专利名称：识别增殖性人肝细胞的抗体、增殖性人肝细胞和功能性人肝细胞的制作方法
技术领域：
本申请发明涉及到识别增殖性人肝细胞的抗体和人肝细胞。更详细地讲，本申请发明涉及到特异性识别具有克隆性增殖能力的人肝细胞，对于从人肝细胞组分离增殖性肝细胞有用的单克隆抗体，通过使用该抗体分离的增殖性人肝细胞，将该增殖性人肝细胞分化诱导为分化肝细胞的方法，通过该方法分化诱导的功能性人肝细胞以及备有该功能性人肝细胞的肝细胞试剂盒和体外型人工肝脏。
背景技术：
肝脏具有500多种以上的多种多样的特异功能。作为肝脏的主要功能如血浆蛋白质的合成分泌、通过糖异生和糖原代谢进行血糖调节、脂质合成、尿素合成、胆汁合成分泌、解毒等。
摄入到体内的很多物质在肝脏中代谢。在医药品开发的领域中，医药品候补物质在肝脏受到什么样的代谢，对肝脏和其他脏器或组织有什么样影响等是必需的资料。另外，到目前为止，很多化学物质被合成也释放到环境。阐明这些物质每一个、或复合后对人体有什么样的影响对于社会也是非常重要的，对于这样的化学物质对人体的影响的评价也需要对肝功能的毒性试验。
在以医药品候补物质为首的化学物质的安全性试验和药物代谢试验中，目前可以使用小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。特别在医药品开发中，在进入以人为对象的第一相试验之前，有义务使用动物进行毒性试验和安全性试验，试验需要大量的时间和劳力，投资额也巨大。
然而，通过这些动物实验得到的资料不能保证直接可以应用于人。事实上，在动物实验中认为没有毒性的物质对人表现出毒性的事例很多，而相反的场合也有。因此，到目前为止，很多医药品候补物质在进入以人为对象的第一相试验后处于开发中止，而在动物实验中由于毒性强在进入临床试验前变成开发中止的物质中实际上认为对人没有毒性的个案也存在很多。
人们认为这起因于人的肝脏中的代谢功能和小鼠或大鼠的肝脏的代谢功能不同。最近，已经可以使用人肝细胞进行体外代谢试验或毒性试验了。可是，从通过不能用于移植的脑死亡患者的肝脏或肿瘤摘出等的切除肝得到的人肝细胞的量远远低于需要。因此，人肝细胞的增殖技术的开发在医药品开发中非常必要。
而大量的人肝细胞的必要性在体外型人工肝脏中也同样。人工肝脏是通过人工方式代行肝脏功能的医疗装置，将吸附、透析、过滤等依据物理化学原理的人工作用和通过摘出肝或肝组织的灌流产生的生物学作用组合的杂合型人工肝脏的开发正全力进行着。在进行这样的人工肝脏开发时，在用于使物理化学方面的功能提高的膜或回路的性能提高的同时，可适用于人的大量肝细胞的供给是不可缺的。
然而，人的肝细胞到目前为止一直认为对成熟个体分离的原代细胞进行传代培养是不可能的。即，因为对于粘附依赖性的成熟肝细胞，为了进行该细胞的传代操作从培养基质进行剥离时会造成很大损伤，再使他粘附培养基质更困难。与此相反，本申请发明人发明了从由人肝脏分离的正常肝细胞分离具有克隆性的增殖能力的小型肝细胞，对该小型肝细胞进行原代培养，再将该培养肝细胞进行传代培养之后使肝细胞增殖的方法，获得了专利(特开平08-112092号公报；日本专利第3266766号；美国专利第6,004,810号、特开平10-179148号公报；日本专利第3211941号、特开平7-274951公报；日本专利第3157984号、特开平9-313172号公报；日本专利第3014322号)。另外相关的论文也已经发表(Chise Tateno，and Katsutoshi YoshizatoGrowth and differentiation in culture of clonogenic hepatocytes thatexpress both phenotypes of hepatocytes and biliary epithelial cells.American Journal of Pathology 1491593-1605，1996.Hiroshi Hino，Chise Tateno，Hajime Sato，Chihiro Yamasaki，Shigeru Katayama，Toshihiko Kohashi，Akio Aratani，Toshimasa Asahara，Kiyohiko Dohi，and Katsutoshi YoshizatoA long-term culture of human hepatocyteswhich show a high growth potential and express their differentiatedphenotypes.Biochemical and Biophysical Research Communications256184-191，1999.Chise Tateno，Kaori Takai-Kajihara，ChihiroYamasaki，Hajime Sato，and Katsutoshi YoshizatoHeterogeneity ofgrowth potential of adult rat hepatocytes in vitro.Hepatology 3165-74，2000.Shigeru Katayama，Chise Tateno，Toshimasa Asahara，andKatsutoshi YoshizatoSize-dependent in vivo growth potential of adultrat hepatocytes.American Journal of Pathology 15897-105，2001.)。
这一先前申请专利发明的方法是提供用于在体外使肝细胞增殖，得到大量的人肝细胞的新手段的方法，但存在着在长期传代培养中几种肝功能下降的问题。而该小型肝细胞在以清蛋白表达量、化学物质代谢酶细胞色素P450活性等为指标时，也存在着不能分化为具有与正常肝细胞同等功能的肝细胞(功能性肝细胞)的问题。由于这一原因，虽然作为例如维持肝功能的药剂的筛选体系，或就长期传代培养后仍保存的特定功能进行药剂的毒性或药效进行试验的体系是有用的，但作为代替人肝功能的肝细胞，或作为杂合型人工肝脏的材料还存在不充分的地方。
而具有增殖能力的小型肝细胞除了使用上述以前申请发明记载的那样的离心分离的方法(对低速离心分离的上清中的细胞进行分离的方法)之外，也可以通过淘析器或FACS等细胞分级装置採取。通过这样手段得到的细胞不只是增殖性肝细胞，而是与其他细胞(例如，在低速离心得到的上清含有的星形细胞等非肝实质细胞)的混合物。因此，需要可以实质上只获得增殖性人肝细胞的手段。
本申请发明就是借鉴以上那样的事情做成的发明，将提供特异性识别增殖性人肝细胞的单克隆抗体作为课题。
另外，本申请发明将提供增殖性人肝细胞的分离方法，以及通过该方法得到的增殖性人肝细胞作为课题。
另外，本申请发明将提供使增殖性人肝细胞分化诱导为功能性人肝细胞的方法，利用该方法得到的功能性人肝细胞以及功能性人肝细胞的利用作为课题。
发明内容
作为用于解决上述课题的第1发明，本申请提供特异性识别增殖性人肝细胞的单克隆抗体。第1发明的单克隆抗体的一个例子是小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的单克隆抗体。
作为第2发明，提供产生第1发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞的一个例子是小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)。
作为第3发明，提供增殖性人肝细胞的分离方法，其特征是由人肝细胞组分离上述第1发明的单克隆抗体识别的细胞。
作为第4发明，提供用上述第3发明的方法分离的增殖性人肝细胞。
另外作为第5发明，提供增殖性人肝细胞的分化诱导方法，该方法是分化诱导上述第4发明的增殖性人肝细胞的方法，其特征是至少进行以下手段中的一方。
(a)增殖性人肝细胞的球体培养；以及(b)向增殖性人肝细胞导入肝细胞核因子4(HNF4)基因作为第6发明，提供用上述第5发明的方法分离的功能性人肝细胞。
另外作为第7发明，提供含有上述第6发明的功能性人肝细胞的细胞试剂盒。
另外作为第8发明，提供充填了上述第6发明的功能性人肝细胞的杂合型人工肝脏。
而在本发明中所谓的「增殖性人肝细胞」指的是在培养条件下(invitro)，形成作为单一细胞种群的集落，进行增殖使集落增大的人肝细胞。另外，其增殖在集落构成细胞是单一种类这一点上，有时也称之为「克隆性增殖」。另外，这样细胞是通过传代培养可以进一步增加细胞数的细胞。
而在本发明中所谓「功能性肝细胞」指的是在人体内(in vivo)或原代培养(in vitro)的具有与正常肝细胞同等程度功能的细胞，更具体指的是至少「清蛋白表达量」以及「细胞色素P450活性」实质上与正常细胞同等。
本发明中的其他用语和概念在发明的实施方式的说明和实施例中有详细的规定。另外为了实施本发明使用的各种各样的技术，除了明确给出其资料的技术外，只要是同行根据众所周知的文献都可以容易而且确实地实施。例如，本发明的基因工程和分子生物学技术在Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Sping Harbor Laboratory Press，New York，1989；Ausubel，F.M.etal.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，N.Y，1995等有记载。
附图的简单说明
图1是对由不同年龄患者採取的肝细胞进行培养时的增殖曲线。
图2是为了制作单克隆抗体，作为抗原使用的培养人肝细胞的相差显微镜图像。
图3是通过荧光抗体染色观察到的杂交瘤K8223培养上清在人肝组织中的反应性的图像。
图4是通过FACS对杂交瘤培养上清No.23在刚分离的人肝细胞表面的反应性进行解析的结果。
图5是分别收集、培养与杂交瘤培养上清No.23反应的细胞组(R2)和不反应的细胞组(R3)时的相差显微镜图像。
图6是通过FACS对杂交瘤培养上清No.23在传代培养人肝细胞表面的反应性进行解析的结果。
图7是单层培养和球体培养的肝细胞分别在培养第1天(上段)和第7天(下段)的相差显微镜图像。
图8是表示在从人肝脏刚分离的肝细胞、单层培养的传代培养肝细胞、以及球体培养的肝细胞的各个细胞中人型P450基因或GAPDH基因表达量的曲线图。
图9是表示单层培养和球体培养的肝细胞的清蛋白分泌量随时间的变化的曲线图。
图10是表示在导入了HNF4基因的培养人细胞中人型P450基因的表达量的曲线图。
具体实施例方式
第1发明的单克隆抗体其特征是特异性识别形成集落的同时增殖的人肝细胞。更详细地讲，该单克隆抗体其特征是特异性识别形成集落的同时增殖，而且可向功能性人肝细胞分化的人肝细胞。此时的所谓「特异性识别」指的是只与上述的人肝细胞结合，而不与其他细胞和/或不具有上述特征的人肝细胞结合。
第1发明的单克隆抗体是可以通过众所周知的方法从本申请第2发明的杂交瘤细胞获得。杂交瘤细胞和单克隆抗体可以根据众所周知的单克隆抗体制作方法(「单克隆抗体」，长宗香明、寺田弘共著、广川书店、1990年；“Monoclonal Antibody”James W.Goding，thirdedition，Academic Press，1996)，按照例如以下步骤制作。
1杂交瘤细胞的制作用含有传代培养的人正常肝细胞的免疫原免疫哺乳动物，根据需要可以适当进行追加免疫，对动物充分致敏。然后从该动物中摘出抗体产生细胞(淋巴细胞或脾脏细胞)，获得该细胞与骨髓瘤细胞株的融合细胞。然后从这些融合细胞中选择产生目的单克隆抗体的细胞，通过培养可以得到杂交瘤细胞。以下对各工序进行详细说明。
a)免疫原的制备对通过胶原酶从正常肝组织分离到的人肝细胞进行传代培养，作为免疫原。人肝细胞优选使用可进行4次以上，优选是6次以上传代的，例如从15岁以下的人肝组织分离的肝细胞。
b)动物免疫作为被免疫动物，可以使用众所周知的在杂交瘤制作法中使用的哺乳动物。具体来说，如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马等。但从与摘出的抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞容易取得等观点考虑，优选使用小鼠或大鼠作为被免疫动物。而实际使用的小鼠和大鼠的系统没有特别限制，使用小鼠时，可以使用例如各系统A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB、129等，使用大鼠时可以使用例如Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。其中如果考虑到与下述的骨髓瘤细胞的融合适合性，小鼠的BALB/c系统，大鼠的Low系统作为被免疫动物特别合适。另外这些小鼠或大鼠在免疫时的周龄优选为5～12周龄。
动物的免疫可以通过将作为免疫原的传代人肝细胞约104～108个注射到动物的皮下或腹腔内进行。免疫原投给的程序因被免疫动物的种类、个体差异等而有所不同，一般来说，投给免疫原次数为1～6次，多次投给时投给间隔优选为1～2周。
c)细胞融合在无菌条件下从上述投给程序的最终免疫日后1～5日的被免疫动物取出含有抗体产生细胞的脾脏细胞或淋巴细胞。可以根据众所周知的方法从这些脾脏细胞或淋巴细胞分离抗体产生细胞。
然后，对抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行融合。对于骨髓瘤细胞没有特别限制，可以从众所周知的细胞株中选用合适的。但考虑到从融合细胞选择杂交瘤时的便利性，优选使用其选择已经确立的HGPRT(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺损株。即，来自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS-1)、P3X63-Ag8、U1(P3U1)、X63-Ag8、653(X63.653)、SP2/O-Ag14(SP2/O)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO，BU.1等，来自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等，来自人的U266AR(SKO-007)、GM1500.GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。
抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的融合根据众所周知的方法可以在不使细胞存活率极度降低的条件下适宜实施。这样的方法如可以使用在聚乙二醇等高浓度聚合物溶液中对抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行混合的化学方法，利用电刺激的物理方法等。
融合细胞和非融合细胞的选择优选是通过例如众所周知的HAT(次黄嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷)选择法进行。该方法在使用在氨甲蝶呤存在下不能存活的HGPRT缺损株的骨髓瘤细胞获得融合细胞时是有效的。即，通过将未融合细胞和融合细胞在HAT培养基培养，有选择地保留了对氨甲蝶呤具有抗性的融合细胞，而且可以使其增殖。
d)杂交瘤的筛选对产生目的单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选可以通过众所周知的酶免疫检定法(EIAEnzyme Immunoassay)、放射线免疫测定法(RIARadio Immunoassay)、荧光抗体法等进行。
通过这样筛选，可以得到分别产生与具有高增殖能力的人肝细胞特异结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞群。
而筛选后的杂交瘤可以通过甲基纤维素法、软琼脂糖法、有限稀释法等众所周知的方法进行筛选，用于产生抗体。
通过象以上那样方法得到的杂交瘤细胞可以在液氮中或-80℃以下的冷库中以冷冻状态保存。作为这样的杂交瘤细胞的具体例子，本申请提供小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)。
2单克隆抗体的获得和纯化通过用众所周知的方法对上述1制作的杂交瘤细胞进行培养，可以获得只与增殖性人肝细胞特异结合的单克隆抗体。
培养，可以在例如上述克隆法中使用的同样组成的培养基中进行培养，或为了使单克隆抗体大量生产，也可以向小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，从腹水中棌取单克隆抗体。
这样得到的单克隆抗体可以通过硫铵盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等进行纯化。
作为杂交瘤的具体例子，本申请提供上述杂交瘤细胞小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)，而作为单克隆抗体的具体例子，提供杂交瘤细胞小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的单克隆抗体。
第3发明是增殖性人肝细胞的分离方法，其特征是从人肝细胞组分离收集上述第1发明的单克隆抗体识别的细胞。人肝细胞组可以通过例如胶原酶灌流法等众所周知的方法从人肝脏中分离，可作为置于培养条件下的原代细胞、或对原代细胞进行1～8次传代培养的传代细胞。或者，该人肝细胞组也可以是本申请发明人提出的专利发明(特开平08-112092号公报；日本专利第3266766号；美国专利第6,004,810号、特开平10-179148号公报；日本专利第3211941号、特开平7-274951公报；日本专利第3157984号、特开平9-313172号公报；日本专利第3014322号)中的「含有小型人肝细胞的细胞组」。即，在这些专利发明中的小型人肝细胞中包括星形细胞等非实质肝细胞、以及用于小型人肝细胞的培养以及传代培养共培养的Swiss 3T3细胞等。通过使用第1发明的单克隆抗体，可以从这样的细胞组更有效地对增殖性人肝细胞进行分离。
增殖性肝细胞的分离可以通过使用酶、放射性同位素、磁株、或荧光色素等标记的单克隆抗体接触上述的人肝细胞组，分离发出标记信号的细胞进行。在该方法中，由于在离心分离或细胞分级装置等中几乎没有细胞负荷，所以可以以几乎无损伤的状态获得增殖性人肝细胞。而作为标记使用的酶只要满足转换数大、与抗体结合也稳定、使底物特异着色等条件的酶，没有特别限制，通常的EIA中使用的酶，例如可以使用过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。另外也可以使用酶抑制物质或辅酶等。这些酶和抗体结合可以通过使用马来酰亚胺化合物等架桥剂的众所周知的方法进行。作为底物可以根据使用的酶的种类使用众所周知的物质。例如作为酶使用过氧化物酶时，可以使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，而作为酶使用碱性磷酸酶时，可以使用对硝基苯酚等。作为放射性同位素可以使用125I或3H等通常RIA中使用的同位素。作为荧光色素可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明荧光素(TRITC)等通常在荧光抗体法中使用的荧光色素。另外，标记信号的检测在使用酶时加由于酶分解作用而发色的底物，通过对底物的分解量进行光学测定，求酶活性，将其换算为结合抗体量，从与标准值的比较可以算出抗体量。使用放射性同位素时，通过闪烁扫描计数器等测定放射性同位素发出的放射线量。而在使用荧光色素时，可以通过组合了荧光显微镜的测定装置测定荧光量。
通过以上方法，可以得到本申请的第4发明的「增殖性人肝细胞」。该增殖性人肝细胞在培养条件下形成集落的同时增殖活跃，另外也是具有向功能性人肝细胞分化能力的细胞。这样的功能性人肝细胞可以通过第5发明的方法由增殖性人肝细胞进行分化诱导。另外，增殖性人肝细胞也可以通过作为实施例1的单克隆抗体制作时作为免疫原使用的人肝细胞的获得方法得到，但在该实施例1的方法的情形中也有可能含有非增殖性细胞。使用本发明的单克隆抗体的方法是在实质上可以只分离增殖性人肝细胞方面的优越的方法。
第5发明的方法其特征是进行以下手段(a)或(b)，或(a)和(b)。(a)增殖性人肝细胞的球体培养所谓「球体」指的是数百个细胞集合后形成组织构造的细胞的集合体。具体来说，通过以下所示的方法使细胞成为3维的细胞组，在动物细胞培养基中对细胞组进行培养。作为获得球体的众所周知的方法，如在基底膜(MATRIGELTMMatrix、ベクトン·デイツキンソン)、正负荷的培养器(プライマリア、ベクトン·デイツキンソン)、U底培养器(スフエロイド·MS？0096S、スミロン)上的培养或通过滚瓶的回转培养等。可以培养6～15日左右。(b)肝细胞核因子4(HNF4)向增殖性人肝细胞的导入肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor 4HNF4)是与在肝细胞中表现出特异功能的基因转录有关的蛋白质(例如，Bell，G.I.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88(4)1484-1488，1991)、人HNF4a的序列已众所周知(例如，GenBank/NM_000457)。还有HNF4 b(GenBank/X87871)、HNF4c(GenBank/X 87872)的cDNA序列也都众所周知。另外小鼠HNF4 cDNA(GenBank/NM_08261)、大鼠HNF4 cDNA(GenBank/X 57133)等也都众所周知。因此，将这些众所周知的HNF4 cDNA重组到真核细胞表达载体中，将该载体通过例如电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖等众所周知的方法导入到增殖性人肝细胞，可以导入HNF4基因。或者，通过依据使用例如对生物体识别分子进行提示的中空纳米粒子、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒等基因疗法(ex vivo)的方法也可以导入HNF4基因。HNF4基因cDNA可以通过使用根据那些已知序列制作的探针，对人等的cDNA文库进行筛选获得。得到的cDNA可以通过例如PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBN(Nucleic acid sequencebased amplification)法、TMA(Transcription-mediated amplification)法以及SDA(Strand Displacement Amplification)法等通常进行的基因扩增法进行扩增。通过使用根据已知序列做成的引物组，以从哺乳动物细胞分离的mRNA为模板的RT-PCR(ReverseTranscriptase-PCR)法也可以获得充足量的目的cDNA。
通过以上的分化诱导方法，就象下面实施例所示的那样，可以得到与人体内或原代培养中人正常细胞同等程度的功能性，具体来说具有充足量的清蛋白表达和细胞色素P450活性的第6发明的功能性肝细胞。另外，通过以上分化诱导产生的功能性人肝细胞也可以用例如与在下面实施例1中制备免疫原人肝细胞的方法同样的方法得到的传代培养细胞(形成集落，可传代培养的肝细胞)实施。但是，在这样的传代培养细胞中也有可能包含非增殖性细胞。
通过使用用以上方法得到的第6发明的功能性人肝细胞，可以提供在药物代谢试验和安全性试验等中使用的人肝细胞试剂盒(第7发明)以及杂合型人工肝脏(第8发明)。另外使用在杂合型人工肝脏中使用的模件(充填人肝细胞的模件)，可以回收人肝细胞生产的有用物质。
众所周知肝细胞试剂盒根据细胞的种类和用途有各种各样，只要是同行，通过采用第6发明的人肝细胞和众所周知的细胞试剂盒的构成，可以很容易制作第7发明的细胞试剂盒。另外模件和混杂型人工脏器的构成也众所周知，只要是同行可以很容易制作第8发明的人工肝脏等。
实施例以下给出实施例，对本申请发明进行详细而且具体的说明，但本申请发明并不限定于以下例子。
1.人肝细胞的培养通过胶原酶灌流法从人肝脏组织得到细胞分散液。将细胞分散液经低速离心分离(50g，2分钟)，将该沉淀级分用添加了胎牛血清、人血清、EGF、尼克酰胺、活性持续型维生素C的Dulbecco’s modifiedEagle’s medium(DMEM)，与经丝裂霉素C处理后的Swiss 3T3细胞进行混合培养。Swiss 3T3细胞每10日添加一次。从培养第7天时开始观察到人肝细胞的集落。将增殖到铺满的肝细胞用EDTA/Trypsin进行传代。传代如用小孩的肝细胞可以传代6-9次，而60岁以上的患者的肝细胞只能传代3-4次(图1)。将表现出更高增殖能力的小孩(12岁)的肝细胞用作抗原(图2)。
2.动物的免疫利用上述方法，在培养皿上使3-5次传代培养的小孩(12岁)肝细胞增加。将增殖至铺满的细胞(约1×107个)用PBS(磷酸缓冲盐类溶液)洗净后，除去PBS，用细胞刮棒搅和回收，悬浮于约1ml PBS中。然后将他注入6周龄的Balb/c鼠的腹腔内。再于20天后或30天后用同样方法进行免疫。
3.细胞融合经2次免疫后，看到抗体效价上升，第3次免疫(boost)72小时后，从1只免疫动物摘出脾脏，採取脾脏细胞。对该脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞(细胞名NS-1)进行细胞融合，向96孔板播种372孔进行培养。
4.杂交瘤的筛选1次筛选(ELISA、组织染色)通过ELISA测定得到的融合细胞的培养上清对抗原的反应性。测定通过以下方法实施。将作为抗原使用的传代培养肝细胞播种到96孔板，培养后用PBS洗净，使其干燥，预先保存在-80℃下，使培养上清与其反应。然后使酶标记的抗鼠IgG或抗鼠IgM抗体反应，加入底物，发色，测定其吸光度。结果融合细胞372个样品的吸光度的平均值为0.149(SD0.099)，将其中吸光度在0.20以上(81个样品，约20％)的样品作为阳性。另外由于通过目视，即使吸光度为0.15以上也可确认发色，所以对于0.15～0.20的样品(46个样品)进行组织染色确认了反应性。只将其中感兴趣的表现出深染色带的13个样品作为阳性样品。对选择的阳性样品94个样品进行扩大后进一步培养，回收培养上清后，将细胞冷冻保存。
5. 2次筛选(ELISA、组织染色)通过与1次筛选同样的ELISA测定由在1次筛选中选择的94样品扩大后的培养上清对抗原的反应性，选择阳性样品88个样品。再通过组织染色研究这些样品在组织中的反应性。就其中含有与肝细胞的细胞膜或门静脉区的肝细胞特异反应的杂交瘤的样品，或通过从其中克隆得到的集落的培养上清对刚分离的人肝细胞的反应性进行研究。
就组织中门静脉区的肝细胞膜染色的杂交瘤培养上清N0.23在刚分离的肝细胞表面中的反应性使用FACS(Fluorescence activated cellsorting)进行解析。通过用该样品的培养上清对通过胶原酶灌流、低速离心从成年人男性(46岁和49岁)的肝脏得到的细胞在4℃下处理30分钟，然后于4℃下进行30分钟的FITC标记的抗鼠IgG抗体处理，可用FACS进行检测。结果发现肝细胞组的一部分(1～2％)细胞与该样品反应(图4)。在此，将这些细胞组作为R2收集，没有反应的细胞组作为R3收集，进行培养。另外，分类收集前的肝细胞也同样进行培养。结果在分类收集前的肝细胞中，就象上述那样，从培养到第7天时观察到集落形成。而在R3级分中没有观察到形成集落的细胞，在与No.23反应的R2级分中，观察到许多集落(图5)。另外，通过FACS对传代培养人肝细胞的反应性进行研究时，约80％的细胞呈阳性(图6)。即，认为不识别传代培养人肝细胞当中在培养过程中分化的细胞，只识别增殖性肝细胞。由此表明，在No.23中可能含有特异性识别形成集落的细胞的杂交瘤。就通过克隆从No.23样品得到的集落也利用FACS对在刚分离的肝细胞表面的反应性进行解析。结果得到3个表现出同样反应性的克隆。将来自其中的一个克隆(小鼠-小鼠杂交瘤K8223)作为专利生物于2002年3月6日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(委托号FERM P-18752)，另外于2003年3月20日进行了国际保藏(委托号FERM BP-8334)。
6.单克隆抗体的制作通过培养上述的杂交瘤(K8223株)细胞，再将杂交瘤细胞注射到鼠腹腔内，通过从腹水採集单克隆抗体，得到与增殖性人肝细胞特异结合的单克隆抗体。
实施例2增殖性人肝细胞的分离使用实施例1得到的单克隆抗体，从通过胶原酶灌流法从人肝组织分离的人肝细胞组分离增殖性人肝细胞。具体来说，用实施例1得到的单克隆抗体对通过胶原酶灌流、低速离心从人肝脏组织得到的细胞于4℃下处理30分钟，然后于4℃下进行30分钟FITC标记鼠IgG抗体处理，用FACS检测反应。将与该抗体反应的细胞组作为R2收集，没有反应的细胞组作为R3收集，用与实施例1.1同样的方法进行培养。另外分别收集前的肝细胞也同样进行培养。结果在分别收集前的肝细胞中，从培养到第7天时开始观察到集落形成，但也观察到了没有形成集落的肝细胞。而在R3级分中没有观察到形成集落的细胞，在与该单克隆抗体反应的R2级分中，观察到许多集落。由以上结果可以确认通过使用本发明的方法可以有效地从分离肝细胞组分离增殖性肝细胞。
实施例3球体形成导致增殖性人肝细胞的分化诱导1.肝细胞的球体形成将实施例2得到的增殖性人肝细胞播种到基底膜(MATRIGELTMMatrix、ベクトン·デイツキンソン)上，每1cm21×105个，于添加了胎牛血清、EGF、活性持续型维生素C的DMEM培养基中培养。肝细胞在培养第1天于基底膜上形成球体(图7上段)。
2.人型P450基因表达的解析将培养人肝细胞播种到基底膜上后，于第7天(图7下段)回收球体。从该球体提取总RNA，通过逆转录反应合成cDNA。合成对应于6种人型P450分子(CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4)的各个基因cDNA的引物，用PRISM 7700 Sequence Detector(ABIPRISMTM公司)，对各个mRNA的表达量进行定量。另外，从人肝脏刚分离的肝细胞和单层培养的增殖性人肝细胞也同样，对P450基因表达进行定量。
结果确认球体培养的肝细胞与单层培养的肝细胞相比，各种人型P450的基因表达高。另外一部分人型P450基因表现出与刚分离的正常人肝细胞同等程度的P450基因表达(图8)。
3.清蛋白分泌量的解析每3日回收一次球体培养的肝细胞和单层培养的肝细胞的各个培养上清，用定量ELISA分析(Bethyl Laboratories Inc.)测定培养基中的人清蛋白浓度。
结果与单层培养的肝细胞比较，球体培养的肝细胞在培养第6天以后表现出高的清蛋白分泌量(图9)。
4.P450酶活性的解析从球体培养开始后第22天向培养基中添加盐酸(500μg/ml)利多卡因，温育24小时。回收培养基，通过HPLC测定培养基中的利多卡因代谢产物MEGX量。对于单层培养的肝细胞也进行同样的测定。
结果在单层培养的肝细胞的培养基中没有检测到MEGX，但在球体培养的肝细胞的培养基中检测到了MEGX(8.3μg/ml/24小时、1.7μg/105cell/24小时)，由此结果确认球体培养的肝细胞具有P450酶活性(化学物质代谢酶活性)。
实施例4
通过HNF4基因导入进行增殖性人肝细胞的分化诱导1.基因导入在培养第1天通过腺病毒载体(Q·BIO gene公司)以感染复数(MOI)0、1、5、10、20、50、100的比例使人HNF4αcDNA(GenBank/X87870)感染实施例2得到的增殖性人肝细胞。
2.人型P450基因表达的解析回收腺病毒感染后第7天的细胞，与实施例3-2同样对各种人型P450基因的表达量进行定量。
结果确认人型P450基因的表达量增加依赖于感染量(图10)。
产业上利用可能性就象以上详细说明的那样，通过本申请发明提供特异性识别具有增殖性的人肝细胞的单克隆抗体，通过使用该抗体分离的增殖性人肝细胞，通过对该细胞进行分化诱导得到的功能性人肝细胞。
权利要求
1.一种特异性识别增殖性人肝细胞的单克隆抗体。
2.权利要求1的单克隆抗体，其是由杂交瘤细胞小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的。
3.一种产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
4.权利要求3的杂交瘤细胞，是小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERMBP-8334)。
5.一种增殖性人肝细胞的分离方法，其特征是从人肝细胞组分离通过权利要求1或2的单克隆抗体识别的细胞。
6.一种用权利要求5的方法分离的增殖性人肝细胞。
7.一种增殖性人肝细胞的分化诱导方法，是分化诱导权利要求6的增殖性人肝细胞的方法，其特征是至少进行以下手段中的一种，(a)增殖性人肝细胞的球体培养；以及(b)向增殖性人肝细胞导入肝细胞核因子4(HNF4)基因。
8.一种用权利要求7的方法分化诱导的功能性人肝细胞。
9.一种含有权利要求8的功能性人肝细胞的细胞试剂盒。
10.一种充填了权利要求9的功能性人肝细胞的杂合型人工肝脏。
全文摘要
本申请发明提供特异性识别形成集落的同时增殖的人肝细胞的单克隆抗体、用该抗体分离人肝细胞的方法、将分离的增殖性人肝细胞分化诱导为功能性人肝细胞的方法。另外本申请的方法提供通过上述方法获得的增殖性人肝细胞和功能性肝细胞，以及含有该细胞的细胞试剂盒以及杂合型人工肝脏。
文档编号C07K16/18GK1642981SQ0380698
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月25日 优先权日2002年3月25日
发明者向谷知世, 吉里胜利, 山崎千寻 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构, 财团法人广岛县产业振兴机构