一种简便检测棒曲霉毒素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种简便检测棒曲霉毒素的方法。
【背景技术】
[0002] 发展便捷、低廉的测定食源性致病菌的方法对于食品安全具有重要的意义。已经 报道可以利用家庭用血糖仪测定一些非葡萄糖目标物。棒曲霉毒素是由青霉属、曲霉属、丝 衣霉属产生的真菌代谢毒素，对人体有一系列急性毒性和致畸致癌等慢性毒性。研究表明 棒曲霉素具有引起动物抽搐、肺、肝部出血、肾脏损害、肠道出血等急性毒性，并具有神经毒 性、免疫毒性、基因毒性、致畸、致癌等慢性毒性[Moake MM，Padilla_Zakour 0I，Worobo Rff.Comprehensive review of patulin control methods in foods.Compr Rev Food Sci F，2005,4(l):8-21]。目前常用于检测棒曲霉素的方法主要有化学分析法如薄层层析 法、高效液相色谱法、气相色谱法、色谱联用技术[Scott PM,Lawrence JW,Van Walbeek ff. Detection of mycotoxins by thin-layer chromatography: application to screening of fungal extracts.Appl Microbiol,1970,20(5):839-42；Shephard GS, Leggott NL.Chromatographic determination of the mycotoxin patulin in fruit and fruit juices.J Chromatogr A,2000,882(1-2):17-22；Ito R,Yamazaki H,Inoue K, et al.Development of Liquid Chromatography-Electrospray Mass Spectrometry for the Determination of Patulin in Apple Juice: Investigation of Its Contamination Levels in Japan. J Agric Food Chem,2004,52(25) :7464-7468]等。这些 方法结果可靠、灵敏度高，但是大多数仪器设备比较昂贵，还要进行复杂的前处理，多数只 能在实验室中使用。如今应用比较广泛的免疫分析法，如基于荧光标记的免疫竞争法[de ChampdoreM，Bazzicalupo P,De Napoli L,et al.A new competitive fluorescence assay for the detection of patulin toxin .Anal Chem, 2007,79(2) :751-757]、化学发 光免疫分析法[马强，朱定波，杨杏芳等.鲁米诺-铁氰化钾流动注射化学发光体系测定饮用 水中棒曲霉素.食品工业科技，2013，15: 306-308]、胶体金免疫层析技术[李康，应美蓉，盛 慧萍等.胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检测中的应用.食品安全质量检测学报， 2013,1:201-206]等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对棒曲霉毒素的检测要求， 但方法复杂，需要贵重的仪器，检测成本高。核酸适体技术具有高特异性、高灵敏度、易操 作、成本低等优点。这为棒曲霉毒素的检测提供了新的思路。
[0003] 血糖仪作为临床医学中常用的医疗电子仪器，主要通过测量血液中的血糖浓度进 行临床诊断。最近，美国伊利诺伊大学的化学家们将功能DNA传感器和便携式血糖仪组合在 一起，与蔗糖转化酶把蔗糖转化为葡萄糖的功能结合，把血糖仪用作简单、便携、价格低廉 的血液、血清、水或食物中许多靶分子的测量仪。本发明以96孔板为载体固定棒曲霉毒素适 体DNA，以蔗糖转化酶修饰的适体互补DNA为探针，制备棒曲霉毒素适体生物传感器，以血 糖仪为检测仪器实现了对棒曲霉毒素的快速、便捷测定。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在发明一种方法简单、成本低、灵敏度高、选择性好的测定棒曲霉毒素的 方法。
[0005] 实现发明目的技术方案是：
[0006] 首先，将棒曲霉毒素适体固定在96孔板微孔中，以转化酶修饰的适体互补序列为 探针，通过DNA杂交作用，将探针固定在96孔板微孔中。当有目标物棒曲霉毒素存在时，棒曲 霉毒素与棒曲霉毒素适体发生识别作用，使转化酶修饰的适体互补序列探针脱落，然后取 脱落的探针溶液于小离心管中并加入蔗糖，在探针上转化酶的作用下，将蔗糖转化为葡萄 糖，利用血糖仪为检测仪器，实现对棒曲霉毒素的测定。
[0007] 测定步骤为：
[0008] (1)棒曲霉毒素适体DNA的固定
[0009] 依据链霉亲和素和生物素之间的特异性结合作用将生物素修饰的棒曲霉毒素适 体DNA1固定在链霉亲和素修饰的96孔板微孔上。首先，将100yL 5.0 X 10_7mol/L的DNA1加入 到链霉亲和素修饰的微孔板中，37°C条件下在摇床上振荡反应30分钟，弃去未反应的溶液， 然后用l〇〇yL pH 7.4的Tris-HCl缓冲液清洗三次。
[0010] (2)探针的制备
[0011] 将1〇〇此含10mg NHS的水溶液和100yL含20mg EDC的水溶液混合，然后再加入500μ L的lmg/mL的蔗糖转化酶溶液和100yL 5.0 X l(T7m〇 1/L的DNA2溶液。将所得的溶液混合，在 室温下搅拌3h，得探针(转化酶修饰的适体互补序列探针），4°C条件下保存备用。
[0012] (3)分析检测
[0013] 本方法的棒曲霉毒素传感器是建立在链霉亲和素和生物素的特异性结合、核酸序 列的特异性结合和棒曲霉毒素与其适体的特异性结合的基础上的。首先，将lOOyL的探针溶 液加入到适体固定的微孔中，37°C条件下振荡反应2小时，将未反应的溶液除去，并用100μ LpH 7.4的Tris-HCl缓冲液清洗三次。然后，将含棒曲霉毒素的溶液100yL加入到微孔中，通 过棒曲霉毒素与其适体的特异性结合把探针释放到溶液中，吸取微孔中的溶液于另外一个 微孔中，并加入100yL1.0m 〇l/L的蔗糖溶液，37°C条件下振荡反应2小时。最后，取2yL的溶液 利用血糖仪进行检测（图1)。
[0014] (4)所使用的仪器与试剂
[0015] ACCU-CHEK血糖仪（罗氏诊断产品（上海）有限公司）；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离 心机(上海市安亭科学仪器厂）;AR224CN型电子天平(奥豪斯仪器有限公司）;KQ-50E型超声 波清洗器(昆山市超声仪器有限公司）；THZ型恒温振荡箱(上海一恒科学仪器有限公司）。
[0016] 实验所需各种致病菌的培养基以及配套试剂