一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫细胞化学技术和荧光显微技术，具体涉及一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法。
【背景技术】
[0002]家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是引起蚕业疫病家蚕微粒子病的专性细胞内寄生真核生物。家蚕微孢子虫大小为2?5μπι，其生活史可分为3个阶段:感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。感染期为生活史中的胞外期，该时期家蚕微孢子虫为成熟孢子，在光镜下具很强折光性，适宜条件下可通过弹出极管注入孢原质或细胞内吞等方式感染宿主细胞。裂殖增殖期的家蚕微孢子虫未形成孢壁，不含有几丁质成分，孢子增殖期和感染期的微孢子虫具有由几丁质和蛋白组成的孢壁。微孢子虫的感染常常通过光学显微镜观察感染期的成熟孢子进行诊断(Cali et al.2011)，相差显微镜或微分干涉显微镜观察成熟孢子时其折光性很强。研究者们采用了多种方式以易于微孢子虫观察，包括采用传统的染色剂如姬姆萨、革兰氏和革兰氏变色酸处理对固定涂片进行制样(van Gool et al.1993 ；Moura etal.1997 ； Strano et al.1976)，通过 Calcofluor White M2R 等焚光染料处理(Sak etal.2011； Schwartz et al.1992)，或者使用一些特殊的染色方法如格莫瑞六亚甲基四胺银(GMS)染色、海登海因氏铁苏木精染色、萋一尼氏染色(Gray et al.1969 ； Strano etal.1976)或per1dic acid-Schiff (PAS)染色等。但是，这些技术大多仅能便于成熟微孢子虫的观察，不能区分微孢子虫增殖的不同时期。由于正在发育过程中的微孢子虫体积太小而且位于宿主细胞内，特别是裂殖增殖期的微孢子虫，很难通过显微镜观察，因此大多数微孢子虫的结构和发育阶段都是在扫描电子显微镜(TEM)或者透射电子显微镜(SEM)的帮助下，结合免疫胶体金标记及电脑断层摄影术进行研究的。由于已报道的常规的分辨不同增殖时期的微孢子虫依赖电子显微镜且对技术要求较高，处理过程繁冗耗时，应用具有极大的局限性。因此，急需建立一种简便、有效的微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的标记方法，以促进微孢子虫生活史和功能基因组学研究。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，该方法操作简单，使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜即可实现，打破了对电子显微镜的依赖。
[0004]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0005]—种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，包括如下步骤:
[0006](I)将经封闭处理的组织切片或细胞采用β-Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫；
[0007](2)然后将组织切片或细胞用荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫；
[0008](3)用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜对样品进行观察。
[0009]经封闭处理的组织切片或细胞可采用现有方法制得，其中封闭处理的细胞由以下方法制得:先将感染微孢子虫的宿主细胞固定于载玻片上；然后将固定后的细胞采用Triton X-100溶液浸浴细胞，透化15?30min;再将透化后的细胞采用细胞封闭液进行封闭即可。
[0010]本发明中，固定的方法为将质量分数为0.01?0.1 %的多聚赖氨酸溶液涂抹在载玻片上，风干后得到多聚赖氨酸处理后的载玻片备用;然后将感染微孢子虫的组织切片或细胞滴加到涂有多聚赖氨酸处理的载玻片上，静置5min;吸除多余液体，滴加质量分数为4%的多聚甲醛溶液覆盖细胞固定15min，吸除固定细胞的多余液体，滴加0.0lmol/L PBS溶液浸浴细胞，清洗2次，每次3min。
[0011]本发明中，所述透化为用体积分数为0.1?2%的Triton X-100溶液透化，优选为用体积分数为2%的Triton X-100溶液透化。
[0012]本发明中，所述封闭为滴加封闭液覆盖细胞，18?37°C处理Ih;所述的封闭液为0.05% (V/V)Tween 20,2% (V/V)Triton X-100,0.05% (W/V)BSA和 10% (V/V)山羊血清的PBS溶液。
[0013]本发明中，所述采用β-Tubulin抗体通过间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的微孢子虫的方法为将封闭细胞用含0.05%(￥八)1^的11 20的PBS溶液清洗后，将以封闭液与β-Tubulin的抗体按体积比为1:200稀释的一抗工作液浸浴细胞，18?37°C孵育Ih;吸除一抗工作液液，用含0.05%(V/V)TWeen 20的PBS溶液清洗后，再用以封闭液与Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG按体积比为1:2000稀释的二抗工作液浸浴细胞，常温孵育lh;吸除二抗工作液，再用含0.05%(V/V)TWeen 20的PBS溶液清洗。
[0014]本发明中，荧光增白剂染几丁质的方法标记孢子增殖期的微孢子虫的方法如下:滴加0.1yg/mL Calcofluor White M2R染色液覆盖细胞，18?37°C孵育1min;吸除染色液，用含0.05%(V/V)TWeen 20的PBS溶液清洗后滴加抗荧光淬灭封片剂即可。
[0015]本发明所述微孢子优选为家蚕微孢子虫，所述宿主优选为家蚕。
[0016]本发明的有益效果在于:本发明公开了一种鉴别微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，以家蚕微孢子虫为例，该方法操作简便，识别便利，适用于其他种属微孢子虫的研究;突破了现有技术只能通过制备超薄切片通过透射电子显微镜观察以区分不同增殖时期微孢子虫的限制，大大降低科研成本、技术要求和平台要求;并且本发明的方法，可采用多色荧光标记，以鉴定微孢子虫蛋白的表达时期及其在微孢子虫不同增殖时期的亚细胞定位情况；亦可应用于组织切片中各时期微孢子虫的免疫荧光标记，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0017]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0018]图1为裂殖增殖期和孢子增殖期家蚕微孢子虫荧光标记图。
【具体实施方式】
[0019]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0020]实施例1
[0021]—种鉴别家蚕微孢子虫裂殖增殖期和孢子增殖期的双色荧光标记方法，包括如下步骤:
[0022](I)感染家蚕微孢子虫的昆虫细胞固定:取50yL为0.1 % (W/V，g/ml)的多聚赖氨酸溶液在载玻片上涂抹Icm的圆形区域，风干后得到多聚赖氨酸处理后的载玻片备用;然后吸取感染家蚕微孢子虫的家蚕细胞滴加到涂有多聚赖氨酸处理的载玻片上，静置5min;吸除多余液体，滴加为4 %(W/V, g/ml)的多聚甲醛溶液覆盖昆虫细胞固定15min，吸除固定昆虫细胞的多余液体，滴加0.01mol/L PBS溶液浸浴细胞，清洗2次，每次3min;
[0023](2)透化:吸除液体后滴加体积分数为2%的Triton X_100溶液浸浴细胞，透化15?30min;吸除透化多余液体，PBS溶液浸浴细胞清洗3次，每次3min;
[0024](3)封闭:吸除液体后滴加封闭液覆盖细胞，18?37°C处理lh，期间观察样品3次，以补足封闭液避免细胞干燥;所述的封闭液为0.05%(￥八)1^的11 20,2%(V/V)Triton X-100，0.05%(￥/^4/1111)85厶和10%(￥/^)山羊血清的?85溶液；
[0025](4)间接免疫荧光法标记裂殖增殖期的家蚕微孢子虫:吸除封闭液，清洗液浸浴细胞清洗2次，每次2min，所述清洗液为含0.05 % (V/V)Tween 20的I3BS溶液;然后采用封闭液将β-Tubulin的抗体按体积比为1:200稀释制备一抗工作液，然后滴加一抗工作液浸浴细胞，18?37°C孵育Ih ;吸除一抗工作液液，滴加清洗液清洗3次，每次5min;采用封闭液将Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG按体积比为1:2000稀释制备二抗工作液，再滴加二抗工作液浸浴细胞，常温