Cd226胞外段蛋白抑制肿瘤细胞增殖的用途
【专利摘要】本发明公开了CD226胞外段蛋白抑制肿瘤的作用。所述CD226胞外段蛋白是由SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白。本发明的蛋白能与CD112和CD155分子结合，一方面可有效封闭CD226与靶细胞的结合位点，抑制NK细胞的细胞毒活性，可作为NK细胞的抑制剂，用于治疗自身免疫性疾病；另一方面，与肿瘤细胞表面的CD112或CD155分子结合之后，会对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用。所以该蛋白可用于免疫功能较低的肿瘤病人中抑制肿瘤的增殖。并且由于该蛋白是人体天然蛋白，其极少引起机体的免疫反应。本发明涉及CD226胞外段蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
【专利说明】CD226胞外段蛋白抑制肿瘤细胞增殖的用途
【技术领域】
[0001]本发明主要是属于肿瘤免疫学领域，主要是参与抑制肿瘤细胞生长的蛋白的制备及其用途。具体而言，本发明涉及CD226胞外段蛋白抑制肿瘤细胞增殖的用途。
【背景技术】
[0002]自然杀伤细胞(NaturalKiller，NK细胞)在天然免疫中发挥着极为重要的作用，主要包括杀伤肿瘤细胞、杀伤病毒感染的细胞、杀伤胞内寄生菌和杀伤真菌。NK细胞主要通过两种方式直接行使功能；一是通过分泌细胞因子，对靶细胞产生抑制作用。二是通过NK细胞表面受体和配体之间的识别，使NK细胞活化之后对靶细胞进行杀伤。
[0003]NK细胞发挥功能主要是通过NK细胞表面的各种活化性受体和抑制性受体来实现的。CD226分子是NK细胞表面的活化性受体，在细胞外有两个免疫球蛋白样结构域，与其配体CD 155和CDl 12分子同属于免疫球蛋白分子超家族，是I型跨膜蛋白。
[0004]在众多活化性受体中CD226分子具有活化性受体和粘附分子双重身份，既介导NK细胞与靶细胞的结合，又通过信号通路向胞内传递活化性信号(Jun Shirakawa, YinanWang et, al.1nternational Immunology, Vol.18, N0.6, pp.951-957)。在许多肿瘤细胞中CD226分子的配体CD 1 55和CDl 12分子都会上调表达(Sloan KE, Eustace BK, StewartJK, et al.BMCCancer，2004，4(l):73-78.)。这被认为是有利于NK细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤。但是在肿瘤患者中这种杀伤作用却并不明显。肿瘤细胞通过分泌可溶性的⑶155和⑶112分子来对NK细胞、T细胞等淋巴细胞表面的⑶226分子的结合进行阻断，从而逃逸免疫系统对其进行识别和清除(Baury B, Masson D, et al.Biochem Biophys ResCommun.2003Sepl2 ；309(I):175-82.)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种能与肿瘤细胞表面⑶155 /⑶112分子结合从而抑制肿瘤细胞生长的CD226胞外段蛋白。
[0006]本发明提供的⑶226胞外段蛋白，是由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白(我们又将其称为soluble CD226，简称sCD226)。
[0007]该胞外段蛋白是能与⑶155和⑶112分子特异性结合的配体，可以用人工合成方法直接合成，也可以将蛋白的编码基因融合或分别插入到表达载体，然后转染宿主细胞，用基因工程方法生产。
[0008]上述的肿瘤指的是各种人来源的CD155或CD112分子阳性的肿瘤，例如，但不限
于，恶性腺瘤、慢性髓原白血病等。
[0009]本发明提供活性成分是上述CD226胞外段蛋白的抑制肿瘤细胞增殖的药物。
[0010]上述药物可包括一种或多种药学上可接受的载体。
[0011]上述载体可以是稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和/或润滑剂。[0012]上述药物均可以按照药学领域的常规方法制备出以下剂型:注射液和冻干粉针。
[0013]肿瘤细胞表达的可溶性⑶155和⑶112分子可以有效的阻断NK细胞对其进行杀伤作用，从而使肿瘤细胞逃逸免疫监视。实验证实:本发明的CD226胞外段蛋白能够中和可溶性⑶155和⑶112分子，并且同时与肿瘤细胞表面的⑶155和⑶112分子进行结合，从而对肿瘤细胞的生长产生影响，降低了肿瘤细胞的生长速度。
[0014]本发明以CD226分子为参考模板制作，能够抑制肿瘤细胞的生长，同时对免疫系统的细胞影响较小。由 于本发明的蛋白序列几乎来源于自身的蛋白，因此极少引起机体的免疫反应。使用肿瘤细胞进行增殖试验，此蛋白能够实现和CD155或CD112单抗相似的作用，同时也避免了抗体分子的副作用。本发明的蛋白可采用现有的常规方法制备，技术成熟。这些都是本发明相对于现有技术的有益技术效果。
[0015]综上所述，本发明提供下列各项:
[0016]1、CD226胞外段蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用，其中所述⑶226胞外段蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
[0017]2、根据第I项所述的应用，其中所述肿瘤细胞是CDl 12或CD155阳性的肿瘤细胞。
[0018]3、根据第2项所述的应用，其中所述肿瘤细胞选自Hela细胞或K562细胞。
[0019]4、根据第2项所述的应用，其中所述⑶112或⑶155阳性的肿瘤细胞选自恶性腺瘤或慢性髓原白血病的细胞。
[0020]5、一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，其活性成分是SEQ ID NO:1所示的⑶226胞外
段蛋白。
[0021]6、根据第5项所述的药物，其中所述肿瘤细胞是CDl 12或CD155阳性的肿瘤细胞。
[0022]7、根据第6项所述的药物，其中所述肿瘤细胞选自Hela细胞或K562细胞。
[0023]8、根据第6项所述的药物，其中所述⑶112或⑶155阳性的肿瘤细胞选自恶性腺瘤或慢性髓原白血病的细胞。
[0024]附图简述
[0025]图1，原核重组表达载体pET32a6His-MBP_sCD226的构建流程图。
[0026]A)⑶226蛋白的三级结构预测。使用Expasy的Smart工具对⑶226蛋白进行三级结构预测；
[0027]B)CD226蛋白的二级结构预测。使用Expasy的Psipred工具对CD226蛋白进行二级结构预测；
[0028]C)⑶226原核重组表达载体的构建流程。
[0029]图2，⑶226胞外段重组蛋白表达、纯化及鉴定。
[0030]A)镍柱纯化原核表达的重组蛋白6His-MBP_sCD226 ；
[0031 ] B) Superdex-200 分子筛纯化 6Hi s-MBP_sCD226 ；
[0032]C) SDS page 检测 TEV 酶切 6His-MBP_sCD226 ；
[0033]D) SDS page检测镍柱纯化不带标签的目的蛋白以及Superdex-200进一步纯化目的蛋白；
[0034]E)质谱鉴定纯化得到的目的蛋白的氨基酸序列，检测到的肽段用粗体和下划线表
/Jn ο
[0035]图3，s⑶226蛋白活性鉴定，s⑶226蛋白可以和⑶112单克隆抗体竞争结合肿瘤细胞表面的⑶112分子。
[0036]图4，s⑶226蛋白对⑶112或⑶155阳性肿瘤细胞生长的抑制效应。
[0037]A)Hela细胞、K562细胞和CHO-Kl细胞的表型检测。通过流式检测几种细胞系的⑶226配体表达情况；
[0038]B)sCD226蛋白抑制K562和Hela细胞增殖。分别加入BSA，sCD226，sCD226+aCD226mAb和sCD226+IgG蛋白与K562和Hela细胞分别孵育3天的细胞数；
[0039]C) s⑶226蛋白并不影响CHO-Kl细胞增殖。分别加入BSA和s⑶226蛋白与CHO-Kl细胞孵育3天的细胞数。
[0040]图5，s⑶226蛋白抑制肿瘤细胞生长的时间效应。[0041]A)CFSE染色后K562增殖检测。不加任何蛋白情况下，K562经CFSE染色后，不同时间点胞内CFSE的荧光强度；
[0042]B) SCD226蛋白对K562细胞增殖的影响。加入等量sCD226和BSA之后孵育24h、48h和72h后的实验组中胞内CFSE荧光强度和空白对照的比较。
[0043]图6，s⑶226抑制肿瘤细胞生长的剂量效应。
[0044]图7，s⑶226抑制肿瘤细胞的迁移。
[0045]A)划痕实验检测SCD226对其配体阳性肿瘤细胞迁移的抑制作用。实验体系采用含2%新生牛血清的培养基(K562用RPM1-1640培养基，CHO-Kl用DMEM培养基)。分别在蛋白和细胞共孵育Oh和36h时拍照记录各组划痕的宽度；
[0046]B) Hela细胞迁移距离计算以及各组迁移距离统计；
[0047]OCHO-Kl细胞迁移距离计算以及各组迁移距离统计。
[0048]图8，SCD226可以影响肿瘤细胞内Rac / Cdc42和Cyclin D信号通路。
[0049]A) Western blot检测Hela细胞和相应蛋白孵育后Rac / Cdc42的总表达量以及Phospho-Racl / cdc42 (Ser71)的表达量；
[0050]B)对A图中条带灰度值的统计。统计数据来源于三次实验；
[0051]Offestern blot检测Hela细胞和相应蛋白孵育后Cyclin D的总表达量以及Phospho-Cyclin Dl (Thr286)的表达量；
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
D)对C图中条带灰度值的统计。统计数据来源于三次实验。
CD226胞外段蛋白的氨基酸序列
SCD226蛋白序列在大肠杆菌中表达的编码核苷酸序列
TEV酶的氨基酸序列
TEV酶的在大肠杆菌表达系统中的编码核苷酸序列
序列说明SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO
【具体实施方式】
[0058]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0059]下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0060]实施例所用仪器如下:移液器购自法国Gilson公司，离心机购自德国Hettich公司，净化工作台购自山东省济南市空气净化消毒设备厂，CO2培养箱购自美国ThermoFisher 公司，流式细胞仪购自美国 Becton, Dickinson and Company, Superdex-200 分子筛和N1-NTA纯化柱购自美国General Electric公司。
[0061]实施例1、本发明的蛋白的合成及其功能检测
[0062]一、蛋白的表达和纯化
[0063]1、表达载体的设计
[0064]1)选择蛋白的片段序列
[0065]⑶226的三维结构尚未解析，使用Expasy网站的Smart工具进行结构预测,得到CD226分子胞外可能有两个免疫球蛋白样结构域，其跨膜区可能在243位氨基酸残基到250位氨基酸残基之间。之后采用Expasy的二级结构预测工具Psipred,预测得出在第249位氨基酸残基之后是一个alpha螺旋结构，推测是跨膜区的开始，因此，我们选择在第248位残基处截取胞外段。
[0066]2)载体构建及标签选择
[0067]以人外周血PBMC的cDNA为模板，用引物(正向引物:5’ -CGCGGATCCGAAGAGGTGCTTTGGCATAC-3’ 和反向引物:5’ -CCGCTCGAGTTAAACTCTAGTCTTTGGTC-3’ )将 CD226 分子 19aa至248aa的片段的编码DNA序列进行扩增，分别构建在带有6His，6His_GST，6His_Trx和6His-MBP融合标签pET32a载体上(pET32a载体购自美国Novagen公司)，经过小量诱导表达裂菌之后，检测上清中CD226可溶性蛋白的表达情况，发现只有与6His-MBP标签融合之后能得到可溶性的蛋白表达。所用的载体是带有N端6Xhis标签、和N端MBP标签的pET32a载体。
[0068]3)融合蛋白的酶切和目的蛋白的纯化
[0069]原核表达、高压裂解细菌之后的上清采用N1-NTA纯化柱(购自美国GeneralElectric公司)进行纯化，得到纯度约95%的6His-MBP_s⑶226融合蛋白片段(图2A)，再用Superdex-200分子筛层析(购自美国GeneralElectric公司)进一步纯化(图2B),得到层析图谱上单一的样本峰。采用TEV酶(烟草蚀纹病毒Tobacco etch virus蛋白酶)(可市场购买，如上海索莱宝生物科技有限公司生产的货号为P2060-1000 ;也可由本实验室构建的TEV酶原核表达体系表达获得)(TEV蛋白序列和核苷酸序列见SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4)，克隆到表达载体pEGX4T2中，在大肠杆菌BL21DE3表达菌株中通过IPTG诱导表达出可溶性GST-6His-TEV融合蛋白，之后这个蛋白由于在GST和6His之间存在TEV酶切位点而产生自身酶切，从而去除GST标签。之后用N1-NTA纯化高压裂菌上清得到纯度约95%的6His-TEV可溶性蛋白酶对MBP融合标签进行酶切，以获得单一的⑶226胞外蛋白。加入要进行酶切的融合蛋白一半质量的TEV酶，4°C静置过夜对融合蛋白进行酶切，融合蛋白被酶切为6His-MBP标签蛋白和不带任何标签的目的蛋白(图2C)。用N1-NTA纯化柱进行阴性选择纯化，将带有His标签且未被酶切的融合蛋白、酶切后产生的6His-MBP标签蛋白和带有His标签的TEV酶全部去除。蛋白溶液再经过Superdex-200分子筛层析的纯化，得到纯度约为95%的目的蛋白片段(图2D)。用二维液相色谱多级质谱联用仪(2D1C-MS)(购自美国Thermo Fisher公司)鉴定为0)226胞外结构域片段(ectodomain)，简称Q3226EQ)蛋白片段，本发明中又称SCD226蛋白(图2E)。
[0070]二、蛋白的功能检测
[0071]1、s⑶226蛋白与抗⑶112单克隆抗体竞争结合细胞试验[0072]实验材料:K562细胞(慢性髓原白血病细胞)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号CCL-243?，PE荧光素偶联的小鼠抗-人CD112 (R2.525)购自美国Becton，Dickinson and Company (Cat#:337410), RPM1-1640 培养基购自美国 Thermo Fisher 公司,新生牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司，BSA蛋白购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0073]实验仪器:低温高速离心机购自美国Sigma-Aldrich公司，型号SIGMA1-15K，台式冷冻离心机购自德国Hettich公司，型号Rotanta46R,流式细胞仪购自美国Becton,Dickinson and Company。
[0074]实验组的设置:空白组、同型抗体对照组和抗体实验组(其中包括加入不同的蛋白量:20μ g，40y g，80y g和160 μ g的sCD226实验组、以及不同的蛋白量:20μ g，40y g，80 μ g和160 μ g的BSA蛋白的实验对照组)。
[0075]I)用低温高速离心机200g离心5min，收集30ml培养液中新鲜培养的K562细胞；
[0076]2)用 Iml PBS (pH = 7.2)溶液重悬细胞；
[0077]3)用台式冷冻离心机200g离心5min，收集细胞；
[0078]4)用 PBS (pH = 7.2)重复洗涤一次；
[0079]5)计数细胞，每个实验组中加入2X IO5个细胞；
[0080]6)加入小鼠血清，4°C避光30min进行封闭；
[0081]7)各组中加入2μ g⑶112单克隆抗体和相应的蛋白，4°C避光30min孵育；
[0082]8)台式冷冻离心机200g离心5min,弃上清；
[0083]9)细胞用Iml PBS (pH = 7.2)重悬，然后继续用台式冷冻离心机200g离心5min对细胞进行洗涤；
[0084]10)重复步骤9，洗涤一次；
[0085]11)洗涤结束之后每组细胞用300 μ I PBS (pH = 7.2)重悬转入流式细胞仪检测管，用流式细胞仪进行检测。
[0086]结果分析发现，随着s⑶226蛋白加入量的增加，K562细胞上结合的荧光抗体逐渐减少，无关蛋白BSA的加入并不影响K562细胞表面结合的荧光抗体的量，提示得到的SCD226具有与CDl 12分子结合的能力(图3)。
[0087]三、蛋白抑制肿瘤细胞增殖试验
[0088]实验材料:0.22μπι的无菌滤器购自美国Millipore公司，頂DM培养基、RPM1-1640培养基和DMEM培养基均购自美国Thermo Fisher公司，新生牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司，24孔细胞培养板购自美国Costar公司，K562细胞、CH0-K1细胞和Hela细胞均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号分别为CCL-243?、CCL-61?和CCL-2?，上述三种细胞分别与慢性髓细胞性白血病、中国仓鼠卵巢癌和恶性腺瘤相关。BSA蛋白购自生工生物工程(上海)股份有限公司。纯化的小鼠抗-⑶226 (DXll)抗体(a⑶226mAb)和纯化的小鼠IgGl同型抗体购自美国Becton,Dickinson and Company,货号分别为559787和555749。
[0089]实验组的设置:每一种细胞均分别设置五个实验组:空白对照组只加入PBS溶液，实验对照组每孔加入50 μ g的BSA, SCD226组每孔加入50 μ g的sCD226蛋白，s⑶226+抗⑶226抗体(aCD226mAb)组每孔加入50 μ gsCD226蛋白的同时也加入50 μ g的⑶226的阻断性抗体0乂11(&^22611^13)，s⑶226+IgG组每孔在加入50 μ g的s⑶226蛋白的同时也加入50 μ g的小鼠IgG抗体作为同型对照。每组3个复孔。
[0090]I) s⑶226蛋白和BSA蛋白分别用0.22 μ m的无菌滤器过滤除菌；
[0091]2)收集细胞，200g离心5min，弃上清；
[0092]3)根据ATCC细胞培养要求，分别加入不同的培养基，Hela用RPM1-1640完全培养基(含10%新生牛血清)、CHO-Kl用DMEM完全培养基(含10%新生牛血清)、K562用MDM完全培养基(含10%新生牛血清)，进行细胞计数；
[0093]4)调整细胞浓度至IO4 / ml，加入24孔板，每孔Iml ；
[0094]5)分别加入相应蛋白溶液，空白对照组加等体积PBS (pH = 7.2)；
[0095]6)将培养板放在5% CO2, 37 °C培养箱中，培养72h ；
[0096]7)分别收集各培养孔中的细胞悬液，进行细胞计数；
[0097]8)每个试验重复3次。
[0098]s⑶226蛋白对于Hela细胞和K562细胞的增殖具有抑制作用(图4A)。而CHO-Kl细胞表面没有CDl 12或CD155分子，增殖不受影响(图4B)。无关蛋白BSA的加入也不影响肿瘤细胞的增殖，SCD226蛋白加入3天后可以使肿瘤细胞数目显著减少(表1)。
[0099]表1.各实验组的细胞计数数据
【权利要求】
1.CD226胞外段蛋白在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用，其中所述CD226胞外段蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述肿瘤细胞是CDl12或CD155阳性的肿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述肿瘤细胞选自Hela细胞或K562细胞。
4.根据权利要求2所述的应用，其中所述CDl12或CD155阳性的肿瘤细胞选自恶性腺瘤或慢性髓原白血病的细胞。
5.一种抑制肿瘤细胞增殖的药物，其活性成分是SEQ ID N0:1所示的CD226胞外段蛋白。
6.根据权利要求5所述的药物，其中所述肿瘤细胞是CDl12或CD155阳性的肿瘤细胞。
7.根据权利要求6所述的药物，其中所述肿瘤细胞选自Hela细胞或K562细胞。
8.根据权利 要求6所述的药物，其中所述CD112或CD155阳性的肿瘤细胞选自恶性腺瘤或慢性髓原白血病的细胞。
【文档编号】A61P35/00GK103520705SQ201310431933
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】田志刚, 侯胜科, 孙汭, 郑晓东, 魏海明 申请人:中国科学技术大学