以抗survivin核酶为基础的治疗细胞增殖亢进症的方法

专利名称：：以抗survivin核酶为基础的治疗细胞增殖亢进症的方法
技术领域：
：本发明涉及用来抑制存活素(survivin)在细胞中表达的锤头状核酶为基础的材料和方法，来治疗包括癌症在内的细胞增殖亢进性疾病。
背景技术：
：由于抗凋亡基因的激活和/或促凋亡基因的失活引起的凋亡障碍是恶性肿瘤细胞的主要特点之一[l]。抗凋亡因子存活素(SURVIVIN)[2]虽在正常细胞中不表达，在所有的癌症中均过量表达，呈高度的肿瘤特异性，并通过干预凋亡，有丝分裂，血管生成和应激反应等生命过程的信号通路而对肿瘤学行为作出贡献[3,4]。例如，SURVIVIN与caspase-9[5]相互作用或与从线粒体释放出的Smac/DIABLO相结合[6]而抑制细胞凋亡。通过在转录和蛋白质稳定性水平上的调控，SURVIVIN在G2/M期量为最高，确保细胞有丝分裂过程的正常进行。除了可以作为癌症诊断和预后的生物标志物，SURVIVIN已成为的小分子药物，分子拮抗剂，疫苗和基因疗法的抗癌治疗手段的重要靶标[4,12]。过度表达SURVIVIN的不能被有丝分裂激酶p34cdc2磷酸化的Thr34Ala突变体(显性负调)能够显著抑制肿瘤细胞的生长[13，14]。在实验动物模型和临床I期试验中抗SURVIVINmRNA的反义寡聚核苷酸可抑制SURVIVIN的表达并有抗肿瘤效应[15，16]。其他有效的方法还包括RNA干扰[17，18]或锤头状的核酶[19-22]。核酶是一种新的能够特异有效地减少细胞中RNA水平的手段[23]。锤头状核酶是最小且研究最为深入的核酶。它由三部分组成一个约为13个序列保守的颈环结构样的催化域和两个能够和目标RNA互补位于催化域的两侧的臂区，锤头状核酶在目标mRNA的NUH序列后切开(N为任一核苷酸，H是除G外的核甘酸)从而抑制目标蛋白的表达[24]。底物的特异性是由核酶臂区的与靶RNA的序列互补性来确定的。有较有非靶效应的siRNA[26-28]底物特异性极高的优点。
发明内容发明者已经在试管内，细胞内和活体内系统中全面地分析抗SURVIVIN的锤头状核酶的抑制SURVIVIN表达继而抑制肿瘤细胞生长，促进调亡的能力。所述的核酶系统是一腺病毒载体的形式提供，可用于抗肿瘤等细胞增殖亢进有关的疾病，并且最终完成了这一发明。本发明第一个方面涉及到一种合成的或分离的核酶，所述核酶切割SEQIDNO:l所示的存活素的mRNA，其中所述核酶包含一个催化结构域和接在所述催化结构域两侧的第一和第二核酶结合臂，其中所述第一和第二核酶结合臂包含选自下组的SEQIDNO:1的区域互补的序列(1)+53-60禾B+62-69;(2)+75-82禾口+84-91;(3)+224-231和+233-240;(4)+350-357和+359-366。本发明另一方面涉及一种载体，它包含编码上述核酶的RNA的序列。本发明另一方面提供了一种用于治疗存活素相关疾病的药物组合物，它包含上述的合成的或分离的核酶或载体。本发明另一方面提供了一种治疗与存活素相关的疾病或与存活素表达升高相关的病情的方法，该方法包括给有需要的对象有效量的上述的合成的或分离的核酶、载体、或药物组合物。本发明另一方面提供了一种促进表达存活素的组织或细胞凋亡的方法，该方法包括给予所述组织或细胞有效量的上述合成的或分离的核酶、载体或药物组合物。本发明另一方面提供了一种提高癌细胞对化疗或放疗的敏感性的方法，该方法包括使所述细胞与有效量的上述合成的或分离的核酶、载体或药物组合物接触。本发明还有一方面涉及了上述合成的或分离的核酶或载体在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与存活素相关的疾病或与存活素基因表达升高相关的病情。这些合成的核酶和载体，比如以腺病毒载体为基础的抗SURVIVIN核酶，在治疗高细胞增殖症方面有着广泛的应用，这里所指的高细胞增殖症包括癌症但是并不仅仅是癌症。此外，本发明还详细介绍了鉴定耐用的綞头状核酶能否在体内切割任何给定的RNA的方法。图1显示了实验流程的示意图。图2显示了切割S^TiT/vVmRNA的锤头状核酶。图A描述了由MF0LD程序预测的SUVIVINmRNA的二级结构。核酶Rl—R4各自在6Z^K/KZ^mRNA上的切割位点用圆圈标出；图B标出^5ZWK/rZVmRNA序列以及被核酶切割的核苷酸；图C展示了5Z^W^VmRNA底物和核酶(Rl到R4)，重点突出两者的配对区和切割位点。图3显示了表达质粒和腺病毒载体。图A:用于表达锤头状核酶(ribozyme)的质粒载体pGVaL。该载体含有两个腺病毒小RNA基因VaI和VaII，和位于其上游的T7启动子(T7pro,用于试管内的转录)或polIII(PolIIIpro,用于真核细胞中转录)启动子。核酶序列可引入到位于以人为引进的颈环结构的的环区(loop)的SalI和PstI位点，使核酶分子暴露于其和VaI的融合RNA分子。图B:表达核酶的腺病毒载体。pGVaL-l—4的各自的BamHI和NheI片段分别插入pDC载体(Microbix腺病毒载体系统)中，产生pDC-Rl—4。pDC-R134中按照标出得顺序依次导入了pGVaLRl，R3和R4中的BamHl/NheI片段。图C为基础由CMV和T7启动子指控由一编码HA三肽段标记的序列引导的5ZWWvVcDNA的表达载体HAS。在HAS的6Z况KiT7^序列的下游同框接上萤火虫的荧光素酶基因(luciferase)，而产生HASL。图4显示试管内试验系统各自核酶切割6Z/AT/WRNA的特异性和效率。图A示出所预测的从核酶R1到R4的切割位点和用于引物延伸实验的引物的在5ZWW;V序列中的位置。图B:用箭头示出反映由Rl,R2，R3和R4特异性切割^5Z况K/Ki^RNA的位点的引物延伸片段在测序电泳的位置。用同一个引物的所进行的测序标准(ACGU)同时示出。(-)和(+)分别指无核酶对照和核酶实验组。图C，示出HASLRNA受核酶切割后再经试管内翻译所产生的荧光素酶活性。"All":经所有四种核酶处理的，control是无核酶对照。图D显示用HA抗体对HASL产物的Western分析的结果。带的强度的相对于无核酶处理对照(100%)的比值在图下示出。图5显示细胞内核酶介导的5Z况KiT/yVmRNA切割效应的以及其对肝癌细胞系，S丽C-7721的生存和凋亡的作用。图A显示了核酶腺病毒，空载体(GVal)腺病毒侵染的和未侵染的S顧C-7721细胞(它的值被认为是1)MTT值。图B显示了剂量为MOI25的腺病毒侵染72小时的细胞的凋亡标记蛋白PARP(85kDa)的表达水平的Western分析结果。以PCNA蛋白的表达水平作为上载内参。前者和后者的比值在图下示出。图C显示了5ZWF/K/7^mRNA和核酶表达水平的半定量性RT-PCR分析。以P-肌动蛋白((3-actin)RNA做为上载内参。前者和后者的比值在图下示出。图D显示了剂量为MOI25的腺病毒侵染72小时的细胞的SURVIVIN表达水平的Western分析结果。以PCNA蛋白的表达水平作为上载内参。前者和后者的比值在图下示出。图E显示了病毒感染干扰肿瘤细胞的有丝分裂。用剂量为MOI25的GVaL(空载体)和R3或R134病毒处理过的细胞的荧光免疫检测。并用微管蛋白(tubulin)抗体染色(绿色；b，b，和b")，ACA(中心粒)抗体(红色；a，a，和a")以及DNA染料T0T03(蓝色；c，c'和c")。核酶处理导致破坏的有丝分裂细胞被观察到多级的纺锤体，而对照组的细胞却呈现出中期和后期等正常的有丝分裂进程。尺度为10"m。图6显示了细胞内核酶介导的6Z况K/KZVmRNA切割效应的以及其对肝癌细胞系，PLC(ATCCNo.CRL-8024)的生存和凋亡的作用。图A显示了核酶腺病毒，空载体腺病毒侵染的和未侵染的PLC细胞(它的值被认为是1)MTT值。图B显示了剂量为MOI25的腺病毒侵染72小时的细胞的凋亡标记蛋白PARP(85kDa)的表达水平的Western分析结果。以PCNA蛋白的表达水平作为上载内参。前者和后者的比值在图下示出。图C显示了WyVmRNA和核酶表达水平的半定量性RT-PCR分析。以P-肌动蛋白RNA做为上载内参。前者和后者的比值在图下示出。图D显示了剂量为MOI25的腺病毒侵染72小时的细胞的SURVIVIN表达水平的Western分析结果。以PCNA蛋白的表达水平作为上载内参。前者和后者的比值在图下示出。图7显示了核酶对于S醒C-7721细胞对于Irinotecan(伊立替康)Hydrochloride的敏感性的增强的作用。图A和B示出SMMC-7721细胞在遭受了24小时病毒感染的5,10和25和分别接受浓度为50，100和250g/ml的IH处理的MTT值。图C禾BD显示了以100和250g/ml的IH作为100%基准所示出的相应的GVaL，R3和R134病毒处理的MTT值的比率。图E和F示出PARP(85kDa)和PCNA(内参)的Western分析结果。前者和后者的比值在图下示出。图8显示了核酶腺病毒对SMMC-7721肿瘤细胞的裸鼠内成瘤能力的阻止效应。图A显示了实验流程。图B显示了剂量为MOI:25的GVaL和R2感染的S醒C-7721细胞在裸鼠内的生长曲线。图C显示了来自R2，GVaL，和无病毒感染的S醒C-7721细胞在裸鼠内成瘤35天相对肿瘤大小。图D显示了GVaL/S腿C-7721;GVaL/Rl;GVaL/R2，GVaL/R3,GVaL/R4和GVaL/R134感染细胞在裸鼠内成瘤35天的肿瘤。图E显示了剂量为MOI:10的GVaL和R4感染的SMMC-7721细胞的生长曲线。图F显示了在GVaL和R4感染SMMC-7721在裸鼠内成瘤35天肿瘤的相对大小。图G显示了GVaL/R3，GVaL/R4，和GVaL/R134感染细胞在裸鼠内成瘤35天的肿瘤。图H显示了GVaL感染的SMMC-7721细胞在R3和R134实验组的生长曲线。图I示出GVaL感染的SMMC-7721细胞在R3和R134实验组的相对肿瘤大小。图J禾卩I分别显示GvaL，R2(M0I:25)和R4(M0I:10)核酶病毒感染S醒C一7721细胞在裸鼠中成的瘤的5Z/vK/K/^和Ki67(反映细胞的DNA复制指数)蛋白的表达水平。图9显示了5Z/yWyVmRNA的剪切变异体(全长survivinvariantl;2B和deltaEx3)和及其能被核酶切割的潜力。具体实施例方式本发明第一方面提供了合成的或分离的核酶，该核酶能够切割5Z/;K/W的mRNA(SEQIDNO:1)。所述核酶含一个催化结构域和在该催化结构域两侧的两个与底物RNA序列特异性配对结合的区域(在本发明中也称为第一核酶结合臂和第二核酶结合臂)，所述第一核酶结合臂和第二结合臂分别包含选自下组的SEQIDNO:1的区域互补的序列(1)+53-60和+62_69;(2)+75-82和+84-91;(3)+224-231和+233-240;+350-357和+359-366。例如，当第一核酶结合臂包含与SEQIDNO:1中+53-60位区域互补的序列时，第二核酶结合臂包含与SEQIDNO:1中+62-69区域互补的序列，而且两者之间可以互换。在一个具体实施方案中，所述核酶包含核酶R1、R2、R3或R4的序歹lj(见图2)。此处使用的术语"核酶"不仅指传统意义的能序列特异性地切割核糖核酸序列的核糖核酸分子，还包括DNA以及核酸类似物组成，或者其与RNA构成组合分子，如DNA/RNA嵌合物。通过序列互补的方式，核酶以特异地切割RNA底物的磷酸二酯键的RNA分子。在切割后，水解了的底物寡核苷酸从核酶上脱落。此核酶又可以参加进一步的反应。原则上说，所有能在分子内切割磷酸二酯键的核酸对于本发明来说都是合适的。核酶的催化结构域可以由本领域技术人员根据常规知识来设计。此处所用的术语"包含"是指结合臂中除了与SEQIDNO:1的指定区域互补的序列外还可有其他序列，所述其它序列的长度可以为1-30bp，更佳的为1-10bp。在另一较佳的实施方案中，所述核酶结合臂与SEQIDNO:1中的指定区域完全互补。如上所述，本发明提供了能够在序列SEQIDNO:1处切割SURVIVINmRNA的锤头状核酶。本发明的技术方案也可用其它类型的核酶形式来实施，其包括但不限于锤头状核酶，发夹状核酶，环形核酶，环形/发夹状核酶，套索状核酶，发夹/套索状核酶，RNA酶P核酶，肝炎病毒核酶，I类内含子核酶或者小型酶。对于熟练掌握这些现有技术的本领域技术人员而言，所有这些选择均为显而易见。锤头状核酶的切割位点的序列要求是任何由NUH(N可以是任意的核苷酸，H可以是除了G以外的任意核苷酸)组成的RNA序列。在SURVIVINmRNA序列(醒一OOl168;SEQIDNO:1)中有449个NUH序列可作为锤头状核酶切割的靶序列。本发明对SURVIVINmRNA的+61，+83，+232和+358的核苷酸作为锤头状核酶靶切点的价值作了系统的分析。核酶分别含有SURVIVINmRNA(歷—001168,A作为翻译的起始密码，ATG被定义为+1)的+53-60和+62-69，+75-82和+84-91，+224-231和+233-240，和+350-357和+359-366特异性配对的臂区(核酶Rl到R4,图2B)。本发明中的核酶，以及编码这些核酶的DNA以及其他适合的核酸分子，可通过化学合成来获得。核酶亦可通过传统的基因表达的方式从其编码DNA序列在真核细胞启动子(在靶细胞中表达)或原核细胞启动子(在试管内转录)的控制下完成。前者为CMV等和其它在肿瘤细胞中高表达的基因的启动子。后者由T7RNA聚合酶的启动子和SP6RNA聚合酶的启动子。本发明中的核酶可以是单体或是多聚体。术语"多聚体核酶"和"聚核酶"在本发明的陈述中意思相同，都是意为一个通过一系列的核酶首尾相连形成的RNA分子。在一个较佳的实施方案中，本发明提供了头尾连接的3个锤头状核酶基因，其中每个核酶的两个结合臂分别由与SEQIDN0:1的以下区域互补的序列组成(1)+53-60和+62-69;(2)+224-231和+233-240;(3)+350-357和+359-366。例如，第一个锤头核酶的两个结合臂分别与SEQIDNO:1的+53-60和+62-69区域互补，第二个锤头核酶的两个结合臂分别与SEQIDNO:1的+224-231和+233-240区域互补，第三个锤头核酶的两个结合臂分别与SEQIDNO:1的+350-357和+359-366区域互补。所述三个核酶的位置也可以前后互换。用核酶来治疗疾病还涉及向受靶细胞引进化学合成的核酶或可以表达核酶分子的基因。这涉及到将能在细胞内产生核酶的核酶基因及其调控区的复合体的转道。为此，本发明提供了一种包含编码此核酶RNA的序列的载体。在此，"载体"指一种能够表达核酶的序列装配体。在此核酶基因由适于将其导入并在宿主细胞高效表达的载体所携带。其中编码核酶基因的序列受到聚合酶III(例如来自腺病毒的tRNA或VA-1)，CMV，SV40等真核细胞类型特异性的启动子，亦可由组织或肿瘤细胞特异性的启动子控制。除了本发明中所使用的非增殖性腺病毒载体以外，其他载体也可能同样有效或更好。病毒类载体还有腺病毒相关病毒，慢病毒，逆转录病毒和疱疹病毒载体。本发明所使用的腺病毒载体携带受着腺病毒VA-1基因的polIII启动子控制的编码针对SURVIVINmRNA的核酶的DNA序列。核酶的编码序列处于A.Lieber'spGVaL载体的腺病毒VRLRNA基因中，在保留必要序列的前提下，大部分VA1基因区已被去除后转移到腺病毒载体中。鉴于核酶序列插入腺病毒ValIRNA基因中，在该基因强有力的polIII启动子驱动下，转录产生高水平的RNA，并有较高的稳定性，即，核酶脂A半衰期长。核酶序列置于一个人工引入ValI基因由倒转重复序列组成的环形区中(图3A)——核酶RNA可望充分暴露于VA1RNA部分之外，预期可增加核酶与其靶分子RNA的接触，而达到对其有效地切割。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种载体(如腺病毒表达载体)，它包含编码本发明所述的核酶的RNA的序列，以及与该序列操作性相连的一个或多个启动子。在更佳的技术方案中，所述核酶RNA序列位于腺病毒VALRNA基因中。在更优选的技术方案中，所述核酶RNA序列位于人工引入ValI基因的由倒转重复序列组成的环形区中。在另一技术方案中，该载体内的一个或多个核酶基因在一个或多个启动子的控制之下。本发明还提供了携带上述载体的原核细胞和真核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于如大鼠、小鼠以及人细胞等。本发明通过系统的分析涉及到生物信息方法设计，对在试管、细胞和体内实验系统中锤头状核酶对底物RNA切割的特异性和有效性的系统分析(a)通过mfold软件预测的SURVIVINmRNA的开放区域，对其中4个符合锤头状核酶切点序列的顺序进行了相对应的核酶的设计和表达载体的构建。(b),用RT-PCR法在mRNA水平以及免疫检测方法(Western和免疫细胞化学)在肿瘤组织和细胞的蛋白质水平上测度SURVIVIN表达。(c),通过用T7噬菌体RNA的转录酶在试管内转录，制作核酶和底物RNA。(d)，通过引物延伸，报告基因活性测定和蛋白水平检测来判定锤头状核酶切割SURVIVINmRNA的特异性和有效性。(f)，通过携带非增殖性腺病毒载体感染肿瘤细胞并高效表达核酶。通过RT-PCR方法对核酶的表达进行定量。(g)，SURVIVIN表达受抑所致的细胞水平上生物学效应通过MTT方法对细胞增殖和细胞凋亡状态进行度量，通过Western分析对PARP(85KD)水平的度量来判断细胞的调往状态，和通过RT—PCR在RNA水平上，Western在蛋白质水平上评估核酶对SURVIVIN表达的影响。(f)，SURVIVIN表达受抑所致的活体动物水平上生物学效应通过对裸鼠体内荷瘤的生长的度量，和以免疫组化手段对肿瘤组织中的SURVIVIN蛋白和K67蛋白(反映细胞增殖的速率)在的水平的度量。上述核酶及其载体可用于治疗所有与SURVIVIN表达过高相关联疾病状态。在本发明中需要这种治疗的试验对象包括动物，特别是哺乳动物，比如人类，家畜，非人类的灵长类，宠物，动物园动物等等，虽然在本发明中的试验对象为人类。以用本发明来治疗的病情为所有与SURVIVIN相关或与其表达过高(过表达)相关联的疾病状态，其可包括，但不局限于肿瘤(所有组织来源，如心血管疾病和自身免疫性疾病(例如风湿性关节炎)等。本发明也提供了在表达SURVIVIN的组织和细胞里促进凋亡的方法和一种增加癌细胞对化疗和放射疗法敏感性的方法。在简要的介绍这项发明后，通过下面的这个实施例可以使这项发明更容易理解。这个例子只是为了说明，并不是为了将本发明的范围仅局限在这个实施例。实施例材料与方法1、构建质粒和腺病毒1)抗-^7AF/r/iV核酶表达质粒载体通过MFOLD软"f牛(http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/forml.cgi)对人^7if7^77VmRNA(GenBankNo.BC008718;SEQIDNO:l)进行分析，获得编码区(从ATG的A:1至TGA中的A:426，环状)中的暴露区。继而根据NUH核酶切割准则设计4个核酶分别在+61,+83,+232和+358处切害U(R1—4)(图2A)。合成的寡聚核酸对(表1)5'端磷酸化后退火成双链，然后克隆到pGVaL质粒载体的Sail和PstI酶切位点[25](图3A)。构建的质粒命名为pGVaL-Rl、-R2、-R3、-R4。表1核酶的寡聚核苷酸核酶Rl(+61)R2(+83)R3(+232)序列R1U5-TCGACCTTGAATGCTGATGAGTCCGTGCGGACGAAAGAGATGCATGCA-3(SEQIDNO:2)RIB5-TGCATCTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCATTCAAGG-3(SEQIDNO:3)R2U5-TCGACAGCCCTCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAAGGGCATGCA-3(SEQIDNO:4)R2B5-TGCCCTTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGAGGGCTG-3(SEQIDNO:5)R3U5-TCGACATGCTTTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATGTTCCTATGCA-3(SEQIDNO:6)R3B5-TAGGAACATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAAAAGCATG-3(SEQIDNO:7)_R4U5-TCGACTTTCTTCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATTGTTGGATGCA-3(SEQIDNO:8)R4(+358)R4B5-TCCAACAATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGAAGAA__AG-3(SEQIDNO:9)_U:上链；B:下链；2)SL^WT77V质粒表达载体F/raV的编码区(从ATG的A:1至TGA中的A:426)用pfu-PCR从SMMC-7721肝癌细胞的cDNA扩增获得，引物为SurL5-CCGCTCGAGATGGGTGCCCCGACG-3(SEQIDNO:10);SurR5-GAAGATCTATCCATGGCAGCCAGCT-3(SEQIDNO:1l)(带下划线部分分别是BglII和Xhol的识别位点。然后通过克隆到pcDNA-HA载体的三个HA标记的下游区域，从而获得HAS。pGL-3-basic中的HindIII(平端)和XbaI荧光酶素间的片断克隆到HAS的相应酶切位点，从而获得HASL(图3C)。3)非复制型的腺病毒-核酶载体(AdMax系统构建，http:〃www.microbix.com/)(图3.B)pGVaL和pGVaL-Rl-4的BamHI/NheI(平端)片断通过AdMax系统插入到载体pDC的BglII/HindIII(平端)位点，从而分别得到pDC-GVaL和pDC-Rl-4。pDC-Rl中的EcoRI/SacI(平端)的片断插入到pDC-R3的EcoRI/SmaI位点(平端)中，获得pDC-R13。pDC-R13的EcoRI/SacI(平端)片断插入到pDC-R4的EcoRI/SmaI位点(平端)中从而获得pDC-R134。上述质粒分别与腺病毒骨架载体(pBHGE3AEl)共转染293HEK细胞，通过cre-loxp介导的腺病毒重组，而产生预期的腺病毒。经鉴定(测序)后，核酶腺病毒将大规模扩增，纯化，定效价后分装并保存在-2(TC冰箱备用。2、试管内核酶切割特异性和效价的度量1)利用T7RNA聚合酶(Takara)通过试管内转录2ug线性化了的pGVaL/pGVaL-R4(XbaI)和HASL(HindIII酶切)而分别获得核酶和HA-SWF/P7A^荧光素酶RNAs，用DNaseI消化后通过半定量的RT-PCR对RNAs进行定量。2)试管内核酶对HA-SWr/r/A^-荧光素酶RNAs的剪切溶于10ul的50mMTris(pH7.5)/lmMEDTA的核酶和HA-SWWT77V-荧光素酶RNAs(各1nm)经热变性后迅速降温到30°C。加入MgCl2至最终浓度为10mM，起始60分钟的剪切反应。RNAs经用醋酸铵/乙醇沉淀后，进行分析。A，2/3的对照和转录剪切样品通过5-32P标记利用T4多聚核苷酸激酶进行引物延伸分析(SPE1用于Rl和R2,SPE2用于R3和SPE3用于R4,表2,图2C)。利用同样的引物以HASL模版通过T7DNA聚合酶驱动的测序反应(Amersham，UK)来作为切口定位的参照。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>寡核苷酸末端通过T4核苷酸激酶将h^P]ATP的32P标记(5000Ci/mmo1)B，剩下的1/3产物在试管内翻译(RabbitReticulocyteLysateSystem,Promega)而产生蛋白，所得产物的1/5通过Lumat光度计(LB9506)检测荧光酶素，并作图。剩下的4/5的翻译产物通过HA抗体的Western分析，并通过SuperSignalWestPico荧光底物进行显示，对其定量。3、腺病毒核酶抑制SURVIVIN表达的细胞学效应SMMC-7721和PLC肝癌细胞分别在含10。/。胎儿牛血清(PAA,Austria)或10%新生小牛血清(Si-ji-Qing,中国)的Dulbeccco改进的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)在37°C，5。/。C02条件下，培养。病毒感染后72小时后通过MTT方法测定细胞存活率。MTT相对值通过如下公式计算绝对值气样品OD值-空白组ODy(对照组OD-空白组OD)x100%。病毒感染后48小时后细胞被收集做RT-PCR和Western分析。在分析细胞对Irinotecanhydrochloride细胞毒素的敏感性时[26]，SMMC-7721细胞被病毒感染24h，继而用最终浓度分别为50，100，250ug/ml的Irinotecanhydrochloride处理48h，然后进行MTT测量。使用半定量的RT-PCR对SURVIVIN，J5—肌动蛋白和核酶的表达水平进行定量，(所用的引物见表3)。核酶病毒感染细胞和无核酶病毒感染的细胞的SURVIVINmRNA的表达程度通过SRVIVIN对P—肌动蛋白的比值)来表示的。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>N.B.，Loop1和Loop2是用来对核酶表达进行RT-PCR分析的。用15%SDS/PAGE凝胶上Western方法来分析St/iF/raV的表达OSWWraV抗体，FL-142,SantaCruz，USA)，以PCNA作为内参。85KDa的PARP(pAB[27]，Promega,USA)/PCNA的Western分析是在7.5%SDS的PAGE凝胶上进行的。SWWWiV或85Kd的PRAR对PCNA带的相对强度的比值是判断核酶病毒感染的细胞和对照的指标。4、免疫荧光显微观察SMMC-7721细胞分别被SWF/F/iV核酶(;R3或R4)和GVaL(无核酶对照)病毒感染24h后，经富尔马林固定，2%TritonX-100处理，然后用含0.05%Tween-20和1。/oBSA(Sigma)的PBS封闭。分别用抗鼠微管蛋白抗体DM1A1:5，000;人着丝粒抗体ACA1:2，000对其作用1小时。用TPBS洗3次，以完全去除一抗。用TexasRed-偶联的羊抗人IgG+IgM和FITC-偶联的兔抗鼠IgG(JacksonImmunoResearch)作为二抗体进行分别对微管蛋白或着丝粒荧光显色。将DNA用TOTO-3(Invitrogen)染色。波片用LeicaSP5公焦显微镜观察。5、核酶腺病毒对在裸鼠中肿瘤细胞能力的抑制SMMC-7721细胞分别被MOI:10或25的核酶病毒感染24h/37°C后皮下注入到裸鼠((Balb/c,nu/nu)的侧部(3xl0V点)。每组有三只老鼠，每只老鼠的左侧注入了SMMC-7721细胞或Adeno/GVaL(不含核酶的病毒)感染的细胞(对照)，右侧注入核酶腺病毒感染的细胞。监视和测检肿瘤的生长直到4周后试验的结束。对肿瘤秤重。肿瘤经甲醛固定，切片后用H&E染色或免疫荧光来检测SWWW(抗体，FL-142,SantaCruz,USAl:10稀释)和Ki67蛋白(1:10稀释Ki67抗体，Novocastra，UK)的表达，显色是通过EnVisionSystem(HRP，GK400315，DAKO，USA)获得。每种蛋白的表达都通过程度(0-3)和阳性细胞的比率(0=小于5%，1=5-25%,2=25-50%，3=50-75%，4=大于75%)打分。整体的免疫荧光分数通过将程度与百分率相乘。l-4分记为+，6-8记为++，9-12记为+++。试验结果1、设计抗-^WF/F/7V锤头状核酶禾ij用MFOLD软件(http:〃www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/ma/forml.cgi)[28](图.2A)来预测SURVIVINRNA编码区的暴露区，继而设计出来分别剪切SWWT77VmRNA的+61(R1),+83(R2),+232(R3)，禾tl+358(114)锤头状核酶(图.2B-C)。核酶基因继而被插入到Lieber构建的pGVaL载体中[25](图.3A)。该载体较好地解决了高效地完成锤头状核酶介导的mRNA剪切三个关键环节表达程度，稳定性和接近靶点的可能性[25，29]。核酶基因被插入到受控于一强启动子polIII腺病毒ValIRNA基因内部，不仅使其能够高效转录，并有效地延长了其稳定性。核酶基因插入到Vall基因一个人为构建的环中部[25](pGVaL-Rxin图.3A)，预期核酶将会有效地暴露在此融合RNA的外部。为了方便试管内合成，在ValI基因的上游引入了一个额外的T7噬菌体的启动子(图.3A)。为了方便在细胞和动物中分析，以便最终能应用到临床癌症治疗，我们将pGVaL-Rx中的含核酶的BamHI和NheI片段被引入到腺病毒载体中(图.38)。HA标记的SWWWiV-荧光虫荧光素酶融合基因被加入到以pcDNA3.1构建的载体中，获得HASL(图.3C)。所以试管内评估SWP7W7VRNA剪切特异性和效率可以通过以下方法方便的进行1、引物延伸(同时检测剪切特异性和效率)；2、western分析荧光素酶活性和蛋白含量(剪切特异性)。2、试管内检测核酶对SURVIVINmBNA的剪切特异性和有效性等量(lnM)的核酶和试管内转录的底物mRNA在Mg^起始下进行剪切。剪切位点通过32P末端标记(SPE1到SPE3，图4A)的反义寡核苷酸引物延伸被精确定位到核苷酸序列水平，同时以人工合成的序列梯度作对照。所有的四种核酶都可以进行对mRNA进行精确的剪切(如图.48所示)。若以相关的条带密度是各自核酶的剪切能力的反应，R2的效应较低。对经剪切的SURVIVIN—LUCRNA在试管内被翻译成的蛋白检验荧光素酶的活性(图.4C)或用Western分析的方法分析相应的蛋白量(图.4D)。核酶的剪切导致荧光素酶的活性从对照组(无核酶)(100%)分别减少到62.65%(R1),70%(R2),40.35%(R3),57%(R4)和28.7%(所有四个)(图.4C)。蛋白的密度从对照组(100%)分别减少到48.8%(R1),124.39%(R2),28.7%(R3),61。/。(R4)和16.5%(所有四个)(图.4D)。所有符合MFOLD预期的核酶都有特异的剪切SWWr/7VmRNA的不同强弱的能力。R3能力最强，然后能力强弱如下R1"R4〉R2。当所有核酶都加入时剪切更为充分(图.4C和D)。3、用核酶腺病毒感染和对内源性SURVIVINmRNA的剪切及其生物学影响用不同剂量的携带核酶基因(R1到R4)或R134三联体或无核酶的载体(GVaL)的非复制性的腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞72小时后，用MTT试验检测细胞损失的生存能力(图.5A)，用Western分析测量PARP85kDa蛋白的水平来反映细胞凋亡指数(图.5B)，用Western分析和半定量PCR分析检验SWF/F/iV表达的抑制(图.5C)。和试管内的观察结果一致(图.3和4)，R2是功效最低的核酶，甚至在MOI值在50的时候，MMT减少不多于20c/。。R3仍然是活性最强的。以R3做对照，R134有更强的效应MOI12.5:23.2%(R3:38.6%),和MOI25:15.2%(R3:27.77%)(图.5A)。PARP85kDa是PARP-1的特异性剪切产物。通过对PARP，85kDa(—个检验活化的细胞凋零过程的传统蛋白标记物)量的度量，在SMMC-7721对照为100%失，R2的相关值为164%,Rl:480%，R3:768%,R4:460%禾卩R134:1340%(图.5B)。因此，由MTT试验检测到的细胞活性的下降的确是由于核酶抑制SWr/F/W的表达以引起细胞凋零(图.5C和D)。半定量RT-PCR分析证明了和被核酶腺病毒感染的细胞P—肌动蛋白和核酶表达水平均无明显差别。但SMMC-7721细胞中SWK/F/iVRNA则随核酶不同而异91.4%,Rl:36.14%;R2:108.3%;R3:33.82%;R4:60.45%;R134:22%(图.5C)。对^7if7P7iV蛋白的Western分析将得出同样的结论。R134为最为有效(图.5D)。免疫荧光研究表明SMMC-7721细胞通过R3和R134核酶病毒感染会发生的染色体分离的混乱(图.5E:d'和d")。83±7%的被感染细胞的染色体在有丝分裂后期不能排在赤道板上，出现多极的纺锤丝(c'和c")，而GVaL感染的对照组此值为5土3。/0的(11=4)，但是由ACA标记的微管完整性和着丝粒是不改变的，暗示着核酶处理的特异性(a，禾卩a")。对PLC肝细胞瘤系(ATCCNo.CRL-8024)上做了同样的分析，得到了同样的结论(图.6)。SURVIVIN的过度表达是临床所见的肿瘤放射性和化学抗性的重要机制31,32]。用反义寡核苷酸和siRNA抑制SURVIVIN的表达使本来对化疗有抗性的细胞变得敏感[33,34]。分别被MOI为5，10和25的病毒感染24小时后，继而被IH(—个化学疗法药物的异构酶抑制剂)在3个sub-ID50剂量(50，100和250)ig/ml)中作用48小时后，进行在MTT分析和PARP85kDa的定量(图.7)。R3只在IH为50和100吗/ml可促进细胞死亡，但R134病毒甚至在250吗/ml时仍然有效果(图.7A和B)。R134较R3更为有效可更明确地在将R3病毒感染/100和250pg/mlIH处理细胞的MTT值分别为100%，辅以R134病毒感染的细胞的MTT与前者的比例来作图的图7C和D中示出。病毒剂量为10MOI(10个病毒对1个细胞)/100吗/mlIH的R134和R3病毒感染细胞的MTT的比值分别为88%和100%;而病毒剂量为10/250pg/ml时,该值为77%和91.5%,而病毒剂量为25/100|ig/mlIH时,该值为78%和94%以及而病毒剂量为25/250pg/ml时72%和83%。对相关蛋白的Western分析支持这一结果。在病毒剂量为25的条件下，PARP8SkDa蛋白的相对量增加到125%(Rl)，140%(R3)和135%(R4)(图.7E),在病毒剂量为10的条件下，该值为147。/。(R134)(图.7E)。更为明显的是，当细胞受到100iag/mlIH处理时。病毒剂量为5的R134(267。/。)导致比病毒剂量为25R3(226。/。)更多的的PARP85kDa蛋白(图.7F)。4、腺病毒核酶阻止SMMC-7721细胞内的肿瘤生长SMMC-7721细胞经剂量为25的病毒感染24小时后，注入裸鼠背部皮下。为了避免个体差异的影响，每个鼠的右背注入未感染的或无核每空载体腺病毒感染的SMMC-7721细胞，而鼠的左背注入核酶腺病毒(图.8A)。除了R2核酶病毒感染细胞以较对照为缓的速率成瘤，形成较小的瘤(与GVaL腺病毒的瘤重比为0.64:1)，其它核酶病毒感染的细胞不能成瘤(图.8B-D)。在病毒剂量为10的情况下，R4核酶病毒感染的细胞以较对照为缓的速率成瘤，形成较小的瘤(与GVaL腺病毒的瘤重比为0.45:1)，R3和R134核酶病毒未能成瘤(图.8E-H)。与肿瘤成瘤行为相符，R2和R4感染所成的肿瘤细胞中，SW^7F/W(图.8J)和ki67(图.8K)的表达远低于GVaL腺病毒对照的水平。GVaL腺病毒感染SMMC-7721细胞的成瘤潜力可能较准确地反应了实验鼠个体间的成瘤能力的个体差异。从而，GVaL腺病毒肿瘤生长在R134(100。/。)中比R3实验鼠(31%)中快2倍，尽管无肿瘤生长背观察到，仍提示R134确较R3核酶腺病毒更为有效地在裸鼠中抑制肿瘤生长(图.8H)。讨论SWK/W7V是治疗癌症的常用的耙基因[3，4]。已进入临床一或二期实验的小分子对抗剂包括4-甲基去甲二氢愈创木酸作为抑制依赖于SWWF/iV基因表达的Spl[35]和干扰SWP7^7iWHsp90的相互作用的17-烯丙胺-格尔德霉素[36]或Shepherdin[37，38]。通过反义寡核苷酸，干扰RNA和核酶在mRNA水平抑制表达是在尝试中的另一手段。锤头核酶有着比反义寡核苷酸更为有效和可通过载体形式导入的优点，又有较干扰RNA底物特异性高的优势。本发明中，我们针对SURVIVINmRNA的四个暴露区域设计了四种锤头核酶R1:61,R2:83,R3:232，和R4:358(图2)。试管内实验结果表明所有四种核酶均能不同程度地特异地切割SURVIVINmRNA(图.4A和B)，提示用MFOLD软件预测的底物RNA暴露区域在核酶设计过程中的价值。其它试管内实验的结果均提示R3是最为有效的，其次为R1，R4,和效率最低的R2(图4C和D)。虑及RNA高级结构的高度可塑性和动态性，可供各个核酶切割的针对区处于暴露状态是有限的。与此理念相苻，四个核酶同时使用可产生较任一单核酶为强的效果(图.4)。从而，在细胞内和活体内实验中，携带核酶R1，R3和R4核酶基因的腺病毒(R134)较任一单个核酶为有效(图5—8)。这还有细胞内SURVIVIN的RNA存有的多种剪切形式，继而产生多种蛋白的根源。如图9所示，常见的剪切形式有SURVIVIN(全长)，SURVIVIN-AEx3(缺少外显子3),以及SURVIVIN-2B(保留作为隐藏外显子的内含子2)。核酶R3是不能剪切与白血病预后凶险相关的SURVIVIN-AEx3的RNA。从而，本发明中R134腺病毒有着更好的临床应用的前景。这个发现结合所选择的相关实例已经清楚的展示和说明，这些内容会被在这个领域精通的人所理解。在不改变本发明的精神和所要求范围的情况下，在形式或细节上可能会出现不同。那些在这个领域精通的人会认识到或有能力确信只用常规的实验手段就可以找到和这里发现的具体实例描述的一样的许多类似物。这些类似物都包括在所附权利要求的范围中。参考文献1.Hanahan,D.和R.A.Weinberg,thehallmarksofcancer,cell,2000.100(1):p.57-70.2.Salvesen,GS.，Duckett,C.S.，lapproteins:blockingtheroadtodeath'sdoor.NatureRev.Mol,CellBoil.,2002.3:p.401-410.3.Altieri,D,C.，Molecularcircuitsofapoptosisregualtionandcelldivisioncontrol:theSURVIVINparadigm.JCellBiochem,2004.92(4):p,656-63,4.Altieri,D.C.,Targetedtherapybydisablingcrossroadsignalingnetworks:theSURVIVINparadigm.MolCancerTher,2006,5(3):p.478-82.5.Dohi,T.，等，MitochondrialSURVIVINinhibitsapoptosisandpromotestumorigennesis.JClinInvest,2004.114(8):p.1117-27,6.Song，Z.，X.Yao，和M.Wu，DirectinteractionbetweenSURVIVINandSmac/DIABLOisessentialfortheanti-apoptoticactivityofSURVIVINduringtaxol-inducedapoptosis.JBiolChem，2003.278(25):p.23130-40,7.Schultz,I.J.,等,Bladdercancerdiagnosisandrecurrenceprognosis:comparisonofmmarkerswithemphasisonSURVIVIN.ClinChimActa,2006.368(1-2):p.20-32.8.Parker,A.S.，等HighcancerexpressionlevelsofSURVIVINproteinindependentlypredictapooroutcomeforpatientswhoundergosurgeryforclearcellrenalcellcarcinoma.Cancer，2006.107(1):p.37-45.9.Karczmarek-Borowska,B,,等,SURVIVINantiapoptoticgeneexpressionasaprognositicfactorinnon-smallcelllungcancer:insituhybridizationsyudy.FoliaHistochemCytobiol,2005.43(4):p,237-42,10.Zhang，Y.,D.Huang，和G.Yu，SURVIVIVNexprssionanditsrelationshipwithapoptosisandprognosisinnasalandparanasalsinuscarcinomas.ActaOtolaryngol,2005.125(12):p.1345-50.11.LoMuzio，L.，等，SURVVINasprognsticfactorinsquamouscellcarcinomaoftheoralcavity.cancerLett,2005.225(1):p.27-33.12.Zaffaroni，N.，M.Pennati，和M,G.Daidone,SURVIVNasatargetfornewanticancerinterventions.JCellMolMed,2005.9(2):p.360-72.13.Mesri，M,，等，CancergenetherapyusingaSURVIVNmutaneadenovirus.JClinInvest,2001.108(7):p,981-90.14.Tu，S.R，等Genetherapyforcoloncancerbyadeno-associatedviralvector-mediatedtransferofSURVIVINCys84Alamulant.Gastroenterology,2005.128(2):p.361-75.15,Li,F.,等,Pleiotropiccell-divisiondefectsandapoptosisinducedbyinterferencewithSURVIVINfunction.NatCellBiol,1999.1(8):p.461-6.16.Zangemeister-Wittke，U.,Antisensetoapoptosisinhibitorsfacilitateschemotherapyandr緒Z-/油ce"^牟a""g.AnnNYAcadSci，2003.1002:p.90-4.17.Uchida,H.,等,^dewov/nw-zwec/zfl/ec/^a"s^ro/w7A^ag"/wWS[/iK/K/iV/"c/wcedap07^a/s加ewwa^//wwoa*ce〃growAv//rav/vaMolTher，2004.10(1):p.162-71.18.Caldas，H.，等,iWWK/KU/厂ectoi/她/^mcecoctez//&"/她wfswp/m^o/"o//w膨wrg腳A/wv/vaJMedGenet,2006.43(2):p.119-28.19.Pennati，M.，等，i/Zoz>7we-wed//a&(i/w/zz力"/o"o/iSf/iK/F/iVexpre^/ow/"creoyes5po/^a"eowsapopfos/sa"(itfecreaywAe/w附on^w/cpo/^w//"/0//z歸aw/ro加^ca"cerOncogene,2004.23(2):p.386-94.20.Choi,K.S.,T.H.Lee，禾口M.H.Jung，础oz戸e匿膨cfetoic/eav，o///e/w腿wSt/7K/KWw/W」awdzw/nM/owa/7to/o/7/o"'co/5"t/WF7K/7VAfCF-7ce/fe.CancerGeneTher，2003.10(2):p.87-95,21.Pennati,M.,等,W/Zjozy/we-wed/a&t/doww-regw/a"owo/5"L^/F/K/^exprew/owsew5/"ze5/zw附aw附e/"wo附"to鄉o/ec(3T7W/ra/"v/vaCarcinogenesis,2004.25(7):p.1129-36.22.Pennati,M.,等，iad/aye/is7/z'za"owo//w附awwe/awowace〃sZ)ynAozy/we-zwed/a/^i0/SWK/K/A^xpm^o".JInvestDermatol,2003,120(4):p.648-54.23.Sullivan,S.M.，Z)eve/o，ewfo/》/"gewe/fera^y.JInvestDermatol,1994.103(5Suppl):p.85S-89S.24.Haseloff,J.和W丄.Gerlach，S/mpfew///"ewawd/2/g/2(ys;e"ycew^on力owwc/eoseac"v/to.Nature,1988,334(6183):p.585-91.25.Lieber，a.禾口M.Strauss,Se/ec"'o"q/"^7c/eWc/eavagej//^/arge/^/a^san力02yme邵固/ow版哼MolCellBiol，1995.15(1):p.540-51.26.Furue,H.，/7b;o&o膨rase/"///Mo^ydeve/op/"gJ"/a"7.GanToKagakuRyoho，1993.20(1》p.42-9.27.Promega,力""-/^尸/S5Fmgwewf2000，Promga.p.http:〃www.promega.com/tbs/tb273/tb273.pdf.28.Zuker,M.禾卩A,B.Jacobson，t/s//7g/"ybr附a".owa""o^r/eiA^4化co"(ia^Wrwc,wrey.Rna,1998.4(6):p.669-79.29.Tanner,N.K.,i/Z)o^yme&,f/2ec/zarac/en^/os/npe""eyo/i^A^s.FEMSMicrobiolRev,1999,23(3):p,257-75.30.Ame,J,C.,C.Spenlehauer，andG.deMurcia，iM/PBioessays,2004.26(8):p,882-93.31.Che,X.F.,等，Overacpms^/ow0/iSt/7F/K/7///pr/zwa/^爿7Xce〃sawdso力腦ar5e/2"ecfeww-^wto/"gSL^F7「/7V邵r^/o"/"7Xce〃Blood，2006.107(12):p.4880-7.32.McLaughlin,N,，等,7feiSt/iF/K/jV-附^a^rai/omy,-加W//e"o妙eg7/oWa加way^wtoed7/7o4/"/歸ed/Z/zegrm7Zea;o一/^"o/(^匿￡7加//0^"^/《"〃她.BrainRes，2006.1071(1):p.1-9.33.Chawla-Sarkar,M，等，Z)owwgw/a//owo/5c/-2，F丄/尸orZ4ftcmc/SWK/K/A9"7^M^化mteesmy/加W/y/e/awo/Tiace〃sto々a2Zy77^/丄-,Wwcet/a/o//cw、.CellDeathDiffer,2004.11(8》p.915-23.34.Sah，N.K.，等，o/fifowwegw/a"owo/iSL^K/KZ/Vex/ms"owoaracZ/ose^"."//)^/2w即"rfmno/c/c"/r/"om"ce〃s.IntJRadiatOncolBiolPhys，2006.66(3):p.852-9.35.Chang，C.C,，等，7^"-0膨~/woraWz>vircgw"/'are"cac/dgraw/7i"at^s/ce〃w/arapopto^/"础/""ga"c/St/WF/K/ZV邵mys/o".ProcNatlAcadSdUSA,2004.101(36):p,13239-44.36.Sausville，E.A.，J.E.Tomaszewski，禾卩P,Ivy,(ivefo/7附e"f/7-a〃y/am/打o,/7-d^we//zox>^e/^2/"/wycz>7.CurrGancerDrugTargets,2003.3(5):p.377-83.37.Plescia，J.,等,尺ato"a/^/gw0/s/2印/^W"，aAwve/aw".c"wcerage/^.CancerCell，2005.7(5):p.457-68.38.Gyurkocza,B.，等，ac"v/zyo/Wep/zeWwa"t/腳fecw/ard/vera'/y0/"fep卯/"//toonJNatlCance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膜内、口腔、鼻内、肠胃外、鞘内、心室内、静脉内注射的途径给予所述对象。16.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、中枢神经系统癌症、软组织肉瘤、血液的恶性病变、儿童癌症或横纹肌肉瘤。17.如权利要求12所述的方法，其中所述病情是自身免疫疾病或心血管疾病。18.如权利要求17所述的方法，其中所述自身免疫疾病是风湿性关节炎。19.如权利要求17所述的方法，其中所述心血管疾病是肺动脉高血压或动脉硬化症。20.—种能够引起SURVIVIN基因高表达的组织或细胞凋亡的方法，该方法包括给予所述组织或细胞有效量的权利要求1-5任一项所述的合成的或分离的核酶，权利要求6-10任一项所述的载体或权利要求11所述的药物组合物。21.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞是肺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、中枢神经系统癌细胞、软组织肉瘤细胞、血液的恶性病变细胞、儿童癌症细胞、或横纹肌肉瘤细胞。22.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞是人细胞。23.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞是干细胞、祖细胞、骨髓细胞、动脉血管内皮细胞、或子宫内膜细胞。24.—种提高癌细胞对化疗或放疗的敏感性的方法，该方法包括使所述细胞与有效量的权利要求1-5任一项所述的合成的或分离的核酶、权利要求6-10任一项所述的载体或权利要求11所述的药物组合物接触。25.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是肺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、中枢神经系统癌细胞、软组织肉瘤细胞、血液的恶性病变细胞、儿童癌症细胞、或横纹肌肉瘤细胞。26.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是人细胞。27.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是干细胞、祖细胞、骨髓细胞、动脉血管内皮细胞或子宫内膜细胞。28.权利要求l-5任一项所述的合成的或分离的核酶或权利要求6-10任一项所述的载体在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与存活素相关的疾病或与存活素基因表达升高相关的病情。全文摘要本发明涉及用来抑制SURVIVIN在细胞中表达的锤头状核酶为基础的材料和方法，来治疗包括癌症在内的细胞增殖亢进性疾病。文档编号A61P9/10GK101338306SQ20081003736公开日2009年1月7日申请日期2008年5月14日优先权日2008年5月14日发明者朱景德申请人:上海市肿瘤研究所