用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的治疗剂的制作方法

专利名称：用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的、更具体的说是癌症和肿瘤干细胞的IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂。同样，本发明还描述了一种诊断所述疾病和预测患者的平均期望寿命的方法。
背景技术：
最近在癌症中已经发现了具有干细胞样性质的肿瘤细胞亚群。称为癌症干细胞的这种细胞群据认为是肿瘤的发病、扩散和复发的原因，这说明最有效的疗法是针对肿瘤干细胞进行分区化的治疗。关于这种肿瘤干细胞的分子特征和控制其生物学的调节机制鲜为人知。肿瘤干细胞在其中起显著作用的肿瘤之一是神经胶质瘤，即所谓的神经胶质瘤干细胞或神经胶质瘤起始细胞(GIC)。GIC的特征在于其高致癌潜力，即他们的自我更新能力和分化成多发性细胞系的能力。肿瘤中的干细胞样细胞的数量受其自我再生能力的调节。GIC和癌症干细胞(在一般情况下)会经历对称和不对称的分裂，借此一个干细胞生成两个完全相同的副本，或者一个干细胞副本和一个更加不同的细胞(不对称分裂)。癌干细胞的自我再生能力由对称和非对称分裂之间的平衡来调节，而控制所述自我更新的机制的失调最有可能关系到肿瘤的发病。神经胶质瘤是大脑中最常见的原发肿瘤，根据其组织学和预后可分为四个临床等级。IV级神经胶质瘤(多形性胶质母细胞瘤)具有高度侵略性以及放疗和化疗抗性。尽管在理解与神经胶质瘤的发生和发展有关的分子机制方面取得了进展，但对这类肿瘤的预后和治疗仍然是无效的。神经胶质瘤的治疗选择是手术干预。然而，手术治疗通常伴随着药物的辅助治疗或放射治疗手段。治疗神经胶质瘤的药物选择包括称为PCV的组合物，其包括甲基苄胼、CCNU(洛莫司汀)和长春新碱，以及替莫唑胺联合放疗。GIC据认为是肿瘤的发病、扩散和复发的原因，这说明最有效的疗法是针对神经胶质瘤干细胞进行分区化的治疗。如果不消除GIC，肿瘤将不会被根除。因此，需要有一种能有效消除GIC、防止本领域的现有技术中存在的治疗弊端的替代疗法。

发明内容
在第一方面，本发明涉及一种用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂。在另一方面，根据本发明，本发明涉及一种药品组合物，其包括治疗有效剂量的用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的根据本发明所述的抑制剂，以及药学上可接受的载体。在另一方面，本发明涉及一种在体外确定能够阻断/抑制由IL-6型细胞因子或与其同等功能的变异体所诱导的肿瘤细胞的细胞增殖的化合物的方法，包括以下步骤
(i)将表达IL-6型细胞因子的受体的细胞与IL-6型细胞因子和候选化合物接触， 并且(ii)确定阻断所述细胞进行细胞增殖的那些化合物。在另一方面，本发明涉及一种在体外对主体内与有害细胞增殖相关的疾病进行诊断、或对主体患所述与有害细胞增殖相关的疾病的倾向进行判定、或对主体内的所述与有害细胞增殖相关的疾病的阶段或严重性进行判定、或者对患有所述与有害细胞增殖有关的疾病的主体所进行的治疗的效果进行监控的方法，包括对源自所述主体的生物样本中的编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质同等功能的变异体的表达水平进行量化，其中，与对照样本中编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质同等功能的变异体的表达相比，编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质同等功能的变异体的表达水平的提高，表示了与有害细胞增殖相关的疾病，或者所述主体具有罹患与有害细胞增殖相关疾病的较大倾向， 或者对所述主体进行的治疗没有效果。在另一方面，本发明涉及使用包括试剂的试剂盒来对编码IL-6型细胞因子的基因或用所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质具有同等功能的变异体的表达水平进行量化，用于诊断主体内的癌症，或者确定主体患所述癌症的倾向，或者判断主体内所述癌症的阶段或严重程度，或者预测患有所述癌症的主体的存活率和/或平均期望寿命，或者监控对患有所述癌症的主体所进行的治疗的效果，其中，如果试剂检测出所述基因或所述蛋白质或具有同等功能的变异体的表达相对于对照样本增加了，则所述主体可能患有与有害细胞增殖相关的疾病，或者呈现出患有与有害细胞增殖相关的疾病的较大倾向，或者呈现出所述疾病比较严重，或者所进行的治疗无效。


图1 TGF-β对源自患者的GIC的自我更新的影响。(A)由患有GBM(GBM1，GBM2, GBM3)的三个不同的患者样本产生的PCTC和GBM神经球的代表性图像。(B)通过对人类GBM的三个样本中的PCTC和神经球进行RT-PCR分析的方式来测定 Musashi-I (MSi-I)、Sox2、巢蛋白(Nestin)和 β-肌动蛋白(β-actin)。(C)将从GBMl、GBM2和GBM3肿瘤样本中获得的100000个神经球(nsph.)或PCTC 细胞每种在三个Balbc nu/nu小鼠颅内接种。对每个小鼠在30 40天时进行磁共振成像 (MRI)研究。该图像表示采用从GBMl中获得的神经球或PCTC细胞接种的小鼠的例子。对小鼠称重，每周两次。该图表示用源自GBMl的细胞接种的小鼠的一个例子。(D和E)所示GBM的神经球细胞在无生长因子的条件下用IOOpM TGFi^ 1和/或 2μΜ T β RI抑制剂孵育7天，测定新形成的神经球数量(D)以及细胞总数(E)。(F)采用如D和E所示的方式处理的GBMl神经球的代表性图像。图2源自GBMl神经球中以及源自GBMl的在血清中分化的神经球中的所示标志物的免疫细胞化学。图3 TGF β诱导PCTC和GBM神经球内的LIF的表达。(A)在无血清或保持不处理的培养基中，所示的GBM(GBMl-ll)的11个样本的PCTC细胞用IOOpM的TGFi3 1处理3小时，LIF的表达水平采用qRT-PCR的方式测定。测定 β -actin作为内标归一法对照。(B)依照A的方法处理GBM神经球细胞，并依照A的方法通过qRT_PCR的方式测定 LIF的表达水平。(C)在无血清的培养基中，GBM神经球用IOOpM的TGF β 1禾口 /或2 μ M的T β RI抑制剂孵育3小时，并依照A采用qRT-PCR的方式测定LIF的mRNA水平。(D)在无血清的培养基中，GBMl神经球用IOOpM的TGF β 1、TGF β 2和TGF β 3孵育 3小时，并依照A采用qRT-PCR分析的方式测定LIF的mRNA水平。(E)在用IOOpM的TGFβ 1处理48小时后，GBMl神经球内所分泌的LIF蛋白的水平采用ELISA的方式测定。图4 TGF β通过激活型Smad复合物诱导LIF的转录。(A)荧光素酶LIF的指示剂构建体的示意图。(Β)Α172 神经胶质瘤细胞用荧光素酶 LIF(-634/+32)、(-276/+32), (-276/+32) mutSBE或(-73/+32)指示剂构建体转染。转染16小时后，细胞用IOOpM的TGF β 1处理20 小时并分析荧光素酶的活性。(C)U373MG细胞用IOOpM的TGF^ 1处理3小时，用所示抗体和所示PCR引物进行 ChIP分析。(D，Ε)在沉默由所示Smad族中的所示成员的SiRNA介导后，通过用IOOpM的 TGF β 1处理3小时的U373MG (D)或GBM神经球(E)的qRT-PCR分析的方式来测定LIF的水平。使用Smad或Smad4的qRT-PCR的特异性抗体进行蛋白质印迹分析，测定β -actin作为内标归一法对照。图5 TGF β诱导源自患者的GBM神经球内的LIF-JAK-STAT通路。(A)通过对用20ng/ml的LIF处理所示时间的GBMl样本的神经球进行蛋白质印迹分析的方式来测定P-STAT3和STAT3的水平。(B) GBMl样本的神经球用20ng/ml的LIF和/或0. 5 μ M的Ρ6处理15分钟，并采用蛋白质印迹分析的方式测定P-STAT3和STAT3的总水平。(C)在没有Ere和FGF存在时，GBMl样本的神经球用IOOpM的TGF β 1或2 μ M的 T β RI抑制剂处理4小时，并用蛋白质印记分析的方式测定p-STAT3、STAT3、p-Smad2、Smad2 和α-微管蛋白的水平。(D)在没有Ei7G和FGF存在时，用IOOpM的TGF β 1、0. 5 μ M的Ρ6或LIF的阻断抗体处理GBMl样本的神经球4小时，并用蛋白质印记分析的方式测定P-STAT3和STAT3的总水平。图6 LIF通过TGFii介导GIC的自我更新的增加。(Α, B)在EGF和FGF不存在时，GBMl、GBM2和GBM3神经球细胞用IOOpM的TGF β 1、 20ng/ml的LIF和/或抗-LIF中和抗体和0. 5 μ M P6处理，并测定新形成的神经球数量(A) 或细胞总数(B)。(C)采用如A和B所示的方式处理的GBMl神经球的代表性图像。图7 TGF β和LIF防止GBM神经球的分化。(A)所示蛋白质的免疫细胞化学在神经球内实施，该神经球源自在无生长因子的条件下用IOOpM的TGF β 1或20ng/ml的LIF处理7天，并且最后3天在用聚-L-赖氨酸涂敷的载玻片上进行。(B)在无生长因子的条件下进行所示治疗7天后，在GBMl神经球内测定 Musashi-I (Msi-I)、Sox2和Nestin的mRNA水平。采用18S的RNA水平作为内标归一化对照。图8 TGFii对正常人类神经母细胞的自我更新能力的影响。(A)在人类神经母细胞的神经球内进行所示标记物的免疫细胞化学处理。(B)用IOOpM的TGF β族的所示成员孵育GBMl样本的神经球和人类神经母细胞的神经球3小时，测定LIF的mRNA水平。(C，D)在与上文图ID所述的相同条件下，用IOOpM的TGF^ 1或20ng/ml的LIF孵育正常人类神经母细胞的神经球细胞7天，测定新形成的神经球(C)和细胞总数(D)。图9人类神经胶质瘤肿瘤中的LIF表达。(A)在39个人类神经胶质瘤患者样本中由qRT-PCR分析方法确定LIF、TGF β 2、 Musashi-I (Msi-I)、Sox2 和 Nestin 的转录。(B) LIF 和 TGF β 2、Musashi-1 (Msi-I)、Sox2 或 Nestin 之间的关联。Spearman 秩相关系数(Mio)，双尾显著性。(C)TGFii通过LIF诱导的方法引发GSC的自我更新，提高肿瘤块内干细胞样细胞
组的数量。图10神经胶质瘤患者的LIF的mRNA水平与平均期望寿命相关联。Kaplan-Meier 曲线显示，采用时序检验，具有LIF的mRNA水平上调> 2倍的GBM患者的总生存期显著高于其余患者(P = 7. 2E-8)。数据采自用于国立癌症研究所的分子脑肿瘤数据(伦勃朗)程序的库。图11神经胶母细胞瘤(GBM)患者的LIF的mRNA水平与平均期望寿命相关联。 Kaplan-Meier曲线显示，采用时序检验，具有LIF的mRNA水平上调彡9倍的GBM患者的总生存期显著高于其余患者(P = 6. 9E-4)。数据采自用于国立癌症研究所的分子脑肿瘤数据 (伦勃朗)程序的库。图12患有某些类型的肿瘤的一些患者具有异常高水平的LIF。不同类型的肿瘤中LIF的mRNA水平显示，有些病人(如圆圈所示)具有异常高水平的LIF。数据从 GeneSapiens生物信息学团队获得(www. Renesapiens. org)。数字代表1)前_B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL) ；2)前-T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL) ；3)B细胞慢性淋巴性白血病(B-CLL) ；4)急性骨髓性白血病(AML) ；5)浆细胞白血病；6)骨髓瘤；7)B细胞淋巴瘤；8)伯基特淋巴瘤；9)T细胞淋巴瘤；10)软骨肉瘤；11)骨肉瘤；1 尤因氏肉瘤；13) 滑膜肉瘤；14)平滑肌肉瘤；15)横纹肌肉瘤；16)脂肪肉瘤；17)肉瘤，除非另有特别说明 (NOS) ；18)皮肤鳞状细胞癌；19)黑色素瘤；20)神经胶质瘤；21)神经母细胞瘤；22)恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST) ；23)脊索瘤；24) 口腔鳞状细胞癌；25)喉咽鳞状细胞癌；26)腮腺癌；27)肺腺癌；28)肺部大细胞癌；29)肺部小细胞癌；30)肺部鳞状细胞癌；31)肺部良性肿瘤；32)间皮瘤；33)食道腺癌；34)胃腺癌；35)胃肠道间质肿瘤(GIST) ；36)小肠腺癌； 37)结直肠癌；38)肝癌；39)胰腺癌；40)肾上腺肿瘤；41)甲状腺癌；42)肾嗜酸细胞瘤； 43)肾癌；44)肾母细胞瘤；45)膀胱癌46)睾丸精原细胞瘤；47)睾丸非精原细胞瘤；48)前列腺癌；49)乳腺导管癌；50)乳腺小叶癌；51)乳腺髓样癌；52)乳腺癌，其他；53)乳房癌，NOS ；54)卵巢透明细胞癌；55)卵巢子宫内膜腺癌；56)卵巢生殖细胞瘤；57)卵巢黏液腺癌；58)卵巢浆液腺癌；59)卵巢腺癌，除非另有特别说明(NOS) ；60)卵巢肿瘤，其他；61) 腹膜腺癌；62)子宫肉瘤；63)子宫腺癌；64)子宫鳞状细胞癌；65)子宫苗勒管肿瘤；66)宫颈腺癌；67)宫颈鳞状细胞癌；68)阴道/外阴癌。
具体实施例方式本发明的发明人令人惊讶地发现，IL-6型细胞因子、更具体地说是LIF参与了 TGF^介导的JAK-STAT信号级联的激活，从而诱导了细胞增殖过程和肿瘤干细胞(癌症干细胞)的增加。根据这一事实，发明人开启了一种针对治疗与有害细胞增殖相关的疾病如癌症、特别是对JAK-STAT信号通路的高活性造成的癌症进行治疗的新治疗窗口，所述治疗基于使用IL-6型细胞因子的抑制剂。识别LIF在JAK-STAT的活化中作为TGFi^的下游元素还允许对所述JAK-STAT级联进行更有效的抑制，因为它不仅在由TGFii激活时阻止活化，而且在由任何其他刺激如白细胞介素、促红细胞生成素、生长激素、催乳素等激活时阻止活化。因此，一方面，本发明涉及用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂。不希望被任何理论约束，认为LIF及其抑制剂对肿瘤增殖的作用在于LIF促进肿瘤干细胞增殖的能力。因此，LIF抑制剂尤其用在那些IL-6型细胞因子的高表达的肿瘤、 具体地说是LIF的治疗中。这将也有益于抗化疗肿瘤的治疗，因为肿瘤干细胞已知有抗化疗的能力。最后，考虑到肿瘤干细胞看起来对复发负有责任，使用LIF抑制剂来治疗与有害细胞增殖相关的疾病将特别适合于防止发生复发。因此，在第一个方面，本发明涉及一种用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的 IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂。在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的方法，包括施用IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂。在另一个方面，本发明涉及用于制备为治疗与有害细胞增殖相关的疾病的药物组合物的IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂。在本发明的上下文中，“IL-6型细胞因子”理解为IL-6族的细胞因子成员，包括 IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、心肌营养素_1 (CT-I)、睫状神经营养因子(CNTF)和心肌营养因子类细胞因子(CLC)，它们能激活JAK-STAT信号通路。这些细胞因子共享相同的受体复合物，其中糖蛋白 130(GP 130)受体的亚基是一种常见的成分。因此，在本发明的一个具体实施例中，IL-6型细胞因子选自LIF、IL_6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC。在另一个更具体的实施例中，IL-6型细胞因子是LIF。在本发明的上下文中，“抑制剂”理解为任何物质或化合物，其能够防止或阻止编码IL-6型细胞因子的基因的转录和翻译(即防止或阻止所述基因的表达)，或者能够防止被所述基因编码的蛋白质执行其功能(活性)，即防止IL-6型细胞因子能够诱导JAK-STAT 信号通路的激活。确定一种化合物是否是IL-6型细胞因子的抑制剂的分析方法为本领域所熟知。例如，Mezt S.等人介绍了一种基于抑制剂的能力来阻止在对IL-6型细胞因子敏感的启动子的控制下的报告基因的表达的分析方法(J. Biol. Chem, 2007, vol. 282 :1238 1248)。对于LIF的具体情况，用于鉴别抑制剂的方法包括在没有LIF的情况下对Ml小鼠髓系白血病细胞分化的抑制(W02005/30803)、对从Jurkatt细胞中释放钙的刺激的抑制 (US5980894)、通过IL-6型细胞因子对STAT-3磷酸化的测量(见本说明书实施例部分的第 2.4节之示例幻，等等。作为示例，适合在本发明中使用的LIF表达的抑制剂例如是反义寡核苷酸、干扰 RNA(siRNA)、催化RNA或特定核酶、具有诱饵活性即有能力特异性结合到对于基因表达来说是重要的因子(一般为蛋白质)的RNA，等等。类似地，能够防止被编码IL-6型细胞因子的所述基因编码的蛋白质执行其功能的抑制剂例如是蛋白质肽抑制剂、直接针对蛋白质中的为履行职能所必需的抗原表位的抗体，或者直接针对IL-6型细胞因子受体的抑制剂等。因此，在本发明的一个具体实施例中，抑制剂选自由SiRNA、反义寡核苷酸、特定核酶、抗体、多肽和IL-6型细胞因子受体的抑制剂所构成的组。siRNA小干扰RNA即siRNA是能通过RNA干扰抑制靶基因表达的药剂。siRNA可通过化学方法合成，可通过体外转录得到，或在靶细胞中体内合成获得。siRNA在长度上通常由15 到40个核苷酸的双链RNA构成，它可包含一个1到6个核苷酸的位点3 ‘和/或5 ‘的突出区。突出区的长度独立于siRNA分子的总长度。siRNA通过退化方式或目标信使的后转录沉默起作用。siRNA可被称shRNA (短发夹RNA)，其特征为形成siRNA的反向平行链通过环状或发夹区域来连接。这些siRNA是一种短反义序列(19至25个核苷酸)后接5到9个核苷酸环结构再后接有义链的化合物。shRNA可以由质粒或病毒、尤其是逆转录病毒编码，并可处在启动子如RNA聚合酶III的TO启动子的控制下。本发明的siRNA本质上是编码IL-6型细胞因子的基因的mRNA的同源体，或者是编码所述蛋白质的基因组序列的同源体。“本质上是同源体”理解为具有这样的序列，其与靶mRNA充分地互补或类似，使得siRNA能够导致靶mRNA通过RNA干扰而降解。适合造成由所述干扰的siRNA包括由RNA形成的siRNA，以及含有不同化学修饰物的siRNA，如-siRNA，其中核苷酸之间的键与那些天然发现的不同，如硫代磷酸键。-具有功能试剂如荧光团的RNA链的偶联物。-RNA链端基的修饰，特别是在2'位通过利用不同的羟基功能基团修饰3'端。-具有修饰糖基的核苷酸，例如在2'位的0-烷基化残基，如2'-0-甲基核糖ρ 2' -0-氟代核糖。-具有修饰碱基的核苷酸，如卤化碱基(例如5-溴脲嘧啶和5-碘脲嘧啶)、烷基化碱基(如7-甲基鸟苷)。本发明的siRNA和shRNA可利用本领域的专业人员已知的一系列技术来获得。例如，siRNA可以在传统的DNA/RNA合成器中从有磷酰胺保护的核(糖核)苷 (ribonucleosides)中化学合成。备选地，siRNA可以重组的方式从质粒和病毒载体中生产，在这种情况下，编码形成siRNA的链的区域在RNA聚合酶III启动子的操作控制下。在细胞中，Dicer RNA酶将shRNA转化为功能性siRNA。被看作设计siRNA基础的核苷酸序列区域不是限制性的，并包括编码序列的区域(在起始密码子和终止密码子之间)，或者它也可以包括5'和3'位点未翻译区的序列，其优选长度为25到50个核苷酸，并在相对于起始密码子的3'位点的任何位置。一种设计 siRNA的方法涉及AA(N19)TT基序的识别，其中N可以是编码IL-6型细胞因子且选择那些具有高G/C丰度的序列中的任何核苷酸。如果所述基序没有找到，可以识别NA(N21)基序， 其中N可以是任何核苷酸。反义寡核苷酸本发明的另外一个方面涉及使用分离的“反义”核酸来抑制表达，例如抑制编码 IL-6型细胞因子的核酸的转录和/或翻译，其活性将被抑制。反义核酸可以通过传统的碱基互补，或者例如在与双链DNA结合的情况下通过双螺旋大沟中的特定相互作用而与潜在的药物靶标结合。这些方法一般涉及到本领域常用的技术范围，包括任何基于特异性结合寡核苷酸序列的方法。本发明的反义构建体例如可以作为表达质粒来交付，当在细胞内转录时，其产生了与编码IL-6型细胞因子的细胞mRNA的至少一部分互补的RNA。或者，反义构建体是寡核苷酸探针，其产生于体外，并且当导入细胞内时通过与目标核酸的mRNA和/或基因组序列杂交来产生表达抑制。这样的寡核苷酸探针优选是经修饰的寡核苷酸，其可耐内源性核酸如外切酶和/或内切酶，并因此在体内是稳定的。典型的用作反义寡核苷酸的核酸分子是氨基磷酸酯、磷酸酯和甲基磷酸酯DNA类似物(也见于美国专利文献5176996、5沈4564和 5256775)。例如在 Van der Krol et al.，BioTechniques 6 :958 976，1988 以及 Stein et al. ,Cancer Res 48 J659 沈68，1988中回顾了构建用在反义疗法中的低聚物的一般方法。关于反义DNA，源于翻译起始位点、例如在靶标基因的-10和+10之间的寡脱氧核苷酸的区域是优选的。反义方法涉及到与编码目标多肽的mRNA互补的寡核苷酸(DNA或 RNA)的设计。反义寡核苷酸将与mRNA的转录结合，并防止翻译。绝对的互补性虽然是首选，但并是必须的。在双链反义核酸的情况下，由此可以检测双链DNA的一个单链，或者可以检测三链DNA的形成。杂交的能力将取决于互补的程度和反义核酸的长度。一般来说， 核酸杂交越长，它可包含的RNA配对错误越多，并且它仍然形成一个稳定的二倍体(或三倍体，视情况而定)。通过使用用于确定杂交合体熔点的标准工艺，本领域的专业人员可以确定配对错误的可容忍程度。与mRNA的5'端、例如直到且包括AUG启动子的非翻译的5'端序列互补的寡核苷酸必须尽可能有效地发挥作用以抑制翻译。然而最近已被证明，与mRNA的非翻译的3' 序列互补的序列也能有效地抑制mRNA的翻译(Wagner，Nature 372:333,1994)。因此，与基因的非翻译、非编码的5'区或3'区互补的寡核苷酸也可用于反义的方式抑制该mRNA 的翻译。与mRNA的非翻译的5'区互补的寡核苷酸应包括AUG起始密码子的互补体。与 mRNA的编码区互补的寡核苷酸是较无效的翻译抑制剂，但根据本发明它们也可以使用。如果设计与mRNA的5'、3'或编码区杂交，反义核酸应有至少6个核苷酸的长度，优选低于约 100，进一步优选低于50、25、17或10个核苷酸的长度。优选在体外研究中首先对抑制基因表达的反义寡核苷酸的能力进行量化。优选这些研究使用对照样，以区分反义基因抑制和寡核苷酸的非特异性生物效应。同样优选在这些研究中将RAN或靶蛋白的水平与内部RNA或蛋白质对照样进行对比。用反义寡核苷酸得出的结果可以与对照寡核苷酸获得的结果进行对比。优选的是，对照寡核苷酸具有与被检测寡核苷酸相同的长度，而寡核苷酸序列与反义序列的不同不超过对于防止与目标序列的特定杂交来说为必要的程度。反义寡核苷酸可以是DNA、或RNA、或嵌合混合物、或修饰的衍生物或其单链或双链版本。寡核苷酸可以在碱基基团、糖基基团或磷酸骨架中进行修饰，例如以改善分子、杂交等的稳定性。寡核苷酸可以包括其他约束基团如肽(例如将其指向宿主细胞受体)，或者使得穿过细胞膜的运输更容易的试剂(例如见Letsinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 :6553-6556,1989 ；Lemaitre et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :648-652,1987 ； W088/09810)，或者血脑屏障(例如见W089/10134)、杂交引发切割剂(例如见Krol et al.， BioTechniques 6 :958-976,1988)、嵌入剂(例如见 hn，Pharm. Res. 5 :539-549,1988)。为此，寡核苷酸可以与其他分子共轭，例如多肽、杂交引发交联剂、运载剂、杂交引发切割剂，寸寸。反义寡核苷酸可包括至少一个选自如下组的被修饰的碱基，该组包括但不限于
5-氟脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-氯脲嘧啶、5-碘脲嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、 5_(羧基羟基三乙基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q鸟苷、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2_ 二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫脲嘧啶、 β-D-甘露糖Q鸟苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-Ν6-异戊烯基腺嘌呤、尿苷-5-含氧乙酸、wybutoxosine，假尿嘧啶、Q鸟苷、2-巯基嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基脲嘧啶、尿嘧啶-5-含氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-含氧乙酸(V)、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)W和2，
6-二氨基嘌呤。反义寡核苷酸也可包括至少一个选自如下组中的被修饰的糖基，该组包括但不限于阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖和己糖。反义寡核苷酸还可以包含类似中性肽的骨架。这种分子被称为肽核酸(PNA)低聚物，并例如在Perry-O' Keefe et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 93 :14670,1996 以及Eglom et al. , Nature 365 :565,1993 中有描述。PNA 寡聚体的一个优点是，因为有中性DNA骨架，他们具备以本质上独立于介质离子力的方式与互补DNA相结合的能力。在又一个实施例中，反义寡核苷酸包含至少一个选自下组中的被修饰的磷酸骨架，该组包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、氨基磷酸酯、磷二酰胺、甲酯磷酸酯、烷基磷酸三酯、以及formacetal或其类似物。在另一个实施例中，反义寡核苷酸是一种α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸形成带有互补RNA的特定双链杂交体，其中与典型的反向平行定向不同，链是彼此平行的 (Gautier et al.，Nucl. Acids Res. 15 :6625-6641,1987) 寡核苷酸是一种 2，-0-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，Nucl. Acids Res. 15 :6131-6148,1987)或一种 RMA-DNA 的嵌合类似物(Inoue et al.，FEBS Lett. 215 :327-330,1987)。虽然可以使用与靶mRNA序列的编码区互补的反义寡核苷酸，然而也可以使用那些与非翻译的转录区互补的反义寡核苷酸。在某些情况下，可能难以达到足以抑制内源性mRNA翻译的反义细胞内浓度。因此，一种优选方法是使用重组DNA结构体，其中反义寡核苷酸处于强聚合酶III或聚合酶II 启动子的控制下。使用这种结构体转染靶细胞将导致足够量的单链RNA的转录，这将与药物的潜在靶内源性转录形成互补的碱基对，并将因此防止翻译。例如可以引入载体，以便由细胞捕获并引导反义RNA的转录。这种载体可以保持游离状态或整合到染色体上，同时可以被转录以产生所需的反义RNA。这种载体可以通过本领域中的重组DNA技术标准的方法来构建。载体可以是病毒质粒，或本领域已知的用于在哺乳动物细胞中复制和表达的其他质粒。编码反义RNA的序列的表达可以借助于本领域已知的作用于哺乳动物细胞、优选是人体细胞的任何启动子。这种启动子可以是诱导的或构建的。这些启动子包括但不限于 SV40 早期区域的启动子(Bernoist & Chambon, Nature 290 :304_310，1981)、包含在劳氏肉瘤病毒的3'位长重复终端处的启动子(Yamamoto et al.，Cell 22 :787_797，1980)、疱疹病毒胸苷激酶基因启动子(Wagner et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :1441-1445, 1981)、金属硫蛋白基因调节序列(Brinster et al.，Nature 296 :39_42，1982)，等等。任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体均可用于制备重组DNA结构体，它可以直接导入在该组织的位点。靶基因的表达也可另选地以下述方式表达，S卩，使互补脱氧核糖核苷酸序列指向基因的控制区(即启动子和/或促进剂)，形成三重螺旋结构，防止体内靶细胞的基因转录表达(一般可见于Helene，Anticancer Drug Des，6(6) :569-84,1991 ；Helene et al. ,Ann. N. Ε. Acad. Sci.，660 :27-36,1992 ；以及 Maher, Bioassays 14 (12) :807-15,1992)。用于形成三重螺旋以抑制转录的核酸分子优选是单链的并由脱氧核糖核苷酸形成。这些寡核苷酸的碱基组成必须通过Hoogsteen碱基配对规则来加强三重螺旋的形成， 该规则通常要求在双倍体的链上有相当大部分的嘌呤或嘧啶存在。核苷酸序列可基于嘧啶，其通过所得三重螺旋的三个相关链而导致了 TAT和CGC三倍体。嘧啶中的富含分子以平行于所述链的定向提供了针对富含双倍体的单链嘌呤区域的碱基互补体。此外可以选择例如包含部分G残基的嘌呤中富含的核酸分子。这些分子将与GC对中富含的双链DNA形成三重螺旋体，其中大多数嘌呤残基位于目标双倍体的单链上，从而通过三重结构中的三个链产生CGC三重结构。备选地，可以增加选择用于形成三重螺旋的潜在目标序列，产生称为“发夹形”的核酸分子。发夹形分子以5' -3'、3' -5'交替的形式合成，使得他们与双链体中的一条链、再与另一条链形成第一碱基对，消除了对双链体中的一条链中存在相当大部分的嘌呤或嘧啶的需要。在一些实施例中，反义寡核苷酸为反义吗啉。吗啉是天然核酸结构的重新设计产物的合成分子。其长度一般为25个碱基，通过标准核酸碱基配对结合到互补RNA序列。从结构上讲，吗啉和DNA之间的差异是，即使吗啉有标准核酸碱基，这些碱基结合到吗啉环而非脱氧核糖环上，并且它们通过磷二酰胺基团而不是通过磷酸盐结合。与中性磷二酰胺基团交换阴离子磷酸盐消除了正常生理学PH值范围内的电离，使得细胞或有机体中的吗啉是不带电荷的分子。吗啉是非嵌合的寡核苷酸；吗啉的整个主链由这些修饰后的亚基构成。 吗啉是比较常用的单链寡核苷酸，然而一个吗啉链和一个互补DNA链的异源双链核酸分子可通过胞液分布与阳离子试剂结合起来使用。与许多反义结构类型(例如磷酸酯)不同，吗啉不会使其目标RNA分子降解。相反，吗啉通过“空间位阻”的方式起作用，结合到RNA的目标序列上且只能置于分子通道，否则就可能与RNA相互作用。吗啉寡核苷酸通常用于考察特异性mRNA转录在胚胎如鸡蛋，或斑马鱼、非洲爪蛙(异爪蛙)、鸡和海胆的胚胎中的作用，产生“突变”胚胎。在合适的胞液分布系统下，吗啉在细胞培养过程中是有效的。吗啉已由AVI BioPharma公司开发成为药物，命名为“NeuGenes”。它们一直在哺乳动物中使用，范围涵盖小鼠到人类，一些目前正进行临床试验。由于结合到信使核糖核酸(mRNA)的5'非翻译区，吗啉可以干扰从5‘帽到起始密码子的核糖体起始复合物的发展。这阻止了目标转录物的编码区的翻译(称为“沉默”基因表达)。吗啉为蛋白的沉默表达以及获知该减少如何改变细胞或有机体提供了一个合适的培养基。有些吗啉的沉默表达是很有效的，以致既存的蛋白质降解后，目标蛋白变得无法用蛋白质印迹法检测到。吗啉还可干扰前-mRNA的处理步骤，通常会防止指引拼接的RNPnp复合物在前RNA 螺旋结构的内含子边界中结合到其标靶上。阻止Ul结合(供体方)或U2/TO结合(多具嘧啶基团和受体方)会引起修改的拼接，通常导致成熟的mRNA外显子的排斥。指引一些拼接标靶导致内含子的包容，而隐秘的拼接位点的激活可导致部分包容或排斥。U11/U12 RNPnp标靶也可被阻断。拼接的修改适于通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来检测，它在RT-PCR产物的凝胶电泳后在条带中作为迁移物可见。吗啉也被用来阻断miRNA的活性、核酶活性、内含子拼接沉默子和拼接增强子。U2 和U12RNPnp的功能已通过吗啉被抑制。针对蛋白质编码区域内“滑的” RNA序列的吗啉可以诱导翻译的阅读框架中的改变。针对标靶的这一多样性的吗啉活性说明了吗啉可以作为一般的多用途工具，用于阻断蛋白质或核酸与mRNA的相互作用。对于LIF特异性反义寡核苷酸的例子，Kamohara等人(Int J Oncol, 2007, 30 977-983)和 Cheng 等人(Biol R印rod，2004，70 1270-1276)已经做了描述。DNA 酶本发明的另一个方面涉及使用DNA酶来抑制本发明的编码IL-6型细胞因子的基因表达。DNA酶包括一些反义及核酶技术的机理特征。DNA酶设计成使得与反义寡核苷酸类似，它们可识别特定的标靶核酸序列，然而与核酶一样，它们具有催化性，且能特异性切割靶核酸。目前有两种类型的DNA酶，均由Santoro和Joyce鉴定(例如见美国专利 6110462)。DNA酶10-23包含一个连有两个臂的环结构。两个臂通过识别特定靶核酸序列而提供特异性，而环结构在生理条件下提供催化功能。简言之，要设计可特异性识别并切割靶核酸的理想DNA酶，本领域的技术人员必须先找出独特的靶序列。这可以通过使用与针对反义寡核苷酸所述的同样方法来实现。优选地，单一或者大致单一的序列富含在约18至22个核苷酸的G/C中。G/C中的高含量有助于确保DNA酶和靶序列之间更强的相互作用。当DNA酶是合成的时，将酶引至信使中的特异性反义识别序列被分开，使其包含 DNA酶的两个臂，而DNA酶的环位于两个特异性臂之间。例如在美国专利6110462中可以找到制备和施用DNA酶的方法。同样，在体外或体内交付DNA核酶的方法包括如上所详述的RNA核酶交付方法。此外，本领域技术人员应该认识到，像反义核苷酸一样，DNA酶可以有选择地进行修饰，以提高稳定性并提高抗降解性。本发明所述的反义RNA和DNA、核酶、iRNA和三螺旋分子可以采用本领域中用于合成DNA和RNA分子的任何已知方法来制备。例如，这些包括本领域公知的用于化学法合成寡脱氧核苷酸和寡核苷酸的方法，比如亚磷酰胺的固相化学合成。或者，RNA分子可以通过编码反义RNA分子的DNA序列在体外和体内转录的方式形成。这种DNA序列可纳入在多种结合有合适RNA聚合酶启动子、如T7或SP6聚合酶启动子的载体中。或者，可在细胞系中稳定地导入反义cDNA构建体，其取决于所用的启动子而构成性地或诱导性地合成反义 RNA。此外，几个众所周知的修饰可以作为增加细胞内稳定性和半衰期的手段引入到核酸分子中。可能的修饰包括但不限于增加侧翼核苷酸或脱氧核苷酸序列到分子的5'和/或3' 端，或者在寡脱氧核苷酸的骨架上使用硫代磷酸酯或2' -0-甲基键而不是磷酸二酯酶。为催化切割靶mRNA的转录而设计的核酶分子也可用来阻止编码其活性被抑制的 IL-6型细胞因子的mRNA的翻译。核酶是能够催化特异性RNA切割的酶RNA分子(其综述可见于Rossi ,Current Biology 4:469-471,1994)。核酶的作用机制包括将核酶分子序列特异性杂交到互补的靶RNA，之后是内切核苷酸的切割事件。核酶分子的组成最好包括一个或多个与靶mRNA互补的序列，以及众所周知的用于切割mRNA的序列或功能相当的序列 (例如见美国专利5093M6，其全部内容通过引用结合到本文中)。虽然可使用将mRNA切割成位点特异性识别序列的核酶来消除靶mRNA，优选使用锤头型核酶。锤头型核酶在由与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所指定的位置处切割 mRNA。优选地，靶mRNA有以下两个碱基序列5' -UG-3'。锤头型核酶的构造和制备是本领域众所周知的，Haseloff和Gerlach对此做了详细的描述(Nature 334 =585-591,1988)， 并且可见于PCT申请W089/05852，其内容通过引用结合到本文中。锤头型核酶的序列可被嵌入到稳定的RNA如转运RNA(tRNA)中，以增加体内切割的效力(Perriman et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,92:6175-79,1995 ；of Feyter & Gaudron， Methods in Molecular Biology,Vol. 74,Chapter 43, " Expressing Ribozymes in Plants" ,Edited by Turner, P. C, Humana Press Inc.，Totowa, N. J.)。尤其是，带有由 RNA 聚合酶 III 介导的 tRNA 的融合核酶的表达是本领域众所周知的(见Kawasaki et al.，Nature 393 =284-9,1998 ； Kuwabara et al., Nature Biotechnol. 16 :961-5,1998 ；Kuwabara et al., Mol. Cell. 2 617-27,1998 ；Koseki et al. ， J Virol 73 :1868-77,1999 ；Kuwabara et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 96 :1886-91,1999 ；Tanabe et al. ,Nature 406 :473_4，2000)。通常，靴cDNA 序列中有许多潜在的锤头型核酶的切割位点。核酶优选被操纵成使得切割识别位点靠近靶 mRNA的5'端，以提高功效并减少非功能性mRNA转录的细胞内积聚。此外，使用位于例如短型和长型的靶的编码C-末端氨基酸域的不同部位的靶序列中的任何切割识别位点，将允许有选择地针对任何型的靶，从而对靶基因产物的形式有选择性的影响。针对基因的核酶应含有与两个区域互补的杂交区，每个具有靶mRNA中的至少5 个，最好是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个长度的连续核苷酸，比如表示在任何人源RAP80蛋白质中的序列的mRNA。此外，核酶有非常特定的能自催化切割编码靶mRNA的核酸内切酶活性。本发明扩展到这样的核酶，其与编码靶基因、如治疗药物的候选靶基因的编码mRNA杂交，因此可与编码mRNA杂交并将其切割，使得它不再能够被翻译以合成功能性多肽产物。本发明组合物中所使用的核酶还包括内切核糖核酸酶RNA(以下简称“Cech-型核酶”)，例如发现天然存在于嗜热四膜虫体内的内切核糖核酸酶RNA(称为IVS或L-19 IVS RNA)，这已被广泛被 Thomas Cech 等人详细描述(Zaug et al.，Science 224:574-578， 1984 ；Zaug et al. , Science 231 :470-475,1986 ；Zaug et al. , Nature 324:429-433， 1986 ；W088/04300, University Patents Inc. ；Been, et al. , Cell 47:207—216,1986)。 Cech-型核酶具有带有8个与靶RMA序列杂交的碱基对的活性部位，靶RNA的切割在此处之后发生。本发明包括那些具有作为靶序列的Cech-型核酶，该靶序列具有带有存在于靶基因或核酸序列中的8个碱基对的活性部位。核酶可以通过修饰寡核苷酸(例如用于提高稳定性、导向性等)形成，他们应交付到靶基因的体内表达细胞。一种优选的交付方法包括使用在聚合酶III或聚合酶II的强构成性启动子的控制下“编码”核酶的DNA构建体，以使转染的细胞会产生足够数量的核酶， 以破坏内源性的靶信使并抑制翻译。由于核酶具有催化作用，不像其他的反义分子，因此其起作用所需的细胞内浓度较低。在某些实施例中，核酶可以通过先识别足以通过iRNA降低效力的部分序列进行设计。相同部分的序列可在之后结合到核酶中。在本发明的这方面，针对基因的部分核酶或iRNA本质上是靶核酸中的至少5个、优选为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19或20个或更多连续核苷酸的相同序列，比如任何人源RAP80序列的核酸。在靶RNA的一条长链中，大量靶位不能通过核酶接近，因为它们隐藏在二级和三级结构中(BiriW1 et al. , Eur J Biochem 245:1-16,1997)。为了克服接近靶RNA的问题，通常使用计算机生成的二级结构预测来确定极有可能是单链或将有“开放”构造的靶标(见Jaeger et al., Methods Enzymol 183 =281-306,1989) 0其他方法使用系统化途径来预测包括大量待杂交的候选寡核苷酸分子的二级结构(见Milner et al. ,Nat Biotechnol 15 :537_41，1997，以及 Patzel 和 Sczakiel，Mat Biotechnol 16 :64_8，1998)。此外，美国专利 6251588 介绍了为预测靶标核酸序列的杂交潜力而评价寡核苷酸探针序列的方法，其内容通过引用结合到本文中。本发明的方法提供了将这种方法用于选择被预测为单链的靶mRNA序列的优选片断及其可能的应用，或者将优选含有靶mRNA的约10-20个连续核苷酸的大致相同的靶mRNA 序列用于设计本发明的iRNA寡核苷酸和核酶。抑制性肽本发明所使用的术语“抑制性肽”涉及到那些能够结合到IL-6型细胞因子上并抑制其活性的肽，如上所述，亦即防止IL-6型细胞因子能够诱导JAK-STAT信号通路的激活。抑制性肽的一个例子是LIF的加聚乙二醇的变异体，如White等人所述(J. Biol. Chem, 2007，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104 :19357-19362)。细胞因子受体结合抑制剂本发明所使用的用语“细胞因子受体结合抑制剂”指任何显示出对IL-6型细胞因子的亲和力并因此能够螯合细胞因子及阻止其结合到其生理受体上的化合物。抑制性多肽优选是IL-6型细胞因子受体(所谓的诱骗受体)的可溶形式。仅就LIF而言，可以使用 LIF受体或LIF结合蛋白(LBP)的可溶性变异体，其为自然存在的可溶形式的α-LIF受体，并被发现能在关节软骨移植中有效阻止LIF对蛋白多糖代谢的影响(Bell et al.，1997， J. Rheumatol. 24 :2394)。抑制件抗体本发明中所述“抑制性抗体”理解为任何能够结合到IL-6型细胞因子或所述IL-6 型细胞因子的受体上以防止所述IL-6型细胞因子能够诱导JAK-STAT信号通路的激活的抗体。该抗体可使用本领域技术人员公知的任何方法制备。因此，多克隆抗体采用受到抑制的蛋白质通过动物免疫的方式制备。单克隆抗体采用由Kohler和Milstein等人(Nature， 1975,256:495)所述的方法制备。一旦确定了具有IL-6型细胞因子结合能力或到所述细胞因子的受体上的结合能力的抗体，就可利用确定上述抑制剂的检测(Metz，2007，如上所述)来选择那些能够抑制这种蛋白质的活性的抗体。因此，在一个更具体的实施例中，抗体是所述IL-6型细胞因子的特异性抑制性抗体，或者可阻断IL-6型细胞因子受体的抗体。LIF 的特异性抗体如美国专利 5654157、Kim et al. (J. Immunol. Meth.，156 :9-17, 1992)禾口 Alphonso et al. (J. Leukocyte Biology (Abstracts of the 28th National Meeting of the Society for Leukocyte Biology,vol. O,no. SP. 2(1991)(NY,N. E. ,p. 49) (Mabs D4. 16. 9，D25. 1. 4，D62. 3. 2)中所述。在本发明中，术语“抗体”必须被广义地解释，它包括多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体及其片段(F(ab' )2,Fab)等，只要它们能够特异性识别目标抗原，其在本发明中为IL-6型细胞因子或IL-6型细胞因子的受体。可以用于本发明的抗体的例子为多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体等，这些均为非限制性的例子。多克隆抗体原本是已用抗原免疫的动物血清中产生的抗体分子的非均相混合物。 它们还包括取自非均相混合物的单一特异性多克隆抗体，例如通过对具有单一目标抗原表位的肽进行柱层析的方式。单克隆抗体是单一目标抗原表位的特异性抗体的同系种群。这些单克隆抗体可通过已有报道的常规技术制备，例如由K0hler和Milstein[Nature，1975 ；256 :495-397] 或者 Harlow 禾口 Lane [“ Using Antibodies. A Laboratory Manual " of E. Harlow and D. Lane,Editor :Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York ； 1998 (ISBN 978-0879695439)]所描述的。嵌合抗体是通过克隆或重组来自不同动物物种的抗体而构建的单克隆抗体。在本发明的一个典型的但非限制性的构造中，嵌合抗体包括部分单克隆抗体，通常是包括抗原识别及结合位点的可变区片段(FV)，以及对应于人源抗体的其他部分，通常是包括恒定区和邻近恒定区的部分。完全人源抗体是利用人体免疫系统在转基因动物体内生产的、或通过人体免疫细胞的体外培养的方式(包括带或不带免疫佐剂以及纯或非纯抗原的遗传及常规免疫法；或者通过将抗原暴露于免疫系统的任何方式)生产的、或通过产生自人体免疫细胞的原生/ 合成库的方式生产的抗体。这些抗体可取自及选自其中人源免疫球蛋白基因已被克隆并已用靶标抗原免疫的转基因动物，例如小鼠(在本发明中，所述抗原是IL-6型细胞因子或所述IL-6型细胞因子的受体)。这些抗体可通过选择人源单链可变区片段(scFv)或出现在噬菌体显示中的抗原结合片段(Fab)并随后克隆并植入人体内而得到，或者通过本领域技术人员熟知的任何其它的制备和显示方法而得到，库由克隆两条链的可变区片段所产生， 随后进行组合/突变，以产生抗体库。人源化抗体是单克隆抗体，通过在人源抗体中克隆和移植小鼠单克隆抗体的高变互补决定区(CDR)以替换人源抗体自身的高变CDR区的方式来构建。此外，在本发明中术语“抗体”还包括具有修饰后的糖基化模式的变异体，以及糖基化或非糖基化的抗体片段，其从蛋白质中得到或通过基因重组技术获得，包括(i)通过结合肽互相结合的抗体的可变区(scFv)，(ii)连同通过半胱氨酸或通过结合肽和二硫键结合到轻链上的重链(Fd)的CHl恒定区的可变区(scFab)，(iii)新变异体如单重链，或 (iv)为使其更类似、具有更小的免疫原性(人源化)或在生物体液中更稳定而对抗体片段所做的任何修饰，在本发明中，该修饰有能力防止IL-6型细胞因子执行其功能(活性)，即诱导JAK-STAT信号通路的激活。正如本领域技术人员所了解的，抗体可以通过常规遗传工程或重组技术、抗体生产技术、从生物体液或组织中提取和纯化的技术，或通过本领域技术人员熟知的获取蛋白质和抗体的任何其他的常规技术来获得。用于制备抗体的技术的示例性但非限制性的例子是包括用于人免疫球蛋白基因的转基因动物在内的动物免疫技术，通过杂交瘤细胞制备单克隆抗体，通过抗体库进行制备，该抗体库可以是天然的、合成的或源于针对目标抗原进行免疫的生物体，这可以通过非常不同的显示方法(噬菌体显示、核糖体显示等)来选择， 随后通过基因工程技术对它们进行重新设计，并使其表达在为制备不同尺寸、组成及结构的重组抗体而设计的载体中。例如可在下述文献中找到制备和纯化抗体的主要方法的综述■ “ Handbook of Therapeutic Antibodies “ , S. Dubel. Editor =Wiley-VCH, 2007, Vol :I to III(ISBN 978-3527314539)；■“ Antibodies :Volume 1-Production and Purification" , G. Subramanian Ed. , Editor =Springer,1st Ed,2004(ISBN 978-0306482458)；■ " Antibodies VoIume 2 :Novel Technologies and Therapeutic Use ", G.Subramanian Ed. , Editor =Springer, first edition,2004(ISBN 978—0306483158)；■ " Molecular Cloning -.a Laboratory manual “ ，J. Sambrook, D. W. Russel Eds. , Publisher :Cold Spring Harbor Laboratory Press, third edition,2001 (ISBN 978-0879695774)。抑制IL-6型细胞因子活性的其他化合物具有抑制IL-6型细胞因子表达的能力的其他化合物包括适配子和spiegelmer， 其为特异性结合到由其生物活性的修饰而产生的蛋白质上的单链或双链D或L核酸。适配子和spiegelmer的长度为15至80个核苷酸，优选为20至50个核苷酸。具有IL-6型细胞因子的抑制活性的多肽具体地说，可用于本发明中的LIF(IL_6型细胞因子)的拮抗剂有-在受体结合位点处呈现出突变的LIF变异体，其显示出针对受体的减少的亲和力，或只能结合到受体的一条链上。所述突变体的例子包括〇 Hudson 等人描述的突变体(J. Biol. Chem, 1996,271 :11971-11978)，
〇专利文献W005/030803中所描述的LIF变异体，其具有一个或多个选自G^9A、 G124R和m^A的集合中的突变体，并对于LIF受体以及gpl30显示出减少的亲和力。一种LIF的高效拮抗剂是包括MH35-BD/Q29A+G124R的变异体，如i^airlie，W. D.等人所述 (J. Biol. Chem.，2004，279 :2125-2134)。〇专利W09601319描述的突变体的特征是在受体结合区中、具体地位于人源LIF 编号为25-38、150到160或161到180的位置处具有一个或多个替代体。-基于初级结构并具有结合到LIF且防止其与细胞表面的天然受体相互作用的能力的LIF受体的可溶性变异体，比如包含部分LIF受体的胞外区和gpl30配体结合域的融合蛋白质，如 Metz S.等人所述(J. Biol. Chem.，2008，283 :5985-5995)。如本说明书的开篇所述，在治疗与有害细胞增殖相关的疾病如癌症、尤其是高活性的JAK-STAT信号通路引起的癌症的治疗方面，本发明人已开启了一个新的治疗窗口，这正是本发明此处所描述的。在本发明中，“与有害细胞增殖相关的疾病”包括癌症和肿瘤的产生、发展和转移。 可以根据本发明所述的方法进行治疗的与有害细胞增殖相关疾病的例子是癌症、再狭窄、 动脉粥样硬化、血管生成疾病、纤维化、皮肤疾病和炎症性疾病。在本发明的一个具体的实施例中，与有害细胞增殖相关的疾病是癌症。术语“癌症”和“肿瘤”涉及哺乳动物的生理状况，其特征是细胞生长失常。本发明所述化合物可用于治疗乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头、颈、卵巢、前列腺、脑、 胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸和肝脏肿瘤。具体地说，可以采用本发明所述化合物治疗的肿瘤包括腺瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、 神经胶质瘤、血管内皮细胞瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、 黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。特别是， 肿瘤/癌症选自下述集合肢端黑色素瘤、光化性角化病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、 腺鳞癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、支气管腺体癌、毛细管类癌、恶性上皮肿瘤、 癌肉瘤、胆管癌、软骨肉瘤、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样癌、室管膜瘤、尤文氏肉瘤、局灶性结节增生、gastronoma、生殖系肿瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮细胞瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝细胞腺瘤、肝细胞癌、胰岛素瘤(insulinite)、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、脂肪肉瘤、淋巴细胞白血病、淋巴细胞性白血病、平滑肌肉瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、间皮瘤、粘液表皮样癌、髓细胞性白血病、神经母细胞瘤、神经上皮癌、结节性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状浆液性腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑色素瘤、疣状癌、阴道/外阴癌、VTPpoma、肾母细胞瘤。更优选地，可用本发明的化合物治疗的肿瘤/癌症包括脑肿瘤、头颈部肿瘤、大肠癌、急性髓细胞白血病、前B细胞急性淋巴细胞白血病、膀胱癌、星形细胞瘤(优选II、III、IV级星形细胞瘤)、胶质母细胞瘤(优选多形性胶质母细胞瘤)、小细胞癌、非小细胞肺癌(优选非小细胞肺癌)、转移性黑色素瘤、雄激素非依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖转移性前列腺癌，以及乳腺癌(优选乳腺导管癌或乳腺癌)。
在本发明的一个具体实施例中，癌症或癌症中出现的形成肿瘤的细胞的特点是呈现出高水平的IL-6型细胞因子。在本发明中，IL-6型细胞因子的“高水平”可以理解为其细胞因子的浓度比对照样本中出现的细胞因子的浓度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少有55%、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少 100%，至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%，或者更高。对照样本被理解为这样的样本，其具有一定浓度的IL-6型细胞因子，用作确定测试样本中所述细胞因子的相对水平的对照值。对照样本通常是取自从临床角度看具有完整的病历档案且没有疾病的患者。在所述样本中，生物标志物的浓度可以通过测定对照种群的平均浓度来确定。在确定某标记的对照浓度的过程中，必须考虑到一些样本的类型特征， 如患者的年龄、性别、身体状态等。例如，对照样本可以从一组包含至少2个、至少10个、至少100至1000个以上的相同数量的个体的组中获取，以使其具有统计学意义。可以在细胞内、在组织间隙内或在提取物内确定IL-6型细胞因子的浓度，其中细胞内蛋白质和提取物出现在组织间隙内。IL-6型细胞因子的水平可利用适用于这一目的的检测方法通过测量所述细胞因子的活性的方式，或通过使用免疫学方法测量蛋白质量的方式，或通过测量相当于IL-6细胞因子的mRNA的方式来确定。在另一个具体实施例中，所述癌症是由高活性JAK-STAT信号通路造成的，在另一个更加具体的实施例中，所述癌症是神经胶质瘤，优选是IV级神经胶质瘤。如前所述，本发明的抑制剂能够抑制肿瘤干细胞的增殖，使得其应用在能因抑制干细胞增殖而受益的疾病的治疗中尤其有效。因此，在一个优选实施例中，抑制剂通过肿瘤干细胞的自我再生来起作用。术语“动脉硬化”涉及到动脉壁的增厚和硬化。一种特定类型的动脉硬化是动脉粥样硬化，这是大部分冠状动脉疾病、主动脉瘤和下肢动脉疾病的病因，它还是脑血管疾病的病因。一个正常的动脉通常具有由单层内皮细胞形成的内在部分(内膜)。覆盖在这一层上的是所谓的中间层，其只含有平滑肌细胞。依次下来，外层是外膜。随着年龄增长，作为平滑肌细胞的迁移和扩散的结果，内膜的宽度不断呈局部增长。作为一些创伤性事件或干预措施的结果，内膜的宽度也会出现类似的增长，比如在扩张过程导致血管壁受损时就会出现这些情况。在本发明中使用的化合物可能有助于抑制血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖。因此，本发明所述的半日花烷型二萜化合物也可用于治疗动脉硬化病症。“动脉硬化病症”理解为典型的动脉粥样硬化、加速的动脉粥样硬化和任何其他动脉硬化病症，其特点是内皮细胞和/或血管平滑肌肉细胞的有害增殖，包括从糖尿病及糖尿病性肾小球硬化的血管并发症。术语“再狭窄”理解为作为由对形成冠状动脉的内皮细胞的机械损伤所引起的生长因子释放的结果而呈现出细胞过度增殖和迁移的疾病。“血管生成疾病”理解为一种呈现异常新生血管的疾病或医学病症。这些疾病或病症包括糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼、类风湿关节炎和某些癌症，如血管内皮瘤、血管瘤和卡波济氏肉瘤。内皮细胞和血管平滑肌肉细胞的增殖是新生血管的主要特点。 因此，本发明中所述的化合物可用于抑制所述增殖，并可抑制全部或部分地取决于所述新生血管的血管生成病症的发展。
术语“纤维化”涉及到器官或组织中纤维结缔组织的形成或过度发展。纤维化例如包括心内膜心肌纤维化、特发性肺间质纤维化、肺气肿、肺间质纤维化(导致慢性阻塞性肺疾病)、阴茎佩罗尼症、硬皮病、弥漫性实质肺疾病、瘢痕疙瘩、纵隔纤维化、进行性块状纤维化、增生纤维化、肿瘤纤维化、肾间质纤维化、肝纤维化、手术疤痕或烧伤。术语“皮肤病”理解为皮肤呈与任何增生性功能障碍相关的细胞增殖疾病。这些功能障碍例如包括瘢痕疙瘩、增生性烧伤疤痕、脂溢性角化病、乳头状瘤病毒感染、肌动蛋白角化和湿疹。术语“炎症性疾病”理解为因与任何增生性功能障碍相关的细胞增殖而导致的造成炎症的疾病。这些疾病例如包括增生性肾小球肾炎、红斑狼疮、硬皮病、临时性关节炎、血栓和皮肤黏膜淋巴结综合征。在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，包括为治疗与有害细胞增殖相关的疾病的根据本发明的治疗有效剂量的抑制剂以及药学上可接受的载体。有害细胞增殖相关的疾病的例子如说明书中上述所述。在本发明中，“治疗有效量”理解为达到预期效果所必须的抑制IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂用量，所述预期效果在此特定情况下是与有害细胞增殖相关疾病的治疗。一般来说，待施用的根据本发明的治疗有效剂量的抑制剂除其他因素外将取决于待治疗的个体、所述个体所患疾病的严重程度、所选择的剂型等。出于这个原因，在本发明中提到的剂量必须只考虑作为本领域技术人员的方针，本领域的技术人员必须根据前面提到的变量来调整剂量。然而，根据本发明的抑制剂可以一天一次或多次地给药，例如一天 1、2、3或4次，每日的典型总剂量在0. 1到1000mg/kg体重/天之间，优选地为10mg/kg体重/天。在本说明书中，术语“治疗”意指施用根据本发明的抑制剂，以防止、减轻或消除疾病或与所述与有害细胞增殖相关的疾病有关的一个或多个症状。“治疗”还包括预防、减轻或消除疾病的生理后遗症。在本发明中，术语“减轻”理解为所治疗的患者的状况在主观上 (患者的感觉)和客观上(测量参数)的任何改善。术语“载体、佐剂和/或运载体”涉及被施用活性成分的分子实体或物质。这种药物载体、佐剂或运载体可以是无菌液体，如水和油脂，包括石油的或动物的油脂，植物或合成来源，如花生油、大豆油、矿物油、香油等等，赋形剂，崩解剂，润湿剂或稀释剂。适用的药物运载体见 E. W. Martin 的"Remington' s Pharmaceutical Sciences"。在本发明中，术语“药学上可接受的”是指给药于人体时生理上可以容忍的、一般不会引起过敏反应或类似的不良反应如反胃、头晕等的分子实体和成分。术语“药学上可接受的”优选指由联邦或州政府监管机构批准的，或包括在美国药典或其他普遍公认的应用于动物体、特别是人体的药典中。IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂以及含有该抑制剂的药物组合物可以与其他用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的附加药物一起使用。所述附加药物可以形成相同药物组合物的一部分，或者它们也可以一种单独的组合物的形式、与包含所述IL-6 型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂的药用组合物同步地或不同步地给药。其他用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的附加药物的例子包括但不限于烷化剂类药物，例如环磷酰胺、卡莫司汀、柔红霉素、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、嘧啶亚硝脲、马法兰等；蒽环类药物，例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、戊柔比星等；紫杉烷类化合物，例如紫杉醇、多西紫杉醇等；局部异构酶类抑制剂，例如依托泊苷、 替尼泊苷、郁金香甙、伊立替康等；核苷酸类似物，例如阿扎胞苷、咪唑硫嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、呋氟尿嘧啶等； 钼基药剂，例如卡钼、顺钼、奥沙利钼等；抗肿瘤药物，例如长春新碱、亚叶酸、洛莫司汀、甲基苄胼等；激素调控剂，例如他莫昔芬、非那雄胺、5-α-还原酶抑制剂等；长春花生物碱， 例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。合适的化疗药物在诸如默克索引(第13光盘版)中有更详细的介绍。本发明的药物组合物可以通过任何合适的给药途径如口服、胃肠道(例如皮下、 腹腔、静脉注射、肌肉注射等)、直肠等给药，通常情况下采用口服途径，这是因为待治疗的疾病是慢性病。口服给药途径的药物剂型的示例包括片剂、胶囊、颗粒、溶液、悬浮液等，它们可以包含常规的辅料，比如粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂等，并能采用常规方法制备。 该药物组合物还适合于肠外给药的形式，例如合适剂型的灭菌溶液、悬浮液或冻干产品；在这种情况下，所述药物组合物还包括合适的赋形剂，比如缓冲剂、试剂等。在任何情况下，赋形剂将根据所选择的药物剂型来进行选择。在由C. Fauli i Trillo 编著的书"Tratado de Fa. rma. cia，Galenica"(第 10 版，1993年，Luzan 5，S. A. de Ediciones)中对不同的药物剂型及其制备方法进行了综述。本领域技术人员理解，当根据本发明的IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂包含核苷酸序列如反义寡核苷酸、干扰RNA(SiRNA)、催化RNA或特异性核酶、具有诱饵活性的RNA等时，本发明的药物组合物可制成用于基因治疗的组合物形式；作为非限制性的举例说明，在这种情况下本发明的药物组合物可以包含病毒或非病毒载体，包括所述核苷酸序列或包括上述序列的基因构建体。作为非限制性的举例说明，所述载体可以是病毒载体，例如基于逆转录酶病毒、腺病毒等，或者是非病毒载体，例如DNA-脂质体、DNA-聚合物、 DNA-聚合物-脂质体复合物等(见〃 Nonviral Vectors for Gene Therapy" ,edited by Huang, Hung and Wagner,Academic I^ress，1999)。所述载体可以通过常规方法直接给药于人体或动物体，也可以被用来在体外改变、转染或感染细胞，例如哺乳动物细胞，包括人类细胞，然后植入人体或动物体内，以获得理想的治疗效果。对于人体或动物体的给药，所述细胞接种到不会对所述细胞的存活产生不利影响的合适培养基中。本发明的筛选方法由本发明的作者开发并描述在本说明书中的发现不仅适用于与有害细胞增殖相关疾病的治疗或者所述疾病的诊断，而且LIF在激活JAK/STAT信号级联中的参与也可用于开发一种鉴定能够阻断/抑制由IL-6型细胞因子或与其具有同等功能的变异体所诱导的肿瘤细胞的细胞增殖的化合物的筛选方法。因此，在另一个方面，本发明涉及在体外鉴定能够阻断/抑制由IL-6型细胞因子或与其具有同等功能的变异体所诱导的肿瘤细胞的细胞增殖的化合物的方法，包括以下步骤(i)使表达IL-6型细胞因子的受体的细胞与IL-6型细胞因子和候选化合物相接触，以及
(ii)对阻断所述细胞的细胞增殖的那些化合物进行鉴定。在第一步骤中，本发明的方法包括使表达IL-6型细胞因子的受体的细胞与IL-6 型细胞因子在以任何纯度存在的候选化合物下相接触。在本发明中，“细胞”理解为表达IL-6型细胞因子的受体的任何细胞。其中IL-6 型细胞因子受体被表达且可用于本发明方法的细胞包括采自实体瘤如乳腺癌细胞、膀胱癌细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞和肺癌细胞等的细胞，以及采自液体肿瘤如白血病和淋巴瘤细胞的细胞。在一个具体实施例中，表达IL-6 型细胞因子的受体的细胞是神经胶质瘤细胞，优选是神经胶质瘤起始细胞(GIC)。IL-6 型细胞因子受体的例子可在 Auernhammer 和 Melmed，2000 (Endocrine reviews, vol. 21 (3) =313-345)中找到，比如 LIF 受体(LIFR)、抑瘤素 M 受体(OMSR)等。因此，细胞的研究对象包括较高级的真核细胞，优选哺乳动物细胞。优选的是，在本发明中使用的细胞是那些在其中IL-6型细胞因子受体被组成性表达的细胞。或者，如果发现能适当表达IL-6型细胞因子的受体的话，常规细胞系可以直接使用，或者在许可所述受体的表达的DNA构建体的在前转染之后使用。为此合适的细胞包括CHO、VERO, BHK、HeLa, COS、MDCK 293.3T3.WI38系之类的细胞。在一个优选实施例中，本发明的方法中所使用的细胞是神经胶质瘤细胞，优选是IV级神经瘤细胞。本领域技术人员可以观察到，取决于在本发明的筛选方法中使用的细胞中表达的受体的类型，必须使用相应的细胞因子。细胞因子优选选自包括有LIF、IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC的集合。使细胞与候选化合物接触可以采用本领域的技术人员所公知的任何方法进行，包括使表达IL-6型细胞因子的受体的细胞(所述细胞正在培养过程中)与IL-6型细胞因子和候选化合物在适合其相互作用的溶剂如DMSO等中直接接触。根据本发明，使细胞与候选化合物“接触”包括将候选化合物运载到其靶细胞附近、细胞的表面上或其内部的任何可能的方式。因此，在候选化合物是低分子量分子的情况下，只需将所述分子加入到培养基中就足够了。在候选化合物是高分子量分子(例如生物聚合物，如核酸或蛋白质、抗体或多肽)的情况下，有必要提供使这种分子进入细胞内部的手段。在候选分子是核酸(例如反义寡核苷酸、干扰RNA(SiRNA)、催化RNA或特异性核酶、具有诱饵活性的RNA)的情况下，可采用常规的转染方法来导入DNA构建体。在候选化合物是蛋白质的情况下，细胞可与蛋白质直接接触，并与编码蛋白质的核酸接触，其中该蛋白质偶联到一旦处于细胞内部就能允许其转录/翻译的元素上。为此，可采用前面提到的任一方法来使其进入细胞内部。或者，可以使细胞与已经用能促进蛋白质进入细胞内部的肽修饰的待研究的蛋白质变异体接触，比如来自HIV-ITAT蛋白的Tat肽、果蝇触角角突变蛋白和单纯疱疹病毒VP22蛋白的同源第三螺旋体、以及精氨酸低聚物(Lindgren， A. et al. ,2000, Trends Pharmacol. Sci, 21 :99-103 ；Schwarze, S. R. et al. , 2000, Trends Pharmacol. Sci· ,21:45-48 ；Lundberg,M et al. ,2003, Mol.Therapy 8 :143-150 ；Snyder, Ε. L. & Dowdy，S. F.，2004，Pharm. Res. 21 :389-393)。优选地，候选化合物不是孤立的，而是形成从天然来源衍生出或多或少复杂的混合物的一部分，或者形成化合物库的一部分。可根据本发明的方法检测的化合物库的例子包括但不仅限于肽库，其包括肽和含有D-氨基酸的肽类似物，或含有非肽键的肽；核酸库，包括具有硫代磷酸酯的非磷酸二酯键的核酸，或肽核酸型；抗体库；碳水化合物库；低分子量化合物、优选有机分子的库；多肽模拟物库，等等。在使用低分子量的有机化合物库的情况下，库可以预先选定，以使其包含可更容易地进入细胞内部的化合物。这样，这些化合物可以在确定的参数如大小、亲脂性、亲水性、形成氢键的能力的基础上进行选择。作为替代，候选化合物可以形成从天然来源获得的提取物的一部分。天然来源可以是从任何环境中获得的动物、植物，包括但不限于陆地、空中、海洋生物等的提取物。本发明的第二步骤包括鉴定阻断表达IL-6型细胞因子受体的细胞的细胞增殖的那些化合物。适用于检测细胞增殖是否已被阻止的方法的例子包括但不限于 确定端粒酶活性端粒酶的酶活性可采用本领域公知的任何方法来确定。例如，端粒酶活性可通过确定含有2个、3个或更多单一端粒序列的某段重复序列的延伸率来确定aeg0r0V，E. Ε. et al. ,1997, Mol.Biol. ,31 :130-136)。为了测量所述活性，可以采用细胞质提取物、核提取物、细胞裂解物或整个细胞。端粒酶活性的“增加”可理解为是指特定细胞中的端粒酶活性的绝对水平与同一个体的正常细胞相比或与没有病症的主体内的正常细胞相比增加了。 确定端粒长度确定端粒长度的方法例如已经在本领域中由Harley，C. B.等人(Nature，1990， 345 :458-460) ；Levy, Μ. Ζ.等人(J. Mol. Biol.，1992，225 :951-960) ；Lindsey, J.等人 (Mutat. Res. , 1991,256 :45-48)以及 Allsopp，R. C.等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89 :10114-10118)做了详细的描述。常规采用不内切端粒DNA的限制性内切酶来在之后分离通过其分子量获得的片段，以及通过采用用于端粒序列的特异性探针杂交的手段来检测端粒。 确定细胞增殖细胞增殖可以通过本领域的技术人员所熟知的方法确定，包括确定细胞重复时间，如Harley等人所述(Nature，1990，345 :458-460)。细胞增殖率可通过确定细胞中氚尿苷的纳入或者使用BrdU的比色法来确定。在本发明中，“与IL-6型细胞因子功能相当的变异体”被理解为这样一种蛋白质， 其氨基酸序列⑴本质上与IL-6型细胞因子的氨基酸序列同源，以及(ii)与所述IL-6型细胞因子起相同的作用。一种蛋白质与另一种特异性蛋白质的功能相似可以通过利用编码特异性蛋白质的基因表达进行干扰检测的方式确定，这种特异性蛋白质在减少表达时会降低其活性，以及随后通过表达其他蛋白质序列的方式恢复活性。这些实验利用对于该特异性蛋白序列为特异性的互补的干扰RNA序列以及包含由受或不受可诱导启动子调控的其他蛋白的特异性序列的表达载体来进行。一段氨基酸序列，当其与某段氨基酸序列具有至少70%，有益地至少75%，典型地至少80%，优选地至少85%，更为优选地至少90%，甚至更为优选地至少95%、97%、 98%或99%的等同度，则其与所述某段氨基酸序列本质上同源。两个氨基酸序列之间的等同度可用常规方法确定，例如通过本领域现有技术中已知的标准序列比对算法的方式，例如 BLAST[Altschul S. F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5 ；215(3) :403-10]。本领域技术人员都了解，在蛋白质功能的非决定性位置处引起氨基酸保守性替换的编码IL-6型细胞因子的基因的核苷酸序列中的突变是不影响其整体的总结构或功能的进化性中性突变。所述变异属于本发明的范围内。相对于IL-6型细胞因子具有插入、删除或修改一个或多个氨基酸并保留了与所述细胞因子相同功能的IL-6型细胞因子的具有同等功能的变异体也包括在本发明的范围之内。因此，本发明所用术语“同等功能的变异体”还包括任何同等功能的IL-6型细胞因子的片段。“片段”一词涉及到包含蛋白质的一部分的肽。在这种情况下，IL-6型细胞因子的同等功能的片段是一种多肽，或含有IL-6型细胞因子的一部分且与所述细胞因子具有相同功能的蛋白质。本发明诊断方法本发明的发明人已经表明，IL-6型细胞因子、更具体的说是LIF参与了 JAK-STAT 信号级联的激活，从而诱导细胞增殖过程和肿瘤干细胞(癌症干细胞)的增加。这一发现使得用于诊断与有害细胞增殖相关的疾病的诊断方法可基于确定IL-6型细胞因子的水平来开发。因此，在另一个方面，本发明涉及在体外诊断主体内的与有害细胞增殖相关的疾病的方法，或确定主体患所述与有害细胞增殖相关的疾病的倾向的方法，或确定主体内患所述与有害细胞增殖有关的疾病的阶段或严重程度的方法，或监控对主体所患的所述与有害细胞增殖有关的疾病的治疗效果的方法，其中包括对取自所述主体的生物样本中编码 IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白功能相当的变异体的表达水平进行量化，其中，编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白功能相当的变异体的表达相对于对照样本中编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白功能相当的变异体的表达的增加表示了与有害细胞增值相关的疾病，或者主体具有患与有害细胞增值相关疾病的较大倾向，或者所述主体对于所给予治疗无反应。在本发明中，诊断是指据此评价主体患有疾病的可能性。正如本领域技术人员所了解的，对于被诊断主体而言，这样的评价通常可能不会是100%正确，尽管它最好是。然而，该术语要求能够识别主体患该疾病或具有患该疾病倾向的统计学上显著的部分。本领域技术人员可以简单地使用几个公知的统计评价工具来确定某一部分是否具有统计学意义，例如确定置信区间、确定P值、学生t-检验、Marm-Whitney检验，等等。这些可详见Dowdy & Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区间为至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %。P-值优选为0. 2、 0. 1、0· 05。本发明所用术语“倾向”是指一个主体至今尚未患疾病或没有如上述或其他诊断标准所述的任何疾病症状，然而却具有在未来患该病的某种可能性。所述可能性和与有害细胞增殖相关的疾病的发病概率显著不同。优选诊断为患与有害细胞增殖相关的疾病的概率为至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% 的倾向。倾向的诊断有时可称为预后或预测主体患病的可能性。在本发明中，“对照样本”理解为用来确定本发明所使用的基因和蛋白质的表达水平的变化的参照样本。在一个实施方案中，对照值采用从一个健康个体中获得的组织样本从所提供的信号中获得。优选地，样本取自几个健康个体的同一组织及其结合，以使样本中mRNA或多肽的量反映了该人群中所述分子的平均值。编码IL-6型细胞因子的基因的表达水平的量化可以通过由所述基因的转录 (mRNA)产生的RNA进行，或者通过所述基因的互补DNA(cDNA)进行。或者，本发明的方法可包括为获得总RNA的目的而进行提取的步骤，该步骤可以通过常规技术实现(Chomczynski et al. , Anal. Biochem. , 1987,162 156 ；Chomczynski P. ,Biotechniques,1993,15 :532)。事实上，任何常规的方法都可用于本发明中，以便对由编码IL-6型细胞因子的基因所编码的mRNA或其相应的cDNA的水平进行检测和量化。作为非限制说明的方式，由所述基因编码的mRNA的水平可采用常规的方式量化，例如，包括mRNA的扩增以及所述mRNA 扩增产物的量化的方法，比如电泳和染色，或者作为替代，利用RNA印迹杂交(Northern blot)的方式以及使用目标基因的mRNA或其相应cDNA的特异性探针，其采用SL核酸、 RT-LCR、杂交、微阵列等，优选使用合适的探针和引物的集合来实时量化PCR以进行定位。 同样，与由编码IL-6型细胞因子的基因所编码的所述mRNA对应的cDNA的水平也可以采用常规技术手段进行量化；在这种情况下，本发明的方法包括通过反转录(RT)相应mRNA以合成对应cDNA、之后进行扩增和对所述cDNA的扩增产物进行量化的步骤。例如，用于量化表达水平的常规方法可见于 Sambrook et al. ,2001. "Molecular cloning :a Laboratory Manual，，, 3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Ε. , Vol. 1-3。因此，在本发明方法的一个具体实施例中，编码IL-6型细胞因子的基因的表达水平的量化包括所述基因的信使RNA (mRNA)、所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)、 所述cDNA的片段或其混合物的量化。在另一个具体实施例中，编码IL-6型细胞因子的基因的表达水平的量化通过量化的聚合酶链反应的方式进行。此外，为了将本发明的方法付诸实践，也可以量化由编码IL-6型细胞因子的所述基因，即编码IL-6、IL-11、白血病抑制因子(LIP)、抑瘤素M(OSM)、心肌营养素I(CT-I)、睫状神经营养因子(CNTF)或心肌营养素样细胞因子(CLC)的基因所编码的蛋白质的表达水平。正如本领域技术人员所了解的，可以通过任何常规方法来量化蛋白质的表达水平。作为非限制性实例，可以下述方式来量化蛋白质的水平，例如通过利用具有结合到所述蛋白质(或其中含有抗原决定簇的片段)上的能力的抗体，以及之后量化所形成的复合物。 用于这些检测的抗体可以标记或不被标记。可以使用的标记的示例包括放射性同位素、 酶、荧光团、化学发光试剂、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、颗粒、染料等。有多种已知的检测可用于本发明中，其采用无标记的抗体(一抗)和有标记的抗体(二抗)；这些技术包括蛋白质印迹、ELISA (酶联免疫吸附试验)、RIA (放射免疫测定)、竞争性EIA (竞争性酶联免疫测定)、DAS-ELISA(双抗体夹心ELISA)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用包括特异性抗体的蛋白质的生物芯片或微阵列的技术，或者基于特定形式的胶体沉淀检测，如试纸技术。其他检测和量化蛋白质的方法包括亲和层析技术、配体结合实验等。在另一个具体实施例中，蛋白质水平的量化是通过蛋白质印迹、免疫组织化学或ELISA的方式实现。在另一个优选实施例中，IL-6型细胞因子的表达水平的测定可以通过测定所述蛋白质的活性的方式进行，这是因为高表达水平通常会导致样本中所述蛋白的更高的特异性活性。用于确定IL-6型细胞因子的活性的检测在之前的本发明治疗方法部分中已有描述。
其水平可以作为有害细胞增殖的标记的IL-6型细胞因子在本说明书中已有描述，其适用本发明的方法。同样，本发明的诊断方法可应用于任何以上定义的与有害细胞增殖相关的疾病。在一个优选实施例中，与有害细胞增殖相关的疾病是癌症，具体地说是具有高水平的IL-6型细胞因子或高活性的JAK-STAT信号通路的癌症。将本发明的方法付诸实践包括从待研究的主体中获取生物样本。所述样本的非限制性示例包括不同类型的生物体液，如血液、血清、血浆、脑脊液、腹腔液、粪便、尿液和唾液，以及组织样本。如同组织样本一样，生物体液样本可以通过任何常规方法获取；举例来说，所述组织样本可以是通过外科切除手术获得的活检样本。在另一个方面，本发明涉及使用包括试剂的试剂盒来对编码IL-6型细胞因子的基因或用所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质具有同等功能的变异体的表达水平进行量化，用于诊断主体内的癌症，或者确定主体患所述癌症的倾向，或者确定主体内所述癌症的阶段或严重程度，或者监控对患有所述癌症的主体所进行的治疗的效果，其中，如果试剂检测出所述基因或所述蛋白质或具有同等功能的变异体的表达相对于对照样本增加了，则所述主体可能患有与有害细胞增殖相关的疾病，或者呈现出患有与有害细胞增殖相关的疾病的较大倾向，或者呈现出所述疾病的较严重程度，或者所进行的治疗无效。针对本发明的其他创新性方面及具体实施例已经描述和说明了用于定义试剂盒应用中所使用的所有术语和表述，它们也适用于这里所介绍的试剂盒的应用。ffl^i^if^ffen^^nr^nr^ffl^^ IL-6 mmm^ffm^m^本发明的发明人表明，属于IL-6族的细胞因子、特别是LIF的抑制剂造成了对肿瘤细胞增殖的抑制。还观察到有些肿瘤具有非常高水平的所述细胞因子，因此提出，基于使用IL-6抑制剂的疗法对于治疗具有高水平IL-6型细胞因子的患者来说特别有利。因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于在体外为患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者设计定制治疗的方法，包括(a)对所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平进行量化，以及(b)将所述表达水平与对照水平进行比较，其中如果所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平大于对照值，则为患者供给IL-6型细胞因子抑制剂。在另一个方面，本发明涉及一种用于在体外对患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者进行选择以便用IL-6型细胞因子的抑制剂进行治疗的方法，包括(a)对所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平进行量化，以及(b)将所述表达水平与对照水平进行比较，其中如果所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平大于对照值，则患者被选择以接受IL-6型细胞因子抑制剂的治疗。在这两个方面，一个优选实施例是，与有害细胞增殖相关的疾病涉及有害的干细胞增殖。在一个优选实施例中，IL-6型细胞因子的抑制剂选自包括SiRNA、反义寡核苷酸、 特异性核酶、抗体和多肽的集合。抑制剂优选为抗体，更优选地为所述IL-6型细胞因子的特异性抑制抗体，或阻断IL-6型细胞因子受体的抗体。可作为用于选择患者或者用于设计定制疗法的标记物的IL-6型细胞因子前已详细述及，其选自LIF、IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC。呈现出有害细胞增殖的疾病前已述及。在一个优选实施例中，所述呈现出有害细胞增殖的疾病是癌症。更为优选的是，所述癌症是由JAK-STAT信号通路的高活性造成的。在一个优选实施例中，所述癌症是下列之一神经胶质瘤、前-B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、大肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。甚至更为优选的， 所述胶质瘤是IV级神经胶质瘤。本发明的预后方法在另一方面，本发明涉及一种用于在体外对患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者的平均期望寿命进行预测的预后方法。这种方法基于这样的观察，即例如对于神经胶质瘤来说，表现出较高LIF表达水平的患者的平均期望寿命相对于对照组患者减少(图12)。所述方法是基于a)对所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平进行量化，以及b)将所述表达水平与对照水平进行比较，其中如果所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平大于患有同样疾病的对照患者的值，则所述患者的期望寿命很可能比对照组短。在一个更为具体的方面，出于预后的目的，即预测患有所述疾病的个体的平均期望寿命，可以测量IL-6型细胞因子的浓度。为此，将肿瘤患者的IL-6型细胞因子的浓度与相同IL-6型细胞因子的参考浓度相比较。对照组患者一般由备有完好病历并患有同一种疾病的患者组成。例如，对照样本可以从一组包含至少2个、至少10个、至少100至1000 个以上的相同数量的个体的组中获取，以使患有所述疾病的患者群体具有统计学意义。对照组可以由一个或多个下述个体组成a)患有所述疾病的所有患者；b)患有所述疾病但未呈现出明显上调水平的IL-6型细胞因子的所有患者；c)患有所述疾病且呈现出明显下调水平的IL-6型细胞因子的所有患者。可以在细胞内、在组织间隙内或在提取物内确定IL-6型细胞因子的浓度，其中细胞内蛋白质和提取物出现在组织间隙内。IL-6型细胞因子的水平可采用适合这一目的的检测通过测量所述细胞因子的活性的方式，或者使用免疫学方法通过测量蛋白质的量的方式，或通过测量与IL-6细胞因子相应的mRNA的方式来确定。在这方面，一个优选实施例是与有害细胞增殖相关的疾病。在一个更具体的实施例中，所述与有害细胞增殖相关的疾病是癌症。更为优选的是，该类癌症与所述癌症患者的子集中的IL-6型细胞因子的异常高水平有关。在一个更为具体的实施例中，所述癌症是下列之一白血病、胶质瘤、大肠癌、膀胱癌、乳癌。在一个更加具体的实施例中，白血病为前-B细胞急性淋巴细胞白血病或急性髓细胞性白血病，而乳癌为乳腺导管癌或乳腺癌。能够为预后目的而用作测试患者的标记物的IL-6型细胞因子前已详细述及，其选自LIF、IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-UCNTF和CLC0统计方法将允许基于IL-6型细胞因子的水平来预测患者的平均期望寿命。下面通过实施例来对本发明作进一步说明，但所述实施例仅是说明性的而非限制性的。实施例11.材料和方法1. 1细胞系和原代细胞培养
U373MG和A172细胞由J. Rich和D.Bigner赠送，并在含有10%胎牛血清(PBS) 的DMEM中培养。肿瘤细胞的原代培养(PCTC)和GBM神经球的产生如文献Bruna et al.， (2007)Cancer Cell 11,147-160 禾口 Gunther et al.，(2008)Oncogene. May 1 ；27(20) 观97-909所述。简单地说，肿瘤样本在外科切除手术后的30分钟内进行处理。人类神经胶质瘤样本的碎片后用200U/ml胶原酶I (Sigma公司)和500U/ml DNA脱氧核糖核酸酶 I (Sigma公司)在PBS中在37°C下消化2小时，期间持续剧烈搅拌。单个细胞的悬液通过 70 μ m的细胞过滤器(BD Falcon公司)过滤，并用PBS冲洗。最后使细胞再悬浮，并随后在含有10% PBS的DMEM中培养(用于PCTC培养)，或者对于GBM神经球来说在神经球培养基中培养。人类正常神经母细胞的神经球由志愿者堕胎后获取的人类胚胎大脑皮层组织(怀孕12-16周后)中产生。对样本进行处理，并按照文献Poltavtseva et al. (2002) Brain Res Dev Brain Res 134，149-154所述培养。神经球培养基包括neurobasal培养基 (Gibco公司)辅以B27 (Gibco公司)、L-谷氨酰胺(Gibco公司)、青霉素/链霉素和生长因子(20ng/mL 的 EGF 和 20ng/mL 的 FGF-2，Peprotech 公司)。人类神经胶质瘤和人类胚胎组织的样本从瓦尔德希伯伦医院中得到。临床方案经瓦尔德希伯伦医院的伦理委员会(CEIC)批准，并获得了所有主体的许可。1. 2质粒和试剂采用U373MG的染色体组DNA来扩增克隆到pGL2_碱基荧光素酶载体内的人源LIF启动子的-634/+32区域。删除构建体(167/+32)和(-73/+32)通过消化构建体(-634/+3 的方式产生。两个点突变被引入构建体(467/+3 的位点_183bp 和-184bp，以中断Smad结合元素(SBE公司)并生成构建体(-267/+32)mutSBE。在指定的浓度下使用 TGF β 1、TGF β 2、TGF β 3 (R & D Systems 公司)，TR β I 抑制剂(SB431542, Tocris公司)，LIF(Chemicon公司)，LIF的中和抗体(R&D公司)，JAK抑制剂(四环吡啶 6 (P6)，Calbiochem 公司)，针对 Smad2、Smad3 和 Smad4 的 SMART siRNA 的装配体 (Dharmacon 公司)，以及对照 siRNAsiGlo (Dharmacon 公司)。采用针对 p_Smad2、Smad2、 P-STAT3 (p-Tyr705)和总 STAT3(Cell Signalling 公司)的特异性抗体以及针对 Smad2、 Smad3 和 Smad4 的特异性抗体(Hata et al.，(2000)Cell 200,229-240)用于蛋白质印迹。1. 3免疫细胞化学、ELISA和染饩质免疫共沉淀反应神经球免疫细胞化学与分化型神经球依照文献Gestiwind et al.，2001采用下列抗体进行处理抗-nestin (Chemicon 公司)，抗-GFAP (Dako 公司)，抗-TuJl (Chemicon 公司)，抗-04 (Chemicon 公司)，抗 _Sox2 (Chemicon 公司)，抗-α -微管蛋白(Sigma 公司)。 细胞核用4'，6_ 二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)复染。对于分泌到培养基中的LIF蛋白的水平的量化测定，使用人源LIFELISA试剂盒(R & D Systems公司)，遵照制造商的说明。U373MG细胞或之前从血清获取的GBM神经球在所示治疗48小时后收集上清液。悬浮的细胞被丢弃，使用Amicon Ultra-4 PLCC Ultracel-PL 5kDa (MiIlipore公司)对5ml上清液进行浓缩，终体积为200 μ L。染色质免疫共沉淀反应依照上述Brima等人的文献进行。LIF启动子的近端和远端的引物系列分别覆盖(-410/-165)和(-4534/-4293)区域。1.4自我更新检测神经球的自我更新通过将同样数量的细胞以很低的密度接种到一个96孔板的孔中进行评价。在没有生长因子存在的条件下用所示化合物处理细胞，对7天后在培养基中形成的新神经球的总数进行计数(Lee et al. (2008)Cancer Cell 13,69-80 ；Reynolds & Weiss, (1996)Dev Biol 175,1-13 ；Seaberg & van der Kooy，(2002)J Neurosci 22， 1784-1793)。1. 5实时PCR量化使用Applied Biosystems公司的Taqman探针进行qRT-PCR操作，按照制造商的建议进行。反应在ABI 7000序列检测仪(Perkin Elmer公司)中进行，并且结果通过DDCt 法以相对于对照样本或第一量化样本所计算的倍数变化来表示。18S或β-肌动蛋白的核糖体单位被用作内部是归一化对照。1. 6荧光素酶检测以LIF启动子的不同指示构建体和海肾萤光素酶的质粒PRL-TK(ftOmega公司) 作为归一化对照，采用脂质体2000(InvitrOgen公司)对A172细胞进行瞬时转染。1.7颅内肿瘤检测将指示量的细胞定向地接种于7周龄Balbc nu/nu雌性小鼠(Charles River实验室)的大脑右半球(前1毫米，前囟门侧1.8毫米，3.0毫米脑实质)的纹状体中。当它们呈现出神经症状或体重明显下降时，处死小鼠。在与AVANCE 400系统(Bruker公司)的接口中在9. 4T垂直磁铁下采用磁共振成像(MRI)进行研究。在甲苯噻嗪/氯胺酮的麻醉作用下，为小鼠静脉注射MRI造影剂即钆二乙烯三胺五乙酸，剂量为0.25mmol Gd/kg重，并将小鼠置于18射频线圈中(内径为35mm)。在定位器沿三个正交轴拍下图像后，就获得了小鼠的整个大脑的图像。1. 8统计分析使用斯皮尔曼相关检验来分析LIF和TGF β 2，Musashi-1、Sox2和Nestin之间的关系。在附图中的数据以平均值士s. d.表示。实施例1 :TGFi3诱导取自患者的GIC的自我更新为了研究TGFii对GIC(神经胶质瘤起始细胞)的自我更新能力的影响，从手术切除的人类GBM(多形性胶质母细胞瘤)的样本中获取细胞。来自相同的肿瘤样本，一方面在存在血清的条件下产生肿瘤细胞的原代培养物(PCTC)，与此同时，在存在EGF和FGF的条件下在无血清的培养基中培养肿瘤细胞。如文献feilliet al. , (2004) Cancer Res 64， 7011-7021 ；上述 Gunther 等人的文献；Lee et al. , (2006) Cancer Cell 9,391-403 ；Singh et al. (2003) Cancer Res 63，5821-58 所描述的，在补充有EGF和FGF的无血清培养基中培养的细胞可以快速生长为非贴壁的、多细胞的细胞球(神经球)，图1A。产生于肿瘤样本的神经球表达出高水平的神经母细胞的细胞标记Musashi-1，Sox2和Nestin (图IB)，并且在有血清存在的条件下培养时会经历获得GFAP (星形胶质细胞标记)、Tuj-I (神经元标记)以及04(少突胶质细胞标记)表达的多向分化(图幻。此外，从肿瘤中产生的神经球与PCTC相比极具致癌性。神经球和PCTC的细胞被原位植入到免疫抑制小鼠的大脑中。肿瘤的生长通过磁共振成像(MRI)进行评价，并且监测小鼠的体重。接种30-60天后神经球细胞产生肿瘤，这引起体重剧烈下降，而在相同的时间间隔内在所有情况下肿瘤中的PCTC 都没有生长(图1C)。因此，产生自人类GBM样本的神经球表达出神经母细胞的细胞标记， 呈现多向分化潜能，并且极易致癌。所有这些特点表明，从取自患者的GBM中获得的神经球
31富含GIC。根据详尽描述的协议基于GIC产生神经球的能力来确定TGF β对GIC的自我更新能力的影响(见文献 Reynolds & Weiss, 1996,Dev Biol. 175 1-13 和 kaberg & van der Kooy, 2002, J Neurosci 22:1784-1793)。取自患者的神经球被分离成单个细胞，用TGF β 处理或在无生长因子的条件下保持不治疗7天，并且对新形成的神经球和细胞总数进行计数。根据这一协议来对TGF β对来自三个不同患者的GIC的自我更新能力的影响进行评价。 采用TGFii治疗显著增加了神经球的数目，并且增加了细胞总数(图1D，1E，1F)。当在加入 TGF β的同时加入TGF β I受体抑制剂(Τ β RI)时，这些影响被阻断。隔离的T β RI抑制剂没有显著的影响(图1D，1E，1F)。这些结果表明，TGFi3途径增加了 GIC的自我更新。实施例2 =TGF β诱导人类GBM细胞中的LIF表达考察造成对TGFii对GIC的影响占主要责任的分子机制。对针对参与GIC的自我更新调控的GBM细胞中的TGFii的基因反应进行了研究。在以前的工作(Brima等人， 2007)中，对用TGFii和/或TiiRI抑制剂治疗的U373MG神经胶质瘤细胞系进行了转录分析，LIF处于针对依赖于T β RI活性的U373MG中的TGF β的作出反应的63个基因中。 LIF-LIFR/gpl30-JAK-STAT信号通路已被牵涉在干细胞、即胚胎干细胞(Niwaet al.，1998， Genes Dev, 12 :2048-2060 ；Williams et al.，1988，Nature, 336 :684-687)和神经母细胞 (Bauer & Paterson，2006，J Neurosci，26 :12089-12099 ；Molne et al. ,2000，J Neurosci Res, 59 :301-311 ；Wright et al.，2003，J. Neurochem，86 :179-195)的自我更新中，并且假设LIF可调控TGFii对GIC的影响。首先要确定，在来自患者的肿瘤细胞中是否可以观察到由TGFii介导的LIF转录物的诱导。一个来自11个不同人类GBM的PCTC组用TGFii处理3小时，并测定LIF的mRNA的水平。对所有PCTC中的TGFi^诱导的LIF进行分析(图 3A)。这些结果表明，TGFii诱导LIF是发生在大多数人类GBM中的普遍现象。此外，TGF3 能够诱导来自患者的神经球中的LIF转录(图:3B)，而且这种影响取决于T β RI的活性，这是因为TGFii对LIF的诱导作用在有T β RI抑制剂存在的条件下被阻断(图3C)。TGFii家族(TGF β 1，TGF β 2，TGF β 3)的三个成员能够在患者的神经球中诱导LIF (图3D)，如预期的那样，当它在神经球介导条件下通过ELISA法检测时，由TGF β诱导的LIF转录导致LIF 蛋白质分泌增加(图3Ε)。实施例3 =TGF β通过结合到LIF启动子的激活型Smad复合物诱导LIF的表达为了研究TGFii对LIF的转录调控，将人源LIF启动子克隆在pGL2_碱基报告构建体中。TGFii能够反式激活包含U373MG细胞的LIF启动子的-634/+32和-276/+32区的报告构建体。LIF启动子的-73/+32片段失去对TGFβ的转录反应，表明TGFi^的反应元素包含在-276/-73区中(图4A，4B)。这个区域包含靠近SPl结合位点的单一 Smad结合元素 (SBE, 5 ‘ GTCT-3 ‘)，图4A。SBE发生突变，并观察到对TGF β的反应消除(图4Β)，表明激活型Smad复合物结合到LIF启动子的近端SBE，以诱导转录。进行染色质免疫沉淀(ChIP) 检测，观察到内源性Smad2结合到LIF启动子的近端区域，而不是结合到用TGFii处理过的细胞的转录起始位点上游的远端区域41Λ(图4C)。为了最终表明Smad参与TGFi^对LIF 表达的诱导，Smad2、Smad3、Smad2和3以及Smad4利用干扰RNA而沉默。当Smad2和Smad3 或Smad4下降时，TGF β对LIF的诱导下降，表明激活型Smad复合物在LIF对TGF β的转录反应中是需要的(图4D)。Smad2和Smad3在这个过程中是多余的，因为各Smad的单独沉默对TGF β诱导的LIF水平没有明显影响(图4D)。正如预期的那样，来自患者的神经球的TGF β对LIF的诱导还取决于Smad。人类GBM中Smad4的沉默消除了 LIF对TGF β的反应(图4Ε)。实施例4 =TGF β通过来自患者的神经球中的LIF诱导来诱导JK-STAT途径为了区分LIF信号通路是否对GBM神经球有效，用重组LIF处理神经球，并测定 LIF受体复合物STAT3的下游底物的磷酸化水平。重组LIF诱导STAT3快速磷酸化，表明来自患者的神经球表达了一种功能性LIP受体复合物(图5Α)。此外，P-STAT3的诱导在药理JAK特异性的四环吡啶6 (Ρ6)存在的条件下被阻止(Pedranzini et al.，2006，Cancer Res,66 :9714-9721 ；Thompsonet al.，2002，Bioorg MedChem Lett，12 1219-1223)，图 5B。 有趣的是，TGF β诱导GBM神经球中STAT3的磷酸化，而Τβ RI抑制剂阻止了这种影响(图 5C)。对LIF是否介导TGF β对P-STAT3的诱导进行评定。为此，采用LIF的中和抗体来特异性阻断分泌型LIF对用TGFii处理的细胞的影响。LIF的中和抗体的存在降低了 TGFii 对p-STAT3的诱导。此外，在用TGFβ处理的细胞中的p-STAT3水平通过Ρ6的处理被抑制(图5D)。这些结果表明，TGFii能够通过诱导LIF的分泌来激活来自患者的神经球中的 JAK-STAT信号通路，其中LIF通过自分泌/旁分泌环路来起作用。实施例5 =LIF介导TGF^对GIC的自我更新的诱导作用对LIF以及JAK-STAT信号通路是否会介导TGF β对GIC自我更新的增加进行评价。为此，采用LIF和Ρ6的中和抗体来特异性阻断分泌型LIF对用TGFii处理的细胞的影响。神经球被分离成单个细胞，并用TGFii、重组LIF、抗LIF的抗体和/或Ρ6处理。对新形成的神经球和细胞总数进行计数。重组LIF增加了新形成的神经球以及细胞总数的数量， 表明LIF诱导了 GIC的自我更新(图6A、6B、6C)。用LIF的中和抗体进行处理降低了 TGF3 对GIC的自我更新的诱导作用。此外，P6抑制了 TGFii对GIC自我更新的影响，表明TGF β 对自我更新的影响取决于JAK的活性(图6A、6B、6C)。整体看来，这些数据表明，TGF β通过LIF-JAK-STAT通路诱导来自患者的GIC的自我更新能力。实施例6 =TGF β通过LIF阻止GIC的分化来自在没有生长因子的条件下生长的GBM且接种于聚-L-赖氨酸涂层板中的神经球趋于分化，失去神经母细胞标记MUsashi-l、S0X2和Nestin的表达，并依附于培养板。对 TGF β和LIF对此分化过程的影响进行评价。神经球在TGF β或LIF存在而无EGF或FGF 存在的条件下培养7天，随后的处理用于免疫组织化学染色和qRT-PCR检测，以确定神经母细胞标记Musashi-1、Sox2和Nestin的水平。用TGF β或LIF处理的神经球在形态上与对照细胞不同，即它们更少地依附于培养板，且保持球形结构。此外，用TGFii或LIF处理的细胞保持MUsashi-l、SoX2和Nestin的表达，用免疫检测手段进行检测(图7A)，并通过 qRT-PCR的方式量化(图7B)。这表明，TGF β和LIF是不仅能调控GIC的自我更新，而且会参与阻止GIC分化的因素。实施例7 =TGF β和LIF对人类正常神经母细胞的影响这些数据表明，TGFii和LIF可调控GIC的自我更新和分化。对这种影响是唯独对肿瘤细胞起作用还是对正常的神经母细胞也有作用进行评价。要回答这个问题，需要从人类胎儿大脑皮质样本中获取神经母细胞(受孕12至16周后)。正如先前已描述的 (Carpenter et al.，1999，Exp Neurol，158 :265-278 ；Poltavtseva et al.，2002，BrainRes Dev Brain Res, 134 :149-154 ；Wright et al.，2003，J Neurochem, 86 :179-195)，当他们在添加有EGF和FGF的无血清培养基中生长时，人类神经母细胞生成神经球，并且这些神经球与GBM神经球类似地表达Musashi-I、Sox2和Nestin (图8A)。首先，确定TGF^是否诱导正常的人类神经母细胞中的LIF。相对于GBM神经球，正常神经球不会诱导LIF对 TGFii 1、TGFii 2或TGFii 3作出反应(图8B)。此外，TGF^不诱导从小鼠胚胎或从成年小鼠的脑室下区获得的小鼠神经母细胞中的LIF(数据未显示)。这表明，TGFii对LIF的诱导作用唯独针对GBM神经球。正如预期的那样，由于TGFii没有诱导LIF，TGF^没有提高正常神经母细胞的自我更新能力，而神经母细胞神经球的数量和大小并没有通过TGF β处理而增加。事实上，用TGFii处理的神经球较小，并且细胞总数也由于TGFii的存在而减少(图8C，8D)。另一方面，根据以前的文章的描述(Bauer & Patterson, 2006 ；Wright et al.，2003)，LIF增加了新形成的神经球的数量和大小以及细胞总数(图8C，8D)。因此，LIF 对GBM和正常神经球内的自我更新具有同样的作用。相反，由于TGFii不能诱导正常神经母细胞中的LIF，TGF^对正常和肿瘤神经球的自我更新能力的影响是不同的。实施例8 =LIF在人类神经胶质瘤中的表达与TGF β 2和神经母细胞标记相关为了评价LIF是否在人类神经胶质瘤中得以表达，对一个具有39神经胶质瘤的培养平板中的LIF水平进行了分析。据观察，LIF的表达水平为17，而39神经胶质瘤高度表达水平为4-6(图9Α)，这表明大部分的人类神经胶质瘤表达LIF。由于LIF是由TGF3诱导的，并且在以前的研究工作中发现TGFii 2是在神经胶质瘤中观察到高TGFii活性的原因(Bruna et al.，2007，见上述内容)，因此可以评价TGF β 2是否参与了 LIF的表达。事实上，LIF的水平与神经胶质瘤平板内的TGFii 2有关，这额外地佐证了这一事实TGFi3 2 是人类神经胶质瘤中的LIF诱导作用形成的原因(图9A，B)。如果LIF促进GIC的自我更新，LIF高水平表达的肿瘤应富含这种类型的细胞群。为了验证这一假说，将LIF的水平与 GIC/神经母细胞标记的表达进行比较。LIF的水平与Musashi-I和Nestin的表达有关，但是与Sox2无关(图9A，B)，这表明LIF会激发GLC的自我更新，并增加了存在于肿块中的 GIC 群。实施例9 神经胶质瘤或胶质母细胞瘤的患者有较短的总期望寿命在所有神经胶质瘤患者的一个子集中，将LIF的水平上调>2倍。在一段设定的时间后，这些患者的存活率与对照组患者相比显著降低。例如，与所有神经胶质瘤患者相比， 1000天后的存活率降低到约50%，与LIF的水平不上调> 2倍的神经胶质瘤患者相比，其降低到约35% (图10)。数据从用于国立癌症研究所的分子脑肿瘤数据(伦勃朗)程序的库中获得。在所有胶质母细胞瘤患者的的一个子集中，将LIF的水平上调> 9倍。在一段设定的时间后，这些患者的生存概率与对照组患者相比显著降低。例如，与所有胶质母细胞瘤患者相比，500天后的存活率减少到约50%。数据从用于国立癌症研究所的分子脑肿瘤数据(伦勃朗)程序的库中获得。实施例10 =LIF的mRNA水平在不同类型的肿瘤都异常高某些类型肿瘤的一些患者的LIF水平异常高，如异常高的LIF mRNA水平所示(图 12)。数据来自 GeneSapiens 生物信息学团队(www. genesapiens. org)。这表明，LIF可能会在不同类型的肿瘤的发展中提供选择性优势。在> 10个接受测试的患者中，其LIF mRNA水平大于误差范围的肿瘤类型为前-B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、神经胶质瘤、肺腺癌、大肠癌、膀胱癌乳腺导管癌和乳腺癌。 在这些LIF的表达水平高的肿瘤患者中，LIF可能通过癌症干细胞的调控成为致癌因素。因此，阻断LIF对这类肿瘤可能是有益的，并且LIF也可以在这些患者中作为诊断和/或预后的因素。
权利要求
1.一种用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的IL-6型细胞因子的表达和/或活性的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于所述抑制剂通过抑制肿瘤干细胞的自我再生来起作用。
3.根据权利要求1或2所述的抑制剂，其特征在于所述抑制剂选自包括siRNA、反义寡核苷酸、特异性核酶、抗体、多肽和细胞因子受体结合抑制剂的集合。
4.根据权利要求3所述的抑制剂，其特征在于所述抗体为所述IL-6型细胞因子的特异性抑制抗体，或阻断IL-6型细胞因子受体的抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抑制剂，其特征在于所述IL-6型细胞因子选自LIF、IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC0
6.根据权利要求5所述的抑制剂，其特征在于所述IL-6型细胞因子是LIF。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抑制剂，其特征在于呈现出有害细胞增殖的所述疾病是癌症。
8.根据权利要求7所述的抑制剂，其特征在于所述癌症的特征是呈现出高水平的 IL-6型细胞因子。
9.根据权利要求7所述的抑制剂，其特征在于所述癌症是由JAK-STAT信号通路的高活性造成的。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的抑制剂，其特征在于所述癌症是下列之一 神经胶质瘤、前-B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、大肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。
11.根据权利要求10所述的抑制剂，其特征在于所述神经胶质瘤为IV级神经胶质瘤。
12.—种药物组合物，包括治疗有效剂量的根据权利要求1至11中任一项所述的抑制剂和药学上可接受的载体。
13.一种用于在体外上鉴定能够阻断/抑制由IL-6型细胞因子或其功能相当的变异体所诱导的肿瘤细胞的细胞增殖的化合物的方法，包括步骤(i)使表达IL-6型细胞因子的受体的细胞与IL-6型细胞因子及候选化合物相接触，以及( )对阻断所述细胞的细胞增殖的那些化合物进行鉴定。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述表达IL-6型细胞因子的受体的细胞是神经胶质瘤细胞，优选为神经胶质瘤起始细胞(GIC)。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其特征在于所述IL-6型细胞因子选自LIF、 IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述IL-6型细胞因子是LIF。
17.在体外对主体中与有害细胞增殖有关的疾病进行诊断、或者对主体罹患所述与有害细胞增殖有关的疾病的倾向进行判断、或者对主体罹患所述与有害细胞增殖有关的疾病的阶段或严重程度进行判断、或者对患有所述与有害细胞增殖有关的疾病的主体进行治疗的效果进行监控的方法，包括对取自所述主体的生物样本中的编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质功能相当的变异体的表达水平进行量化，其中，相对于对照样本中的编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质功能相当的变异体的表达，所述编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质功能相当的变异体的表达的增加表示与有害细胞增值相关的疾病，或主体具有较大患与有害细胞增值相关的疾病的倾向，或所述主体对于所给予的治疗无反应，
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于所述IL-6型细胞因子选自LIF、IL-6、 IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述IL-6型细胞因子是LIF。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其特征在于所述与有害细胞增殖相关的疾病是癌症。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述癌症的特征是呈现出高水平的 IL-6型细胞因子。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述癌症是由JAK-STAT信号通路的活性高造成的。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其特征在于所述的癌症是下列之一神经胶质瘤、前-B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、大肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于所述神经胶质瘤为IV级神经胶质瘤。
25.根据权利要求17至M中任一项所述的方法，其特征在于编码IL-6型细胞因子的基因的表达水平的量化包括对所述基因的信使RNA(mRNA)、所述mRNA的片段、所述基因的互补DNA(cDNA)、所述cDNA的片段或其混合物进行量化。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于编码IL-6型细胞因子的基因的表达水平的量化通过量化聚合酶链反应(PCR)的方式进行。
27.根据权利要求17至M中任一项所述的方法，其特征在于蛋白质水平的量化通过蛋白质印迹、免疫组织化学法或酶联免疫吸附测定法进行。
28.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其特征在于蛋白质水平的量化通过测定所述蛋白质的活性来进行。
29.—种试剂盒的应用，所述试剂盒包括试剂，用于量化编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质具有同等功能的变异体的表达水平以诊断主体中的癌症或判定主体患所述癌症的倾向或判断主体内所述癌症的阶段或严重程度或监控对于主体所患癌症进行的治疗的效果，其中，当试剂检测出所述基因或所述蛋白质或具有同等功能的变异体的表达相对于对照样本增加了，则所述主体患有与有害细胞增殖相关的疾病，或者呈现出所述与有害细胞增殖相关的疾病的较大患病倾向，或者患有所述疾病的程度严重，或者所进行的治疗无效。
30.根据权利要求33所述的应用，其特征在于所述与有害细胞增殖相关的疾病是癌症。
31.根据权利要求34所述的应用，其特征在于所述癌症的特征是呈现出高水平的 IL-6型细胞因子。
32.根据权利要求35所述的应用，其特征在于所述癌症是由JAK-STAT信号通路的高活性造成的。
33.根据权利要求33或36所述的应用，其特征在于所述癌症是下列之一神经胶质瘤、前-B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、大肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。
34.根据权利要求37所述的应用，其特征在于所述神经胶质瘤是IV级神经胶质瘤。
35.根据权利要求33至37中任一项所述的应用，其特征在于所述IL-6型细胞因子选自LIF、IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC。
36.根据权利要求39所述的应用，其特征在于所述IL-6型细胞因子是LIF。
37.一种在体外设计针对患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者的定制治疗的方法， 包括(a)对所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平进行量化，以及(b)将所述表达水平与对照水平进行比较，其中当所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平大于对照值时，则为所述患者供给IL-6型细胞因子抑制剂。
38.一种在体外对患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者进行选择以使用IL-6型细胞因子抑制剂进行治疗的方法，包括；(a)对所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平进行量化，以及(b)将所述表达水平与对照水平进行比较，其中当所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平大于对照值时，则所述患者被选择接受用IL-6型细胞因子抑制剂进行的治疗。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其特征在于所述抑制剂通过抑制肿瘤干细胞的自我再生来起作用。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其特征在于所述抑制剂选自包括 siRNA、反义寡核苷酸、特异性核酶、抗体、多肽和细胞因子受体结合抑制剂的集合。
41.根据权利要求40的所述方法，其特征在于所述抗体为所述IL-6型细胞因子的特异性抑制抗体，或阻断IL-6型细胞因子受体的抗体。
42.根据权利要求37至41中任一项所述的方法，其特征在于所述IL-6型细胞因子选自LIF、IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC。
43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于所述IL-6型细胞因子是LIF。
44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其特征在于呈现出有害细胞增殖的疾病是癌症。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于所述癌症是由JAK-STAT信号通路的高活性造成的。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其特征在于所述癌症是下列之一神经胶质瘤、前-B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、大肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于所述神经胶质瘤是IV级神经胶质瘤。
48.一种在体外对患有与有害细胞增殖相关的疾病的主体的期望寿命进行预测的方法，包括根据权利要求25至四中任一项所述地对取自主体的生物样本中的编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质功能相当的变异体的表达水平进行量化，其中，与对照样本中的编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质功能相当的变异体的表达相比，编码IL-6型细胞因子的基因或被所述基因编码的蛋白质或与所述蛋白质功能相当的变异体的表达的增加表示了期望寿命的减少。
49.根据权利要求48所述的应用，其特征在于所述与有害细胞增殖相关的疾病是癌症。
50.根据权利要求49所述的应用，其特征在于所述癌症的特征是在病人的一个子集中呈现出异常高水平的IL-6型细胞因子。
51.根据权利要求50所述的应用，其特征在于所述癌症是下列之一神经胶质瘤、 前-B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、大肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。
52.根据权利要求51所述的应用，其特征在于所述神经胶质瘤是胶质母细胞瘤。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的应用，其特征在于所述IL-6型细胞因子选自LIF、IL-6、IL-11、抑瘤素M、心肌营养素-1、CNTF和CLC。
54.根据权利要求53所述的应用，其特征在于所述IL-6型细胞因子是LIF。
55.一种在体外对患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者的所述细胞因子的水平进行检测的方法，包括(a)对所述患者中的IL-6型细胞因子的表达水平进行量化，以及(b)将所述表达水平与患有同一种疾病的患者的对照水平进行比较，其中确定所述患者的IL-6型细胞因子的表达水平是否明显大于对照值。
全文摘要
本发明基于下述研究，即LIF能够激活癌症、尤其是神经胶质瘤中的肿瘤干细胞的自我更新，这表明可采用对LIF、通常是IL-6型细胞因子的抑制来作为治疗与有害细胞增殖相关的疾病的治疗成分。本发明还涉及一种能够阻断/抑制干细胞增殖的化合物的鉴定方法，以及在体外对主体罹患与有害细胞增殖相关的疾病进行诊断，或对主体罹患与有害细胞增殖相关的疾病的倾向进行判断，或者对患有所述癌症的主体的平均期望寿命进行预测的方法。
文档编号A61K39/395GK102574918SQ201080024673
公开日2012年7月11日 申请日期2010年4月6日 优先权日2009年4月3日
发明者琼·塞瓦内·苏亚雷斯, 若泽·巴塞尔加·托里斯, 西尔维娅·佩纽拉斯·普列托 申请人:加泰罗尼亚研究和深造学院, 瓦尔德希伯伦大学医院研究所, 瓦尔德希伯伦肿瘤研究所