Kit说明，W下其他试剂 同提取待测样品模板DNA的方法具体包括W下步骤：
[0046] SOI.取微抱子虫样品200iil，12000rpm下离屯、5min，弃上清；然后加50~IOOiU dd出0重悬；
[0047] S02.吸取重悬的抱子液至预冷的研鉢中，液氮充分研磨;优选研磨3次W上；
[004引 S03.将研磨后抱子放入1.5ml离屯、管中，加入40化1 APl和钮1 Rnase,满旋混匀 (400iil APl和化1化ase勿在使用前混合）；
[0049] S04.混匀后的溶液，65°C，解育IOmin(期间上下颠倒试管2~3次）；
[0050] S05.加130iU AP2,混合后冰浴5min;然后14000巧m下离屯、5min;
[0化1] S06.吸取上清于QIAs虹edder spin column中的收集管，14000巧m下离屯、2min;
[0052] S07.将离屯、管中上清液移至新管（勿揽动出现的残渣），加入1.5倍体积的AP3/E， 移液器混合；
[0化3] S08.将65化1混合液移至Dneasy Mini spin column中，4200巧m下离屯、Imin;剩下 的液体重复此步骤；
[0化4] S09.将spin colum放入新收集管中。加入500ul buffer AW，4200rpm下离屯、Imin; 弃上清；
[0化日]SOlO.再加入50化1 AW，1400化pm下离屯、2min(保证收集管不接触到底部上清）； [0化6] soil.移收集管至1.5ml或2ml离屯、管中；
[0057] S012.加入40iU buffer AE洗脱，室溫放置5min;4200巧
[005引 SOl3.重复上一步（即加入40u化Uffer AE洗脱，室溫放置5min，4200巧m，Imin);
[0化9] SO14.-20 °C冰箱保存备用。
[0060]本发明的有益效果是：
[0061 ] 本发明扩展了家蚕微抱子虫S邱tin2基因（Accession numbe;r:KF421133.1)序列 的新的应用。本发明通过BLAST软件进行同源性分析，发现并无相似性序列，即家蚕微抱子 虫的S邱tin2基因有高度特异性，因此W该基因为祀基因设计Septin2F/R引物;使用该PCR 引物验证祀基因的特异性，结果表明该引物具有特异性；W该引物为参考，Septin2基因为 祀基因设计多组LAMP引物，经过复杂和困难的筛选工作，并对运些引物的有效性、特异性、 反应时间等反复进行了分析、总结和模拟实验，综合考虑检测方法的各种影响因素，才确定 所述适用于家蚕蚕卵微抱子虫的LAMP检测的检测引物。在只有四条特异性引物完全识别祀 基因的6个区域的情况下，才能进行扩增，从而保证了其对家蚕微抱子虫Septin2基因扩增 的特异性和检测的全面性。
[0062] 基于引物的特异性，本发明本进一步对反应体系进行优化，提供了一种家蚕蚕卵 微抱子虫的LAMP快速检测方法，能够检测浓度为1.2Xl(T 4ng/iil的微抱子虫DNA，检测的灵 敏性与PCR相当，但操作步骤大大简化，整个反应可在40~90min内完成，大大缩短了检测时 间，而且不需要价格昂贵的扩增仪器。
[0063] 更进一步的是，本发明基于同一组检测引物的检测方法的结果判断可W有多重选 择，且结果均易于观察判定。可在反应产物中加入显色液，通过直观的显色反应就可W肉眼 鉴别检测;可通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带可W更加直观的观察反应结果，具有强有 力的说服力，对于假阳性检测结果也可W轻易地排除掉;可通过实时巧光检测，可W通过扩 增曲线直观的判断结果，且对于浓度高的样品结果的判定可W提前结束，减少了不必要的 时间浪费。
[0064] 综上所述，本发明所述的家蚕病原微抱子虫的LAMP快速检测方法，操作简单、不需 要复杂的仪器及复杂的扩增程序、杂质对扩增的干扰较小且反应结果易于判定，特异性强， 为应用LAMP技术进行家蚕蚕卵微抱子虫的检测和保证蚕种的质量提供重要基础和技术储 备，能较好地满足科研院校、蚕种生产单位及蚕种质检中屯、的检毒需要，易于大范围推广应 用。
【附图说明】
[0065] 图1 PCR引物及LAMP引物组在S邱tin2基因上的位置示意图。
[0066] 图2四条LAMP引物及PCR引物设计的祀基因序列和位置示意图。
[0067] 图3两条PCR引物检测健康蚕卵和添毒蚕卵的电泳图。
[0068] 其中，M:DL2000DNA Marker;l:添毒家蚕蚕卵DNA;2:家蚕微抱子虫DNA;3:正常家 蚕蚕卵DNA;4:d地2〇。
[0069] 图4家蚕蚕卵微抱子虫LAMP快速检测法检测不同浓度阳性对照品结果(重组质粒 Septin2DNA-pMD)(琼脂糖凝胶电泳法检测）。
[0070] 其中，M:DL2000DNA Marker; 1-7 分别为稀释 l〇6-l〇〇copies/iU 的重组质粒 Septin2DNA-pMD;8:d地20。
[0071 ]图5家蚕蚕卵微抱子虫LAMP快速检测法检测不同浓度阳性对照品结果(重组质粒 Septin2DNA-pMD)结果（显色法检测）。
[0072]其中，M:DL2000DNA Marker; 1-7 分别为稀释 l〇6-l〇〇copies/iU 的重组质粒 Septin2DNA-pMD;8:d地20。
[0073] 图6家蚕蚕卵微抱子虫LAMP快速检测法检测不同浓度阳性对照品结果(重组质粒 Septin2DNA-pMD)结果(实时巧光法检测）。
[0074] 其中，M:DL2000DNA Marker; 1-7 分别为稀释 l〇6-l〇〇copies/iU 的重组质粒 Septin2DNA-pMD;8:d地20。
[0075] 图7家蚕蚕卵微抱子虫LAMP快速检测法检测不同浓度家蚕微抱子虫DNA的灵敏性 结果(琼脂糖凝胶电泳法检测）。
[0076] 其中，M: DL2000DNA Marker; 1-7分别为：：1.2 X lOVg/iil、1.2 X lO-ingAU、1.2 X l〇-2ng/山、1.2 X l〇-3ng/山、1.2 X l〇-4ngAU、1.2 X l〇-5ng/山、1.2 X l〇-6ng/山；8: (1地2〇。
[0077] 图8家蚕蚕卵微抱子虫LAMP快速检测法检测不同浓度家蚕微抱子虫DNA的灵敏性 结果(显色法检测）。
[007引 其中，M: DL2000DNA Marker; 1-7分别为：：1.2 X lOVg/iil、1.2 X lO-ingAU、1.2 X l0-2ng/山、1.2 X l0-3ng/山、1.2 X l0-4ngAU、1.2 X l0-5ng/山、1.2 X l0-6ng/山；8: (1地20。
[0079] 图9家蚕蚕卵微抱子虫LAMP快速检测法检测不同浓度家蚕微抱子虫DNA的灵敏性 结果(实时巧光法检测）。
[0080] 其中，M: DL2000DNA Marker; 1-7分别为：：1.2 X lOVg/iil、1.2 X IQ-IngAU、1.2 X l〇-2ng/山、1.2 X l〇-3ng/山、1.2 X l〇-4ngAU、1.2 X l〇-5ng/山、1.2 X l〇-6ng/山；8: (1地2〇。
[0081] 图10家蚕蚕卵微抱子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同的生产上蚕卵的检 测结果(琼脂糖凝胶电泳法检测）。
[0082] 其中，M:DL2000DNA Marker;l、2、6、7、8、9、ll、13号管分别为带毒蚕卵，其余为无 毒蚕卵，14号为阳性对照，15号为水对照。
[0083] 图11家蚕蚕卵微抱子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同的生产上蚕卵的检 测结果(显色法检测）。
[0084] 其中，M:DL2000DNA Marker;l、2、6、7、8、9、ll、13号管分别为带毒蚕卵，其余为无 毒蚕卵，14号为阳性对照，15号为水对照。
[0085] 图12家蚕蚕卵微抱子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同的生产上蚕卵的检 测结果(实时巧光法检测）。
[00化]其中，M:DL2000DNA Marker;l、2、6、7、8、9、ll、13号管分别为带毒蚕卵，其余为无 毒蚕卵，14号为阳性对照，15号为水对照。
[0087] 图13用MEGA5.1软件构建家蚕微抱子虫Septins系统进化N-J树。
【具体实施方式】
[0088] 下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述附图和实施例仅用于示例性 说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或 商业途径获得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用 的方法和设备。
[0089] 实施例1引物的设计和筛选
[0090] 本发明W通过转录组测序方法并通过克隆测序方法验