专利名称：抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白及其制备工艺和医用用途的制作方法
技术领域：
本发明公开一种抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白及其制备工艺和医用用途，涉及预防和治疗隐孢子虫病的药物制备技术领域。
背景技术：
隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种重要的人兽共患寄生虫病，该病具有以下特点该虫宿主范围极为广泛、感染率高、危害严重，隐孢子虫病可引起人和牛的严重腹泻，是艾滋病人的主要致死因素之一。犊牛隐孢子虫病死亡率高达53.5％，奶牛感染隐孢子虫后产奶量可降低3.2kg/d，耐过动物可成为带虫者和传染源，而且隐孢子虫可造成T细胞数量的急剧减少使机体免疫力降低。90％以上的隐孢子虫病人有腹泻症状，多呈水样便，并伴有腹痛、腹胀、呕吐、乏力和发热等。免疫功能缺陷者感染隐孢子虫后可引起严重的腹泻并危及生命。因此本病是今后医学和兽医界防治的重要寄生虫病。
迄今已有200余种药物包括所有抗生素、抗球虫药及磺胺类药等，被试用于治疗人和动物隐孢子虫病，但尚无一种药物对隐孢子虫有真正杀灭作用。长期以来人们期望的一种仅杀伤有害细胞而不损伤正常细胞的导向药物在肿瘤的治疗中发挥了重要作用。同时也显示出它在解决迄今缺乏有效治疗药物的感染性疾病方面的具大潜力，已成为一个活跃的研究领域。
发明内容
本发明提供一种抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白及其制备工艺，可适用于工业化生产。
本发明还提供了抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白在预防和治疗人和动物隐孢子虫病的医用用途。
抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白的基因序列为两个，其中，第一个基因序列为CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCA CCC TCA 45Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser1 5 10 15CAG AGC CTG TCC ATC ACA TGC ACT GTC TCT GGG TTC TCA TTA TCC 90Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser16 20 25 30AGA TAT AGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG 135Arg Tyr Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu31 35 40 45GAG TGG CTG GGA ATG ATA TGG GGT GGT GGA AGC ACA GAC TAT AAT 180Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn46 50 55 60TCA GCT CTC AAA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAC TCC AAG 225Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys61 65 70 75AGC CAA GTT TTC TTA AAA ATG AAC AGT CTG CAA ACT GAT GAC ACA 270Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr76 80 85 90GCC ATG TAC TAC TGT GCC AGA AAC CGG TAT GGT AAT GCT ATG GAC 315Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Gly Asn Ala Met Asp91 95 100 105TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC 360Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly106 110 115 120GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG 405Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu121 125 130 135CTC ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GTA TCT GTG GGA GAA ACT 450Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr136 140 145 150GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA 495Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu151 155 160 165GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC 540Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val166 170 175 180
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ATG CCA GCC CAA TCG AAT ATG AAT TC第二个基因序列为CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA GGC TTA GTG AAG CCT GGA 45Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT 90Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Phe Thr Phe Ser16 20 25 30AGC TAT GCC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCG GAG AAG AGG CTG 135Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu31 35 40 45GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT GGT GGT GGT AGT TAC ACC TAC TAT 180Glu Trp Val Ala Thr Leu Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr46 50 55 60CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC 225Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala61 65 70 75AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC 270Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp76 80 85 90ACG GCC ATG TAT TAC TGT GCA AGA CGG GAG GGC TGG TTT GCT TAC 305Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Gly Trp Phe Ala Tyr91 95 100 105TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT 350Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly106 110 115 120TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG TAC ATC GAG CTC 395Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ile Glu Leu121 125 130 135ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GCA TCT GTG GGA GAA ACT GTC 450Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val136 140 145 150ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT ATT CAC AAT TAT TTA GCA 495Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala151 155 160 165TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC TAT 540Trp Tyr Gln Gln Lys Gly Gln Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr166 170 175 180AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC 585Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly181 185 190 195AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAT TCT CTC AAG ATC AAC AGC CTG CAG 630
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本发明抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白制备工艺包括以下步骤利用单克隆抗体技术和基因重组技术，从分泌抗微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)子孢子表膜抗体的杂交瘤细胞株中克隆其可变区基因，再连接成单链抗体基因，然后将其插入原核表达载体的相应位点上，构建了重组原核表达质粒，再分别采用酶切和PCR方法将去除受体结合区的细菌外毒素插入重组原核质粒中单链抗体基因的下游位点，即利用单链抗体基因代替细菌外毒素的受体结合区，构建重组表达质粒。将上述构建的重组表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表达产物，后对表达产物包涵体进行纯化和复性，并对其进行体外抗虫活性测定和模型动物隐孢子虫病治疗。
通过以下试验例证明抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白对于对隐孢子虫疾病的预防和治疗作用实验例1.
60只小鼠每只经口接种1×106个隐孢子虫后，随机将其分为六组，一组至五组为治疗组，六组为对照组。治疗组每日经肛门分别灌入小肠不同剂量(0.5，1，1.5，2，2.5g)的重组毒素，连续3天，对照组以生理盐水代替重组毒素。7天后，取1克粪便计算每克粪便中的卵囊数。结果显示，治疗组卵囊数明显少于对照组(p＜0.05)。其中治疗的最佳剂量为1g/只鼠。
实施例2.
60只小鼠每只经口接种1×106个隐孢子虫后，随机分为六组，一组至五组为治疗组，六组为对照组。治疗组每日经肛门分别灌入小肠不同剂量(0.5，1，1.5，2，2.5g)的重组毒素，连续3天，对照组以生理盐水代替重组毒素。7天后，取1克粪便计算每克粪便中的卵囊数。结果显示，治疗组卵囊数明显少于对照组(p＜0.05)。治疗的最佳剂量为1.5g/只鼠。
本发明的积极效果在于蛋白基因易于修饰和改造、稳定性好、渗透性好、制备简单、特异性强、杀灭作用强，对隐孢子虫疾病具有很高的预防和治疗作用。
图1为重组质粒的构建策略图。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1从人工感染隐孢子虫的犊牛粪便中用蔗糖密度梯度离心法分离纯化微小隐孢子虫卵囊(CSO)，经超声粉碎(100W×5min)后免疫BALB/C小鼠，应用杂交瘤技术，制备出1株能稳定分泌抗隐孢子虫McAb的杂交瘤细胞株3D6，并通过免疫荧光法对其进行了鉴定，其在子孢子表面呈弥慢性荧光反应，提示其针对子孢子表膜。从分泌抗隐孢子虫子孢子单克隆抗体的杂交瘤细胞3D6中，提取其mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR扩增(反应条件94℃1min，55℃2min，72℃2min，30个循环)获得抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体的轻、重链可变区基因VL和VH。在这两个基因中加入连接肽基因后，经进一步PCR扩增、组装合成出单链抗体(ScFv)基因，将该基因克隆入pMD-18T载体后，进行了序列测定。测序结果表明，获得的单克隆抗体轻、重链可变区基因VL和VH符合小鼠抗体可变区基因特征，为功能性重排的鼠抗体可变区基因序列，分离得到的单链抗体基因ScFv由重链可变区基因VH-连接肽基因-轻链可变区VL基因构成，这种构成模式较VL-Linker-VH基因结构具有更强的抗体亲和活性。ScFv基因全长为720bp，其中VH基因为351bp，编码117个氨基酸，VL基因全长为324bp，编码108个氨基酸。
将获得的ScFv基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE的受体结合区，利用原核表达载体pET28，构建了用于表达重组毒素的原核表达质粒3D6pET28-ScFv-PE(单链重组免疫毒素基因序列附后)。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白。重组毒素3D6ScFv-PE40的表达量占菌体蛋白总量的14％，表达产物以包涵体和上清两种形式存在。将低温诱导获得的3D6ScFv-PE可溶性表达产物，加入含有脱囊后的子孢子的1640培养液中，观察18h内活动的子孢子数目和活动性的变化，结果与对照组相比，加入重组毒素组活动的子孢子数目明显减少(P＜0.05)，活动性明显降低，提示重组毒素对隐孢子虫子孢子具有较强的杀灭作用，其治疗隐孢子虫病模型动物的剂量为1μg/只鼠。
实施例2从人工感染隐孢子虫的犊牛粪便中用蔗糖密度梯度离心法分离纯化微小隐孢子虫卵囊(CSO)，经超声粉碎(110W×6min)后免疫BALB/C小鼠，应用杂交瘤技术，制备出1株能稳定分泌抗隐孢子虫McAb的杂交瘤细胞株4G4，并通过免疫荧光法对其进行了鉴定发发现针对子孢子表膜。从分泌抗隐孢子虫子孢子单克隆抗体的杂交瘤细胞4G4中，提取mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR扩增(反应条件95℃1min，56℃2min，72℃2min，30个循环)，获得抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体的轻、重链可变区基因VL和VH。在这两个基因中加入连接肽基因后，经进一步PCR扩增、组装合成出单链抗体(ScFv)基因，将该基因克隆入pMD-18T载体后，进行了序列测定。测序结果表明，获得的单克隆抗体轻、重链可变区基因VL和VH符合小鼠抗体可变区基因特征，为功能性重排的鼠抗体可变区基因序列，分离得到的单链抗体基因ScFv由重链可变区基因VH-连接肽基因-轻链可变区VL基因构成。4G4 ScFv基因全长为717bp，其中VH基因为348bp，编码116个氨基酸，VL基因全长为324bp，编码108个氨基酸。
将获得的ScFv基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE的受体结合区，利用原核表达载体pET28，构建了用于表达重组毒素的原核表达质粒4G4pET28-ScFv-PE(单链重组免疫毒素基因序列附后)。将上述质粒转化受体菌BL21后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白。重组毒素4G4ScFv-PE40的表达量占菌体蛋白总量的12％，表达产物以包涵体和上清两种形式存在。将低温诱导获得的4G4ScFv-PE可溶性表达产物，加入含有脱囊后的子孢子的1640培养液中，观察20h内活动的子孢子数目和活动性的变化，结果与对照组相比，加入重组毒素组活动的子孢子数目明显减少(P＜0.05)，活动性明显降低，提示重组毒素对隐孢子虫子孢子具有较强的杀灭作用，其治疗隐孢子虫病模型动物的剂量为1.5μg/只鼠。
权利要求
1.抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白的基因序列如下CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTG GTG GCA CCC TCA 45Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser1 5 10 15CAG AGC CTG TCC ATC ACA TGC ACT GTC TCT GGG TTC TCA TTA TCC 90Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser16 20 25 30AGA TAT AGT GTA CAC TGG GTT CGC CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG 135Arg Tyr Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu31 35 40 45GAG TGG CTG GGA ATG ATA TGG GGT GGT GGA AGC ACA GAC TAT AAT 180Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn46 50 55 60TCA GCT CTC AAA TCC AGA CTG AGC ATC AGC AAG GAC AAC TCC AAG 225Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys61 65 70 75AGC CAA GTT TTC TTA AAA ATG AAC AGT CTG CAA ACT GAT GAC ACA 270Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr76 80 85 90GCC ATG TAC TAC TGT GCC AGA AAC CGG TAT GGT AAT GCT ATG GAC 315Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Tyr Gly Asn Ala Met Asp91 95 100 105TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC 360Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly106 110 115 120GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG 405Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu121 125 130 135CTC ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GTA TCT GTG GGA GAA ACT 450Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr136 140 145 150GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GAG AAT ATT TAC AGT AAT TTA 495Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn Leu151 155 160 165GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC 540Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val166 170 175 180TAT GCT GCA ACA AAC TTA GCA GAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT 585Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser181 185 190 195GGC AGT GGA TCA GGC ACA CAG TAT TCC CTC AAG ATC AAC AGC CTG 630Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu196 200 205 210CAG TCT GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT CAA CAT TTT TGG GGT 675Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly211 215 220225ACT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG AGC AAG CTG GAG CTG AAA CGG 720Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Leu Lys Arg226 230 235 240CAT ATG GCC GAA GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG CAC 765His Met Ala Glu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His241 245 250 255CAG GCT TGC CAC CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CAG 810Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln256 260 265 270CCG CGC GGC TGG GAA CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG 855Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Thr Pro Val Gln271 275 280 285CGG CTG GTC GCC CTC TAC CTG GCG GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG 900Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln286 290 295 300GTC GAC CAG GTG ATC CGC AAC GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC GGC 945Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly301 305 310 315GGC GAC CTG GGC GAA GCG ATC CGC GAG CAG CCG GAG CAG GCC CTG 990Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Leu316 320 325 330GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG AGC GAG CGC TTC GTC CGG CAG 1035Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln331 335 340 345GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC GCG GCC AAC GCC GAC GTG GTG 1080Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val346 350 355 360AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA TGC GCG GGC CCG GCG 1125Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala361 365 370 375GAC AGC GGC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC TAT CCC ACT GGC GCG 1170Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala376 380 385 390GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC ACC CGC GGC 1215Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly391 395 400 405ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC CGC CAA 1260Thr Glu Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln406 410 415 420CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC ACC TTC 1305Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe42l 425 430 435CTC GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG CGC 1350Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg436 440 445 450AGC CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC 1395Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly451 455 460 465GAT CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC 1440Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp466 470 475 480GCA CGC GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG 1485Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val481 485 490 495CCG CGC TCG AGC CTG CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG 1530Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu496 500 505 510GCC GCG CCG GAG GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT 1575Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His511 515 520 525CCG CTG CCG CTG CGC CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA 1620Pro leu Pro Leu Arg leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu526 530 535 540GGC GGG CGC CTG GAG ACC ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC 1665Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg541 545 550 555ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG ATC CCC ACC GAC CCG CGC AAC GTC 1710Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val556 560 565 570GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC ATC CCC GAC AAG GAA CAG GCG 1755Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala571 575 580 585ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC CAG CCC GGC AAA CCG CCG 1800Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro586 590 595 600CGC GAG GAC CTG AAG TAA CTG CCG CGA CCG GCC GGC TCC CTT CGC 1845Arg Glu Asp Leu Lys ***601 605AGG AGC CGG CCT TCT CGG GGC CTG GCC ATA CAT CAG GTT TTC CTG 1890ATG CCA GCC CAA TCG AAT ATG AAT TC
2.抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白的基因序列如下CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCT GGG GGA GGC TTA GTG AAG CCT GGA 45Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT 90Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Phe Thr Phe Ser16 20 25 30AGC TAT GCC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCG GAG AAG AGG CTG 135Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu31 35 40 45GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT GGT GGT GGT AGT TAC ACC TAC TAT 180Glu Trp Val Ala Thr Leu Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr46 50 55 60CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT GCC 225Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala61 65 70 75AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC 270Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp76 80 85 90ACG GCC ATG TAT TAC TGT GCA AGA CGG GAG GGC TGG TTT GCT TAC 305Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Glu Gly Trp Phe Ala Tyr91 95 100 105TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT 350Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly106 110 115 120TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG TAC ATC GAG CTC 395Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ile Glu Leu121 125 130 135ACT CAG TCT CCA GCC TCC CTA TCT GCA TCT GTG GGA GAA ACT GTC 450Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val136 140 145 150ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GGG AAT ATT CAC AAT TAT TTA GCA 495Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala151 155 160 165TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC TAT 540Trp Tyr Gln Gln Lys Gly Gln Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr166 170 175 180AAT GCA AAA ACC TTA GCA GAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC 585Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly181 185 190 195AGT GGA TCA GGA ACA CAA TAT TCT CTC AAG ATC AAC AGC CTG CAG 630Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln196 200 205 210CCT GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT CAA CAT TTT TGG AGT ACT 675Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Tyr211 215 220 225CCT CCC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAT CTG AAA CCG CAT 720Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys Pro His226 230 235 240ATG GCC GAA GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG CAC CAG 765Met Ala Glu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln241 245 250 255GCT TGC CAC CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CAG CCG 810Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro256 260 265 270CGC GGC TGG GAA CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG CGG 855Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Thr Pro Val Gln Arg271 275 280 285CTG GTC GCC CTC TAC CTG GCG GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG GTC 900Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val286 290 295 300GAC CAG GTG ATC CGC AAC GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC 945Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly301 305 310 315GAC CTG GGC GAA GCG ATC CGC GAG CAG CCG GAG CAG GCC CTG GCC 990Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Leu Ala316 320 325 330CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG AGC GAG CGC TTC GTC CGG CAG GGC 1035Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly331 335 340 345ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC GCG GCC AAC GCC GAC GTG GTG AGC 1080Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser346 350 355 360CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA TGC GCG GGC CCG GCG GAC 1125Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp361 365 370 375AGC GGC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC TAT CCC ACT GGC GCG GAG 1170Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu376 380 385 390TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC ACC CGC GGC ACG 1215Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr391 395 400 405CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC CGC CAA CTG 1260Glu Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu406 410 415 420GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC ACC TTC CTC 1305Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu421 425 430 435GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG CGC AGC 1350Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser436 440 445 450CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC GAT 1395Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp451 455 460 465CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCA 1440Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala466 470 475 480CGC GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG CCG 1485Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro481 485 490 495CGC TCG AGC CTG CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG GCC 1530Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala496 500 505 510GCG CCG GAG GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG 1575Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro511 515 520 525CTG CCG CTG CGC CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA GGC 1620leu Pro Leu Arg leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly526 530 535 540GGG CGC CTG GAG ACC ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC 1665Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr541 545 550 555GTG GTG ATT CCC TCG GCG ATC CCC ACC GAC CCG CGC AAC GTC GGC 1710Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly556 560 565 570GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC ATC CCC GAC AAG GAA CAG GCG ATC 1755Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile571 575 580 585AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC CAG CCC GGC AAA CCG CCG CGC 1800Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg586 590 595 600GAG GAC CTG AAG TAA CTG CCG CGA CCG GCC GGC TCC CTT CGC AGG 1845Glu Asp Leu Lys ***601 605AGC CGG CCT TCT CGG GGC CTG GCC ATA CAT CAG GTT TTC CTG ATG 1890CCA GCC CAA TCG AAT ATG AAT TC
3.抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白制备工艺包括以下步骤利用单克隆抗体技术和基因重组技术，从分泌抗微小隐孢子虫子孢子表膜抗体的杂交瘤细胞株中克隆其可变区基因，再连接成单链抗体基因，然后将其插入原核表达载体的相应位点上，构建了重组原核表达质粒，再分别采用酶切和PCR方法将去除受体结合区的细菌外毒素插入重组原核质粒中单链抗体基因的下游位点，即利用单链抗体基因代替细菌外毒素的受体结合区，构建重组表达质粒；将上述构建的重组表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表达产物，后对表达产物包涵体进行纯化和复性，并对其进行体外抗虫活性测定和模型动物隐孢子虫病治疗。
4.根据权利要求3所述的抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白制备工艺，包括以下步骤从人工感染隐孢子虫的犊牛粪便中用蔗糖密度梯度离心法分离纯化微小隐孢子虫卵囊，经超声粉碎后免疫BALB/C小鼠，应用杂交瘤技术，制备出1株能稳定分泌抗隐孢子虫McAb的杂交瘤细胞株3D6，并通过免疫荧光法对其进行了鉴定，其在子孢子表面呈弥慢性荧光反应，提示其针对子孢子表膜，从分泌抗隐孢子虫子孢子单克隆抗体的杂交瘤细胞3D6中，提取其mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR扩增，获得抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体的轻、重链可变区基因VL和VH，在这两个基因中加入连接肽基因后，经进一步PCR扩增、组装合成出单链抗体ScFv基因，将该基因克隆入pMD-18T载体后，进行了序列测定；将获得的ScFv基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE的受体结合区，利用原核表达载体pET28，构建了用于表达重组毒素的原核表达质粒3D6pET28-ScFv-PE，将上述质粒转化受体菌BL21后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白。
5.根据权利要求3所述的抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白制备工艺，包括以下步骤从人工感染隐孢子虫的犊牛粪便中用蔗糖密度梯度离心法分离纯化微小隐孢子虫卵囊，经超声粉碎后免疫BALB/C小鼠，应用杂交瘤技术，制备出1株能稳定分泌抗隐孢子虫McAb的杂交瘤细胞株4G4，并通过免疫荧光法对其进行了鉴定发发现针对子孢子表膜。从分泌抗隐孢子虫子孢子单克隆抗体的杂交瘤细胞4G4中，提取mRNA，在反转录酶的作用下，合成cDNA，经PCR扩增，获得抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体的轻、重链可变区基因VL和VH。在这两个基因中加入连接肽基因后，经进一步PCR扩增、组装合成出单链抗体ScFv基因，将该基因克隆入pMD-18T载体后，进行了序列测定；将获得的ScFv基因分别代替绿脓杆菌外毒素PE的受体结合区，利用原核表达载体pET28，构建了用于表达重组毒素的原核表达质粒4G4pET28-ScFv-PE，将上述质粒转化受体菌BL21后，经IPTG诱导，成功地表达了目的蛋白。
6.抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白在预防和治疗人和动物隐孢子虫病的医用用途。
全文摘要
本发明公开一种抗隐孢子虫重组免疫毒素蛋白及其制备工艺和医用用途，是一种预防和治疗隐孢子虫病的药物，利用单克隆抗体技术和基因重组技术，从分泌抗微小隐孢子虫子孢子表膜抗体的杂交瘤细胞株中克隆其可变区基因，再连接成单链抗体基因，然后将其插入原核表达载体的相应位点上，构建了重组原核表达质粒，再分别采用酶切和PCR方法将去除受体结合区的细菌外毒素插入重组原核质粒中单链抗体基因的下游位点，构建重组表达质粒。将上述构建的重组表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导，SDS－PAGE分析表达产物，后对表达产物包涵体进行纯化和复性，并对其进行体外抗虫活性测定和模型动物隐孢子虫病治疗。
文档编号A61P33/00GK1560066SQ20041001071
公开日2005年1月5日 申请日期2004年3月3日 优先权日2004年3月3日
发明者张西臣, 李建华, 蔡辉 申请人:中国人民解放军军需大学