专利名称：Non-B Ig单抗RP215在细胞增殖、迁移及干细胞研究中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性识别人Non-B Ig重链可变区的单克隆抗体RP215在判定细胞在增殖、迁移、化疗药物抗性及识别肿瘤/成体干/祖细胞方面的应用，对提高临床和实验室对肿瘤细胞恶性度及转移 的判定、指导临床治疗及对肿瘤/成体干/祖细胞的深入研究具有重要的应用价值。
背景技术：
一、非B细胞免疫球蛋白研究现状传统的免疫学理论认为免疫球蛋白基因仅在B淋巴细胞发育过程中进行选择性重排，故免疫球蛋白是B淋巴细胞的特征性产物。但1996年，邱晓彦等通过免疫组化、Western Blot等发现在多种上皮性恶性肿瘤细胞的胞浆中存在与免疫球蛋白抗原性相同且分子结构相似的蛋白分子，而其它正常上皮细胞均为阴性反应(中国免疫学杂志；1996，5 :296);随后邱晓彦等又分别从蛋白水平和mRNA水平证实Ig分子在非B细胞来源的肿瘤细胞中表达；并且发现应用Ig特异的反义寡核苷酸以及抗Ig抗体都可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其生长(CANCER RESEARCH 63,6488-6495, October 1,2003) 目前，我们课题组对于肿瘤来源Ig生物学活性的研究已有了很大发展。我们的研究发现，体外利用ASODN或抗人IgG抗体来抑制肿瘤来源IgG可增加细胞程序性凋亡，抑制细胞生长。在裸鼠体内实验中，抗人IgG抗体可以抑制分泌IgG的癌细胞系HelaMR的生长。而且，不只是肿瘤细胞，一些增殖旺盛的上皮细胞也会表达Ig，增生的乳腺细胞、肝硬化中增殖的肝细胞和癌巢周围的上皮组织中均有Ig分布。在癌前病变中Ig的表达出现上调，说明肿瘤细胞分泌的Ig可能对癌症的发生有重要作用，具有促进肿瘤细胞生长和维持其生存的作用。目前上述发现已经得到国内外几个课题组的证实和认可(Cancer Res, 2006. 66 (8) p. 3996-4000 ；CancerBiomark. , 2009. 5 (4) p. 177-188)。但在过去的10年里，我们课题组及其他的课题组都应用以循环血Ig分子作为免疫原制备的单克隆或多克隆抗体(商品化)，通过免疫组化、Western blot等方法发现了 Ig分子、特别是IgG分子在多种非免疫细胞来源的肿瘤组织及一些正常组织细胞中高表达。但用该类抗体没有发现IgG在正常组织中上皮的基底细胞及胆管上皮细胞等具有强分裂能力及迁移能力的细胞及肿瘤肝细胞中高水平表达，并参与细胞迁移及干细胞的功能。二、RP215来源及研究现状加拿大英属哥伦比亚大学的Lee课题组早在上个世纪80年代，为了获得特异性识别卵巢癌的单克隆抗体，曾用卵巢癌细胞系提取的蛋白免疫动物，获得了近3000株杂交瘤细胞，在筛选的过程中发现，其中有一株杂交瘤细胞，称之为RP215，能够很好地识别卵巢癌细胞而不识别正常卵巢细胞，但当时不清楚其所识别的抗原是什么，暂取命名为“CA215”。后来发现，RP215不但能够很好地识别卵巢癌，同时在对其它类型的肿瘤细胞识别中也显示了良好的特异性，由此将CA215定义为“pan-cancer marker”。2007年，Lee课题组对CA215进行了鉴定。他们用亲和层析的方法，从卵巢癌细胞系培养上清中获得了大量的“CA215”，质谱鉴定所提供的32条肽段均为IgG的重链，为了进一步确认这一结果，他们又用纯化的“CA215”作为抗原制备了 5株特异性单抗，实验结果证实，所有5个单抗都识别IgG分子(Cancer Biol Ther, 2008. 7 (12) :ρ· 2007-14.)。至此，证明了 CA215 就是癌胞表达的IgG (Cancer Biol Ther. , 2009. 8 (2) p. 161-6)。随后的结果证实,癌细胞表达的IgG在糖基化修饰与循环中IgG有明显差异。RP215所识别的表位正是这类IgG重链可变区特有的糖基类相关表位。尽管已有报道RP215可用于临床肿瘤病人的血清检测(Cancer Biomark.,2009.5(4) p. 177-88.)，但这种抗体在判定细胞在增殖、迁移、化疗药物抗性及识别肿瘤/成体干细胞方面的应用还没有报道。三、成体/肿瘤干细胞研究背景在成年个体，不同分化成熟的器官都存在少量的多潜能细胞以更新和替代衰老及凋亡的细胞，维持组织器官的新陈代谢，这类细胞具有自我更新(self-renewal)的能力。但它们不具有胚胎干细胞的全潜能性，只能定向地分化为有限的几种特定组织类型细胞，具有多潜能或单能的特性，如皮肤的基底细胞及精原细胞，统称之为成体干细胞。一般认 为，正常乳腺中的大部分导管上皮及乳腺小叶的基底细胞/肌上皮及其腺上皮细胞都具有乳腺干细胞或乳腺祖细胞(由乳腺干细胞分化的、但还没有分化为成熟乳腺上皮细胞的所谓“过渡型增殖细胞”或“中间细胞”)特性，另外，有研究发现，正常乳腺干细胞及肌上皮细胞普遍表达角蛋白5分子；肺组织中的支气管上皮中基底细胞、外分泌腺的基底细胞及肝脏组织中的胆小管上皮细胞都属于成体干细胞或祖细胞。尽管成体干细胞的研究已有了很大发展，但迄今仍然还没有发现理想的成体干细胞的分子标志，这大大影响了对于成体干细胞的深入研究。目前肿瘤干细胞的研究也是生命科学领域研究的热点，Reya等提出的肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量瘤细胞充当干细胞的角色，具有无限增生的潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，而其余的大多数细胞，则经过短暂的分化，最终死亡(Nature, 2001. 414(6859) :ρ· 105-11)。近年的研究已报道，在白血病、脑肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、头颈部肿瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌和肝癌等恶性肿瘤中均成功分离出肿瘤干细胞，为这一理论提供了强有力证据(Curr Opin Genet Dev,2009. 19(1) :ρ. 44-50)。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)是存在于肿瘤组织中具有干细胞样能力的肿瘤细胞亚群，CSCs与成体干细胞类似，也应具有自我更新的特性，CSCs既具有肿瘤细胞的特征又具有干细胞的特征，一个肿瘤干细胞能够产生整个肿瘤组织的(处于不同分化阶段的)所有肿瘤细胞。迄今，肿瘤干细胞具有自我更新和分化能力从而形成整个瘤体，被认为是肿瘤产生的根源。肿瘤干细胞具有很高的移动和迁移能力，从而使肿瘤一开始就有转移能力，是临床恶性肿瘤病情恶化的重要原因。研究表明CSCs高表达多药耐药蛋白，可以将化疗药物泵出，导致化疗后CSCs仍然存活，这可能是肿瘤耐药、转移、复发的重要机制。标准化疗和放疗能显著缩小肿瘤体积，但对肿瘤干细胞几无作用，这被认为是肿瘤复发的根源。因此，针对CSC治疗肿瘤是以后治疗肿瘤的重点。目前，在血液肿瘤、乳腺癌、脑肿瘤及前列腺癌中，CSC研究取得了一定的进展，但多数实体瘤都缺乏肿瘤干细胞特异性标志。只是⑶44(v6)分子作为乳腺癌干细胞标志物初步得到大家认可。四、实验方法与原理
I、免疫组化，是应用免疫学基本原理一抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H. E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50% -75%。
2、流式细胞术(Flow CytoMeter, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞术综合了光学，电子学，流体力学，细胞化学，免疫学，激光和计算机等多门学科和技术，既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。3、MTT 法介绍又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。4、细胞划痕实验介绍是指将细胞培养在培养皿或平板上，待细胞融合后用细胞刮在中央区域画一条线，这条线内的细胞被机械力去除掉了，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断细胞的迁移能力。
发明内容
本申请的发明人发现，非B细胞表达的IgG在糖基化修饰与循环中IgG有明显差异。RP215所识别的表位正是这类IgG重链可变区特有的糖基类相关表位。本发明在前期研究的基础上，以特异性识别人Non-B Ig重链可变区的单克隆抗体RP215为主要工具，利用免疫组化和流式细胞术，探讨了高表达Ig与低表达Ig的两群细胞在增殖、迁移和化疗药物抗性方面的差别，发现IgG主要高水平表达在多潜能干/祖细胞中和那些细胞体积小、形态近乎正常细胞，不呈现细胞体积大、核异质等典型肿瘤干细胞中，IgG的表达与细胞增殖、迁移和化疗药物抗性密切相关，也符合干/祖细胞的特点。本发明的方案在提高对判断肿瘤细胞在增殖、迁移和化疗药物抗性能力及识别干/祖细胞方面具有重要的应用价值。本发明的方案除了可以应用于临床工作，还可以应用于科研工作(非临床应用)，例如对科研工作中工具细胞进行鉴定等。本发明的方案能有效判定肿瘤细胞在增殖、迁移、化疗药物抗性及有效地识别成体/肿瘤干/祖细胞。已有研究发现，肺组织中的支气管上皮中基底细胞、外分泌腺的基底细胞及肝脏组织中的胆小管上皮细胞都属于成体干细胞或祖细胞。尽管成体干/祖细胞的研究已有了很大发展，但迄今仍然还没有发现理想的成体干/祖细胞的分子标志，这大大影响了对于成体干/祖细胞的深入研究。目前肿瘤干细胞的研究也是生命科学领域研究的热点，肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)是存在于肿瘤组织中具有干细胞样能力的肿瘤细胞亚群，CSCs与成体干细胞类似，也应具有自我更新的特性，CSCs既具有肿瘤细胞的特征又具有干细胞的特征，一个肿瘤干细胞能够产生整个肿瘤组织的(处于不同分化阶段的)所有肿瘤细胞。迄今，肿瘤干细胞具有自我更新和分化能力从而形成整个瘤体，被认为是肿瘤产生的根源。肿瘤干细胞具有很高的移动和迁移能力，从而使肿瘤一开始就有转移能力，是临床恶性肿瘤病情恶化的重要原因。研究表明CSCs高表达多药耐药蛋白，可以将化疗药物泵出，导致化疗后CSCs仍然存活，这可能是肿瘤耐药、转移、复发的重要机制。目·前，在血液肿瘤、乳腺癌、脑肿瘤及前列腺癌中，CSC研究取得了一定的进展，但多数实体瘤都缺乏肿瘤干细胞特异性标志。因此，本发明的目的在于提供一种应用于临床和实验室判定细胞在增殖、迁移、化疗药物抗性及识别成体/肿瘤干/祖细胞方面的试剂盒。本发明可以以下列形式实现提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在临床和科研工作中检测干/祖细胞的应用。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在判定细胞增殖方面的应用，所述的细胞为正常乳腺上皮细胞、支气管上皮细胞、腺上皮细胞、胆小管上皮细胞或乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、急性髓系白血病细胞。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在判定细胞迁移方面的应用，所述的细胞为正常乳腺上皮细胞、支气管上皮细胞、腺上皮细胞、胆小管上皮细胞或乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、急性髓系白血病细胞。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在判定肿瘤细胞化疗药物抗性方面的应用，所述的细胞为乳腺癌细胞，所述的药物为紫杉醇。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在识别肿瘤干/祖细胞中的应用，所述的细胞为乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、急性髓系白血病细胞。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在识别成体干/祖细胞中的应用，所述的细胞为肺成体干/祖细胞、乳腺成体干/祖细胞、睾丸成体干/祖细胞、肝成体干/祖细胞。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在制备检测干/祖细胞试剂盒中的应用，其中，所述的干/祖细胞为成体干/祖细胞或肿瘤干/祖细胞。所述的肿瘤干/祖细胞为乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、急性髓系白血病细胞。所述的成体干/祖细胞为肺成体干/祖细胞、乳腺成体干/祖细胞、睾丸成体干/祖细胞、肝成体干/祖细胞。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在制备检测细胞增殖能力试剂盒中的应用，所述的细胞为正常乳腺上皮细胞、支气管上皮细胞、腺上皮细胞、胆小管上皮细胞或乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、急性髓系白血病细胞。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在制备检测细胞迁移能力试剂盒中的应用，所述的细胞为正常乳腺上皮细胞、支气管上皮细胞、腺上皮细胞、胆小管上皮细胞或乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、急性髓系白血病细胞。提供一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在制备检测细胞化疗药物抗性试剂盒中的应用，所述的细胞为乳腺癌细胞，所述的药物为紫杉醇。本发明的方案在提高对判断肿瘤细胞在增殖、 迁移和化疗药物抗性能力及识别干/祖细胞方面具有重要的应用价值。本发明的方案除了可以应用于临床工作，还可以应用于科研工作(非临床应用)，例如对科研工作中工具细胞进行鉴定等。
图I :正常乳腺导管基底/肌上皮分别用RP215，抗⑶44v6及抗CK5/6抗体染色的结果。图2 :正常肺组织支气管上皮基底细胞及粘膜固有层外分泌腺基底细胞用RP215染色结果。图3 :正常肝组织胆管上皮细胞及睾丸精原细胞(红箭头)及初级精母细胞(绿箭头)用RP215染色的结果。图4比较RP215、⑶44v6及CK5/6在相同部位的乳腺导管癌组织染色的结果。图5肺癌组织用RP215染色的结果。图6大肠癌组织用RP215染色的结果图7食道癌组织用RP215染色的结果。a :食道癌癌巢中强阳性细胞；b :癌巢边缘强阳性细胞；c :癌巢及向周围淋巴组织侵袭的癌细胞呈现明显的RP215阳性反应。图8胃癌原位组织及侵袭到粘膜相关的淋巴组织中胃癌组织用RP215染色的结果。红箭头原位组织；绿箭头粘膜相关的淋巴组织图9乳腺癌原发病灶及其淋巴转移病灶用RP215染色的结果图10乳腺原位癌与转移癌IgG的表达量比较图11 用 RP215 分选细胞膜 IgG 阳性的 MDA-MB-231 P3 RP215- P2 RP215+图12RP215阳性及阴性MDA-MB-231细胞在体外形成单细胞克隆能力的比较图13RP215阳性及阴性MDA-MB-231细胞MTT实验结果比较图14RP215阳性及阴性MDA-MB-231细胞迁移能力的比较左上RP215+0小时右上RP215_0小时左下RP215+48小时右下RP215_48小时图15在化疗药物作用下，MDA-MB-231RP215阳性细胞与阴性细胞克隆形成实验结果比较图16MDA-MB-231 RP215阳性与阴性细胞化疗药物抗性实验-MTT实验结果比较图17non_B Ig分子在细胞内定位
具体实施方式
实施例I.免疫组化法抗体RP215用于判定细胞在增殖、迁移及识别成体/肿瘤干细胞方法乳腺癌和正常乳腺组织，肺癌和正常肺组织，大肠癌组织，胃癌和食管癌组织取自解放军总医院；肝胆管上皮，睾丸组织取自北京大学人类疾病基因研究中心，RP215由加拿大Dr. Lee教授实验室制备，现存于北京大学人类疾病基因研究中心，小鼠IgGl，鼠抗人CD44抗体购自于北京中杉金桥公司(美国ZATA公司产品)；免疫组化二抗试剂盒，鼠抗人CK5/6抗体购自于DAKO公司。免疫组化操作步骤脱蜡石蜡切片置于二甲苯中浸泡20分钟，换新鲜二甲苯重复一次；再水化将脱腊后的组织切片于100%乙醇中浸泡5分钟2次，95%乙醇、80%乙醇、蒸馏水各浸泡5分钟XI次；
抗原修复抗原修复液为Tris-EDTA(Ph 9. O)缓冲液，将抗原修复液用高压锅加热至沸腾，将切片放入，加热至冒气后计时2分钟，自然冷却至室温；去除内源性过氧化物酶新鲜配置3% H202,滴片，室温下避光孵育10分钟；封闭用正常羊血清工作液室温封闭20分钟；一抗反应滴片，分别加I : 2500抗人CA215、抗人CD44抗体(以PBSl 30稀释)和抗人角蛋白5/6 (以PBSl 100稀释)，37°C lh。PBS洗5分钟X 3次二抗反应DAK0 二抗显色试剂盒(EnVision DetectionKit, Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse)，室温反应25分钟；PBS 洗 5 分钟 X 3 次，DAB显色，滴片，镜下观察反应结果；苏木精复染细胞核，自来水蓝化；乙醇上行脱水80%乙醇5min，95%乙醇5min，100%乙醇5minX2次；中性树胶封片，于显微镜下观察并记录结果。结果(1)RP215识别成体、肿瘤干细胞在正常组织中，IgG分子在多种正常上皮基底层细胞、胆管上皮细胞等多潜能特性的成体干/祖细胞中高水平表达。RP215阳性信号只呈现在乳腺的肌上皮细胞及部分腺上皮，并且，这种分布与目前普遍公认的乳腺癌干细胞Marker⑶44分子及正常乳腺干细胞Marker角蛋白5分子是一致的(图I);在正常肺组织中，阳性反应只特异地呈现在支气管上皮中基底层细胞及气管固有层中分泌腺的基底细胞(图2);在肝组织中阳性反应主要呈现在肝胆管上皮细胞；而在睾丸，阳性细胞主要位于精原细胞(单能成体干细胞)及初级精母细胞中(图3)。由于目前的研究提示上述的阳性细胞都被认为是成体干/祖细胞，故提示IgG分子是干细胞标志分子。在多种肿瘤组织中，IgG分子在癌巢周围的基底样细胞、部分肿瘤实质细胞或迁入淋巴组织的肿瘤细胞呈现强阳性反应。在乳腺癌组织中，我们的结果进一步显示，RP215强阳性细胞主要分布在原位导管癌的基底细胞、浸润性导管癌癌巢周围的扁平状基底样细胞及部分癌巢中的肿瘤实质细胞，其分布与⑶44信号呈现密切的正相关性，且与⑶44相比，显示了更强的阳性度。另夕卜，RP215虽然在正常的乳腺中与角蛋白5呈现很好的相关性，但在癌组织中二者的相关性却不明显，提示癌巢周围这些RP215强阳性的扁平状基底样细胞不是残存的正常肌上皮细胞，而是具有肿瘤干细胞特性的癌细胞(图4)。在肺癌组织中，肺腺癌及鳞状细胞癌都呈现阳性信号，其中，肺腺癌的癌巢周围也呈现一群强阳性细胞，而鳞状细胞癌所有的细胞都呈现强阳性，癌组织中残存的支气管上皮基底层细胞，增生活跃，并向管腔内迁移(图5);而在大肠癌检测中发现，大部分肿瘤实质细胞都呈现阴性反应，但有意思的是，肿瘤细胞常常形成不对称的腺样结构，其中一侧常常堆积多层异常增殖的癌细胞，而腺样结构的另一侧则由几个形态较小细胞形成单层上皮样的结构，而RP215阳性细胞主要限于这类的小细胞，其细胞特征符合多潜能干细胞的特点(图6)。(2)Non B Ig参与细胞增殖及迁移在食道癌检测中发现，所有的癌细胞都强阳性反应，但部分细胞，特别是从癌巢迁移到周边的细胞及局部粘膜相关的淋巴组织中癌细胞呈现极强的阳性反应(图7);在胃癌组织的检测中发现，在原发灶癌组织中没有发现RP215阳性细胞，但在转移到淋巴相关组织中的胃癌细胞呈现强阳性(图8)。为了进一步探讨非B细胞来源的IgG与肿瘤细胞转移能力的关系，我们用RP215检测45例配对的乳腺癌原位组织及其淋巴结转移组织(图9)。我们的结果显示，在这45例配对组织中，有10例原位癌IgG的表达量要强于转移癌，而其余的35例转移癌的表达量要明显地强于原位癌，两者 具有明显的统计学差异(图10)。提示非B细胞来源IgG的表达与乳腺癌的转移呈正相关。实施例2.应用抗体RP215通过流式细胞术判定肿瘤细胞的增殖能力、迁移能力、化疗药物抗性及识别肿瘤干细胞乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自ATCC，由本实验室常规传代培养。RP215由加拿大Dr. Lee教授制备，现存于北京大学人类疾病基因研究中心。Polystat恒温水浴箱自美国Cole Parmer 公司，GS-15R Beckman 离心机自美国 Beckman 公司，EL-311SX ELISA Reader自美国Bio-TEK公司，FACSCalibur流式分析仪和FACS Aria流式细胞分选仪自美国BD公司。乳腺癌细胞系MDA-MB-231，卵巢癌原代细胞均用含10 % FBS的DMEM培养基(4. 5g/L葡萄糖，4mM L-谷氨酸)加100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，放置于37°C，5%C02孵箱中传代培养。每2-3天用O. 25%胰酶+EDTA消化细胞，传代一次，维持细胞指数生长。应用RP215通过流式分析检测肿瘤细胞IgG水平收获待测细胞，制备为单个细胞悬液，PBS洗涤两次，每次加PBS 5ml左右，1，OOOrpm 5min ;加入2% FBS的FACS封闭液，将待测细胞制成密度大约为5X 105/ml的单细胞悬液；将合适剂量的特异抗体(RP215按I : 150稀释)加入单细胞悬液，充分混匀；冰上孵育30min ；PBS洗涤两次，每次加PBS 4ml左右，I, 500rpm5min ;弃上清，用200 μ I FACS封闭液重悬细胞，加入荧光标记的二抗(Dylight488-羊抗鼠IgG，JacksonImmunoresearch公司产品)，按I : 100稀释；冰上避光孵育30min ；PBS洗洚两次，每次加PBS 4ml左右，l，500rpm 5min ;2 %多聚甲醛固定后用FACSCalibur流式仪作荧光染色分析。通过流式方法用RP215分别分选IgG高表达及低表达的肿瘤细胞收获待测细胞，无菌操作制备为单个细胞悬液，PBS洗涤两次，每次加PBS5ml/l X IO6细胞，1，OOOrpm 5min ;加入2% FBS的FACS封闭液，将待测细胞制成密度大约为I X 106/ml的单细胞悬液；将合适剂量的特异抗体(RP215按I : 150稀释)加入单细胞悬液，充分混匀；冰上孵育30min ；PBS洗涤两次，每次加PBS 4ml/106细胞左右，I, 500rpm5min ;弃上清，用200 μ I FACS封闭液重悬细胞，加入荧光标记的二抗(Dylight488_羊抗鼠IgG, Jackson Immunoresearch公司产品)，按I : 100稀释；冰上避光孵育30min ；PBS洗漆两次，I, 500rpm 5min ;无菌流式过滤管过滤后用FACS Aria流式细胞分选仪进行分选。克隆形成实验将经RP215标记，FACS分选的RP215—和RP215+细胞，以200细胞/孔的密度接种6孔板，每组3个复孔，常规培养14天用含O. I %的Triton X-100的4%多聚甲醛固定5分钟，PBS洗3遍后用苏木素染色I分钟，自来水冲去多余染料，自然干燥后计数细胞克隆个
数。 MTT法细胞增殖实验将计数好的细胞以IXlOVml的剂量接种到96孔板上，每孔的细胞悬液为IOOyl0在培养箱中孵育24小时，待细胞贴壁后，加入用培养液稀释成不同浓度的紫杉醇，
0,0. 1,0.2,0. 4ug/ml,4个浓度梯度，每个浓度设3个平行孔，再孵育24小时。MTT液的配制及比色分析将MTT溶解在PBS中，使其浓度为5mg/ml，过滤除菌后4°C避光保存。测定时每孔加入MTT 10 μ 1，混匀后将培养板放入培养箱中继续培养5小时，然后每孔加入100 μ ISDS中止反应，充分混匀后37°C孵育过夜，用MTT酶标仪测定570nm波长时每孔的OD值。细胞划痕实验将经RP215标记，FACS分选的RP215—和RP215+细胞分别在24孔板上培养，待细胞融合后，用黄枪头在中央区域画一条线，然后将细胞继续培养，观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况，来判断两种细胞的迁移能力差异。结果发现，应用RP215可以对乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行有效分析和分选(图11)，分选后对两群细胞进行的克隆形成实验，在常规培养14天后，RP215阳性及阴性细胞均能形成单细胞克隆，但阳性组细胞形成的克隆数高于阴性组的细胞(图12)。分选后对两群细胞进行了 MTT实验，多个时间点MTT检测结果表明，RP215阳性细胞的增殖能力明显高于阴性组细胞(图13)，该结果具有很好的可重复性。在分选后还对两群细胞进行多个时间点划痕后观察发现，在划痕后43小时RP215阳性细胞在划痕区就完全融合，与阴性组细胞形成明显的差异(图14)。这些结果提示，RP215阳性(细胞膜)细胞，其增殖能力及迁移能力都明显强于RP215阴性细胞。在分选后又用抗肿瘤药-紫杉醇进行了化疗药物抗性实验，在紫杉醇浓度压力下进行了细胞克隆形成和MTT的检测。研究发现，在克隆形成实验中，RP215阳性细胞组克隆数无论是大克隆数还是克隆总数，都明显高于阴性细胞组，具有统计学差异(图15)。在MTT实验中，O. lug/ml,O. 2ug/ml、0. 4ug/ml三个剂量的紫杉醇浓度作用下，表达非B细胞来源Ig的细胞的增殖能力都明显高于不表达非B细胞来源Ig的细胞(图16)。因为肿瘤细胞系在培养过程中不可避免地存在遗传性状丢失的现象，我们还与北京大学第三医院合作获得了卵巢癌(I例)及子宫内膜癌(I例)腹水，并分选了其中RP215+或RP215+/EpCAM+及RP215-或RP215-/EpCAM+原代卵巢癌细胞及子宫内膜癌细胞，然后在细胞培养过程中观察其形态、增殖、迁移及体内成瘤情况。结果发现，2个病例在细胞形态上有所不同，在比较RP215+卵巢癌细胞与RP215-组过程中意外地发现，RP215+卵巢癌细胞在培养48小时后细胞出现很多伪足(或称突足)，这一现象在培养后96小时更加明显，提示这种伪足可能与细胞迁移有关。通过培养96小时后进行细胞计数发现，RP215+卵巢癌细胞在培养后细胞数目明显高于RP215-组，结果有显著统计学差异。实施例3.应用抗体RP215通过免疫荧光实验判定non-B Ig在细胞中的定位将大肠癌细胞HT-29， 骨肉瘤细胞系U20S爬片培养至合适密度，将AML细胞甩片至玻片，PBS洗涤两次后，用2 %多聚甲醛常温固定30min，再用含有O. I % Triton-XlOO的2 %多聚甲醛穿透细胞膜，常温15min，随后的封闭和抗体结合方法同上述细胞内蛋白免疫荧光染色，最后，用共聚焦显微镜观察记录。结果在三种细胞系中都检测到了 RP215阳性信号，三种细胞内的阳性信号均显示丝状结构(图17)，并且在细胞之间有丝状连接信号，提示non-B Ig在细胞内的定位与细胞骨架有关，参与细胞迁移功能。利用RP215这一特异针对非B细胞来源的IgG分子的单克隆抗体，我们发现IgG主要高水平表达在多潜能干细胞或祖细胞中和那些细胞体积小、形态近乎正常细胞，不呈现细胞体积大、核异质等典型肿瘤干细胞中，IgG的表达与细胞有丝分裂及迁移能力密切相关，也符合干/祖细胞的特点。本发明的方案在提高对判断肿瘤细胞在增殖、迁移和化疗药物抗性能力及识别干细胞方面具有重要的应用价值。本发明的方案除了可以应用于临床工作，还可以应用于科研工作(非临床应用)，例如对科研工作中工具细胞进行鉴定等。
权利要求
1.一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在临床和科研工作中识别干/祖细胞中的应用。
2.一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在判定细胞增殖方面的应用。
3.一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在判定细胞迁移方面的应用。
4.一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在判定肿瘤细胞化疗药物抗性方面的应用。
5.如权利要求I所述的应用，其中所述干/祖细胞为识别肿瘤干/祖细胞方面的应用。
6.如权利要求I所述的应用，其中所述干/祖细胞为识别成体干/祖细胞方面的应用。
7.如权利要求1-5所述的应用，其中所述的细胞为正常乳腺上皮细胞、支气管上皮细胞、腺上皮细胞、胆小管上皮细胞或乳腺癌细胞、大肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食道癌细胞、胃癌细胞、急性髓系白血病细胞。
8.如权利要求4所述的应用，其中所述的药物为紫杉醇。
9.如权利要求6所述的应用，其中所述的细胞为肺成体干/祖细胞、乳腺成体干/祖细胞、睾丸成体干/祖细胞、肝成体干/祖细胞。
10.一种识别非B细胞来源免疫球蛋白分子重链可变区的抗体RP215在制备检测干/祖细胞试剂盒中的应用，其中，所述的干/祖细胞为成体干/祖细胞或肿瘤干/祖细胞。
全文摘要
本发明公开了一种特异性识别人非B细胞来源的免疫球蛋白(non-B Ig)重链可变区的单克隆抗体RP215在判定肿瘤细胞在增殖、迁移、化疗药物抗性及识别成体/肿瘤干/祖细胞方面的应用。本发明的方案对提高临床和科研工作中对肿瘤细胞恶性度、肿瘤转移、预后判定及对肿瘤/成体干/祖细胞的深入研究具有重要的应用价值。
文档编号G01N33/574GK102901817SQ20111021192
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月27日 优先权日2011年7月27日
发明者邱晓彦, 李吉祐, 刘伟, 廖沁园, 黄晶 申请人:北京大学, 李吉祐