应时间等 反复进行了分析、总结和模拟实验，综合考虑检测方法的各种影响因素，才确定所述适用于 家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP检测的检测引物。
[0020] 本发明同时提供一种家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP检测方法，包括W下步骤：
[0021] SI.提取待测样品模板DNA;
[0022] S2.基于所述检测引物，配置反应体系；
[0023] S3.在步骤S2所配置的反应体系使用的反应管中加入20化密封液;采用染色法判 定结果在管盖内侧加入化L显色液；
[0024] S4.反应:将反应管置于恒溫水浴箱或其他恒溫设备中，63 °C恒溫放置60min;然后 95°C，放置2min灭活；
[00巧]S5.结果判定：
[0026] 采用染色法进行结果判定:将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物 混合;在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕 蚕卵微抱子虫;反应产物变为澄色，则不含有家蚕蚕卵微抱子虫；
[0027] 或者采用琼脂糖凝胶电泳法进行结果判定：取化L反应后的产物，与IiiL 6 X loading buffer和化Ld地2〇混合，于2%琼脂糖凝胶电泳；若出现大小不等的众多梯形条 带，说明待测样品含有家蚕蚕卵微抱子虫;若无大小不等的众多梯形条带，说明待测样品不 含有家蚕蚕卵微抱子虫；
[0028] 或者采用实时巧光法进行结果判定:若有"S"型扩增曲线且扩增值超过设定的阔 值为阳性，若扩增曲线的扩增值未超过设定的阔值则为阴性。
[0029] 其中，S2所述的反应体系是采用优化后的25化反应体系，分别如下：
[0030] (1)采用染色法进行结果判定的25iiL反应体系为：
[0031] 在PCR管中配置，采用优化后的25iiL反应体系，如下表所述：
[0032]
[00：
[0034] 建议:对于N个样品，应配制(N+3)倍体积的反应液(包括阴性对照、阳性对照各一 个，W及分装耗费误差），保证各反应管分装均匀。
[0035] (2)实时巧光法判定结果
[0036] 在PCR管中配置，采用优化后的25iiL反应体系，如下表所述：
[0037]
[0038] (3)琼脂糖凝胶电泳法判定结果
[0039] 在PCR管中配置，采用优化后的25iiL反应体系，如下表所述：
[0040]
[004U 所述2 X Reaction Mix为反应缓冲液，组成为20mMTris-HCl，pH8.8 ; IOmMKCl; 2mMMgS04; 20mM(NH4)2S04; 0.1 % Tri ton X-IOO; 2. SmMdNTPs; IM甜菜碱；25mMMgCl2;
[0042] 所述 Septin2-F3/B3 为 5pmol/化；所述 Septin2-FIP/BIP 为 20 ~40pmol/化；所述 Bst DNA polymerase为8U/]iL。
[0043] 阳性对照品为S邱t in2DNA-pMD重组质粒。
[0044] 所述显色液为10000 X SYBR Green I;所述巧光指示剂为IX SYBR Green I。
[0045] 步骤SI用Qiagen公司出品的试剂盒DNeasy Plant Mini