一种烟曲霉素的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗生素生产领域，具体涉及一种从发酵液中提取抗生素的方法。
【背景技术】
[0002] 烟曲霉素(Fumagillin)由烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的发酵培养液中分离 得到具有多种活性的一种代谢产物。其结构式为：
[0003]
[0004] 这种物质具有抗生素活性，又有抑制血管生成作用，从而具有对肿瘤生长的治疗 作用。此外，烟曲霉素的一系列衍生物还具有抗击疟原虫和孢子虫的作用。在养蜂业中烟曲 霉素的是非常有效的治疗西方蜜蜂孢子虫病(Nosema apis)的药物，在美国和加拿大等国 家已经使用有近60年的历史。近些年研究显示，烟曲霉素还是潜在减肥药物，是治疗肥胖的 有效药物。作为一种具有多种活性的药物，烟曲霉素在未来的使用更加广泛。因此，建立简 单有效的烟曲霉素的提取和净化方法，制备烟曲霉素纯品，对于该药物的深入研究和利用 有着重要的意义。
[0005] 由于烟曲霉素结构复杂，用有机合成的方法成本高，因此，目前烟曲霉素大多数从 烟曲霉素的发酵液中提取和纯化获得。之前的专利和文献中主要使用液液萃取的方法来从 发酵液中提取烟曲霉素，提取过程中大量使用二氯甲烷或氯仿，叔丁醇，丙酮和乙酸乙酯等 有毒试剂，同时提取过程中大量的副产物比如高毒的胶霉毒素等需要经过重结晶等方法除 去，步骤繁琐，不易控制。随着人们对环境保护和人体健康的认识，通过优化提取方法，使用 低毒、低污染的方法来提取药物成为药物提纯的趋势。大孔树脂提取作为一种有效的提取 方法，已经广泛的应用到活性物质和药物提取和纯化中。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单，宜于 工业化生产的烟曲霉素提取方法。
[0007] 实现本发明上述目的的技术方案为：
[0008] 1、一种烟曲霉素的提取方法，包括步骤：
[0009] 1)将烟曲霉素发酵液的pH值用盐酸、硫酸、磷酸中的一种调节为1~6.5，用非极性 大孔树脂或弱极性大孔树脂吸附，所用大孔树脂的孔径为57~300人，比表面积为100~ 1200m 2/g，大孔树脂使用前用乙醇和水活化；
[0010] 2)吸附后的树脂置于层析柱中，用质量浓度15~30%的乙醇水溶液清洗；
[0011] 3)用无水乙醇或质量浓度50~98 %的乙醇水溶液洗脱树脂，洗脱液经浓缩和干 燥，得到烟曲霉素粗提品。
[0012] 大孔树脂使用前的活化是用无水乙醇浸没树脂浸泡20~30h，再用3倍的水清洗。
[0013] 作为本发明优选技术方案之一，所述步骤1)中，向烟曲霉素发酵液的pH值调节为1 ~6.0，加入大孔树脂，发酵液和大孔树脂的体积质量比为15~20mL: lg;;搅拌后过滤，过滤 得到的树脂用水清洗。
[0014] 或，所述步骤1)中，将烟曲霉素发酵液离心，分离出上清液，将上清液的pH值调节 为1~6.0，活化后的树脂置于层析柱中，上清液以0.5~3倍床层体积/小时的速度流过层析 柱。
[0015] 其中，所述层析柱的高径比为1~10。
[0016] 进一步地，所述大孔树脂的型号为 D101，XAD-2，HP-20，SP825，SP850SSP700。
[0017] 其中，所述步骤2)中乙醇水溶液流过层析柱的速度为0.5~3倍床层体积/小时。 [0018]其中，所述步骤3)中无水乙醇或乙醇水溶液洗脱树脂在层析柱中进行，无水乙醇 或乙醇水溶液的体积为床层体积的2~4倍。
[0019]进一步地，所述的提取方法，还包括对烟曲霉素粗提品的二次纯化:烟曲霉素粗提 品按照质量体积比40~50mg:l~2L用30%的乙醇水溶解，再次经过装填有大孔树脂的层析 柱用无水乙醇或乙醇水溶液洗脱，洗脱液经避光浓缩和干燥，得到晶体；
[0020 ]晶体按照质量体积比40~5 Omg: 0.1~0.5mL溶于丙酮，加入烟曲霉素粗提品质量 的0.5~1倍的环己胺，反应10~15min后冷却，过滤、挥干丙酮。
[0021] 其中，洗脱后的大孔树脂用90~100%乙醇清洗后重复使用。
[0022] 本发明的技术方案具有如下优点：
[0023] 本发明提出的提取方法，避免了传统工艺中的多种溶剂萃取、反萃等工序，操作可 靠性高且简便，生产过程安全无污染、资源利用率高，生产成本低，又有利于环境保护，是一 种绿色环保的提取烟曲霉素的方法。
【附图说明】
[0024]图1:实施例3产品的检测谱图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 实施例中，若无特别说明，所使用的方法均为本领域常规的方法。
[0027] 实施例1弱极性和非极性大孔树脂的优化实验。
[0028] 1)发酵和填充层析柱
[0029]烟曲霉（菌种购自中国科学院微生物研究所)接入50L发酵罐中发酵，在发酵42h 后，通气12h，此时液体体积约30L。用盐酸调节pH至3.0，将发酵液在5000rpm离心10min后， 得到上清液约28L。取SP850树脂(之前用无水乙醇活化24h)2kg，缓慢置于层析柱中（柱直径 10cm，柱高50cm)，加完后，加入5L水平衡。
[0030] 2)将样液通过带有滤纸的漏斗过滤到层析柱中，样液以2mL/min流过树脂，然后用 分别用5L水和30 %乙醇洗，流速控制在2~5mL/min，可以从流出液看出发酵液中的色素被 清洗，当用30 %乙醇水洗至4L时，已无明显有颜色液体流出，最后用5L 100 %无水乙醇洗 脱，
[0031] 3)洗脱液避光浓缩，得到黄色固体，为粗提品。本实施例中，分别选择D101，XAD-2， HP-20，SP825，SP850，SP700来实验吸附和净化能力。
[0032] 实验结果发现，这几类弱极性树脂对发酵液有脱色和吸附烟曲霉素的能力。但净 化和获得的粗提品含量效果看，SP700(54. lmg)>SP825(52.8mg)>SP850(50.8mg)，这三种填 料得到的粗提品都大于50mg，纯度大于81%，D101(41.2mg)，XAD-2(39.7mg)，HP-20 (42.3mg)三种填料可以获得40mg左右，纯度为80.2%的粗提品。D101，XAD-2，HP-20三种树 脂吸附和净化能力比SP树脂的差，但其价格相对便宜。如果生产成本允许可以选择比表面 积大的SP系列树脂作为吸附和纯化的大孔树脂。为了降低成本一些普通的非极性的树脂， D101，XAD-2，HP-20也可以作为使用，为了提高产率和净化能力，其使用量应该略有增加。 [0033]根据本实施例结果，后续试验采用SP系列树脂进行。
[0034] 实施例2树脂和发酵液体积比的选择：
[0035] 选择SP 825树脂进行试验，以优化树脂和发酵液质量体积比。具体如下：分别取 35mL发酵液于50mL离心管中，分别称取活化好的树脂10g，5g，4g，3g，2g，lg，0 · 5g，0g到离心 管中，旋转震荡2h，进行静态吸附，静置，去除上层发酵液，用lOmL 90%乙醇解析，用液相色 谱测定。
[0036]原液中烟曲霉素的浓度为13.5mg/L，解析后通过液相色谱分析，折算成35mL体积， 计算经不同量树脂吸附后的烟曲霉素浓度，l〇g为13 · 3mg/L，5g为13 · 4mg/L，4g为13 · 3mg/L， 3g为13. lmg/L，2g为13.2mg/L，lg为11.2mg/L，0.5g为5.3mg/L。从结果比较来看当树脂(g) 和发酵液(mL)质量体积比为1:17.