细胞增殖相关基因cnksr3与筛选方法及其应用的制作方法

专利名称：：细胞增殖相关基因cnksr3与筛选方法及其应用的制作方法细胞增殖相关基因C/VA5/W与筛选方法及其应用
技术领域：
：本发明属于生物工程与生物医药
技术领域：
。具体涉及基于细胞增殖相关siRNA干涉文库筛选细胞增殖相关基因av/:s^的方法及其应用。
背景技术：
：人类基因组计划已经完成，但是人类染色体大多数基因的功能仍然不清楚。主要原因是缺乏能够大规模、高通量进行功能基因扫描的手段和策略。WinzelerEA等人在啤酒酵母(&cc/zaraw少c^cwev/w'ae)基因组序列的测序成功之后，利用酵母基因敲除技术构建了大约6925株不同的精确敲除单个开放阅读框(openreadingframe,ORF)(Brown，Dorfmanetal.)的缺失型菌株，使得系统性地研究啤酒酵母基因组中这些开放阅读框的功能成为可能。而在模式生物线虫(Cae"w/wk/z'toe/egara)和果蝇(Dmy—z7"附e/層ga他r)中，RNA干扰现象(Fire,Xuetal.1998;KennerdellandCarthew1998)的发现使得在这些模式生物中对未知功能基因进行大规模功能缺失(loss-of-fUnction)研究成为可能。RNA干扰是转录后序列特异性的基因沉默过程(Tuschl，Zamoreetal.1999)，由双链的RNA分子所介导(ZamoreandHaley2005)。目前研究证实一种叫做Dicer的核酸酶能够切割长的双链RNA，产生19-29bp左右的短双链RNA，称为siRNA。siRNA的一条链作为RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)的模板同互补的mRNA结合，并使其被降解(MeisterandTuschl2004)。RNA干扰能够有效地抑制特定基因的表达，且这种干扰机制在哺乳动物中也广泛存在(Harborth,Elbashiretal.2001)。因此RNA干扰不但成为高等生物功能组基因学研究中的重要工具；也成为大规模、高通量地在哺乳动物细胞或者组织中进行功能缺失性(loss-of-function)扫描的主要手段(MiyagishiandTaira2003)。目前，利用化学合成的siRNA构建的RNA干涉文库，人们已经发现TRAIL诱导的细胞凋亡过程起到重要调节作用的基因家族(Ren,Wagneretal.2004)，以及同细胞生存相关基因(Murphy，MacKeiganetal.2004)、同内吞作用相关的激酶基因等(Pelkmans,Favaetal.2005)。除了化学合成的siRNA，另一个方法就是构建以表达siRNA质粒为基础的RNA干涉文库，进行大规模高通量的基因功能研究和筛选。RNA干涉现象被发现不久，一些实验室就已经开始研究siRNA表达质粒。他们研究发现RNA聚合酶III启动子序列的质粒，能够通过单一或者双向的RNA聚合酶III启动子序列，在真核细胞体内长期持久地表达shRNA(单一启动子)禾PsiRNA(双向启动子)，并且无论是shRNA还是siRNA都能够有效地抑制特定基因的表达(KaykasandMoon2004;Miyagishi，Matsumotoetal.2004)。利用这一技术，Berns和他的同事们构建大约23,742个独立的shRNA表达质粒，这些质粒靶向人类7,914个不同基因。并且通过在人类细胞中进行大规模的扫描，他们发现了l个已知功能和5个未知功能基因，这些基因可能在依赖于p53引起的细胞周期阻滞起着重要调节作用(Berns,Hijmansetal.2004)。Kaykas和他的同事们也证实由他们构建完成的pHippy的双向启动子siRNA表达载体能够有效地沉默连接了荧光素酶报告基因的基因(KaykasandMoon2004)。因此，利用siRNA干涉文库对新功能基因进行扫描，是发现新功能基因的重要手段。利用双向启动子的siRNA表达载体，我们组建了耙向人类胚胎干细胞和造血干细胞增殖、分化相关基因的siRNA干涉文库。目前，我们的文库含有近450个载体，靶向225个人类基因。我们利用一部分文库(包含70个基因(20个转录因子，50个未知功能蛋白))对细胞增殖相关基因进行新功能基因的筛选(Ghildiyal,Seitzetal.2008)。并发现了能够影响细胞增殖的新功能基因一CA^SiJCA^S及J(NM—173515;HomosapiensCNKSRfamilymember3(CNKSR3))又名MAGI1(membraneassociatedguanylatekinaseinteractingprotein-like1)。目前已有石开究表日月CA^5W能够同上皮细胞选择性粘附分子(Endothelialcell-selectiveadhesionmolecule,ESAM)相互结合，介导细胞与细胞间的相互接触，而且同ESAM的结合很有可能是通过CA^5W蛋白上的PDZ结构域完成的(Wegmann,Ebnetetal.2004)。同时CA^5iW也介导Dill(Delta-likel)在细胞膜上的定位(Mizuhara,Nakatanietal.2005)，而且整合素相关激酶(Integrin-linkedkinase，ILK)同CNKSR3基因的调节区相互作用，负调节CA^S/3基因的表达(Acconcia,Barnesetal.2007)，但是关于aV/Si^对于细胞增殖能力的影响还未见报道。通过siRNA文库扫描以及进一歩对CA^5i3的功能研究证实基因在细胞增殖过程中有着重要的作用，沉默CW尤Si^的表达促进了细胞的增殖。
发明内容本发明的目的在于提出一种基于细胞增殖相关siRNA干涉文库筛选细胞增殖相关基因CA^5/3的方法。OVA57W基因能够影响细胞的增殖状况，尤其是在肿瘤和胚胎细胞中。这些基因在细胞分化、肿瘤治疗、抗肿瘤药物的开发等方面有着巨大的潜在应用价值。本发明是利用构建特异性的siRNA表达载体pNKRY，组建siRNA干涉文库，利用该文库在人宫颈癌HeLa细胞中，对细胞增殖相关基因进行筛选(WST-1分析)。初次扫描之后，确定CA^Si3作为候选基因，再对CA^5i3基因的功能通过4个不同的分析方法进行了进一步评价1)GFP细胞比例改变程度分析细胞增殖能力；2)WST-1分析细胞增殖能力；3)细胞计数分析细胞增殖能力；4)BrdU渗入分析细胞增殖能力。本发明提供的细胞增殖相关基因CNKSR3的核苷酸序列如序列表所示。所述的细胞增殖相关基因CNKSR3的筛选方法，包括下述步骤第l、限制性siRNA干涉文库的构建第l.l、候选基因的挑选、siRNA模版的设计与合成第l丄l、根据美国斯坦福大学2004年公布的关于干细胞发育过程中基因芯片(http:〃smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceResult.html)的结果，从中挑选在干细胞发育过程中表达量发生明显变化，大于2倍，的基因作为候选基因；第1丄2、根据PUBMED数据库，检索上步候选基因的cDNA序列；第1.1.3、根据Ambion公司(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)所提供的在线软件寻找siRNA作用的耙序列；第l丄4、根据siRNA耙序列设计siRNA模板，并交由试剂公司合成；第1.2、siRNA模版的制备与磷酸化第1.2.1将合成的单链DNA稀释至lpg^L;第1.2.2取正义链、反义链各22.5pL，加入5^L10x退火缓冲液；第1.2.3加热至94。C，反应5min，随后自然冷却至室温，单链DNA即退火形成双链siRNA模板；第1.2.4退火的双链siRNA模板lpL(l吗/nL),10xT4磷酸酶缓冲液lpL，T4磷酸激酶lpL，浓度10u^iL;ATPlpL，浓度10mmol/L;并加双蒸水至终体积10|aL，；37'C下反应30min;第1.2.5反应完成之后，加热体系至70'C终止反应，然后自然冷却至室温；第1.3、特异性的siRNA表达载体构建第1.3.1将磷酸化的siRNA模板与线性化siRNA表达载体100ng，用T4连接酶进行连接；第1.3.216'C反应12h之后，将连接产物转化感受态细胞￡丄0//￡)//5;第1.3.3利用Amp抗性在含有Amp，浓度50昭/pL的1%的LB琼脂糖平板上挑选阳性转化子；第1.3.4每个平板随机挑选10个阳性转化子，菌落PCR对阳性转化子进行鉴定，上游引物5'-CTGGGAAATCACCATAAACGTGAA-3';下游引物5，-GCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3，；PCR反应程序94°C4min;94°C30s，55°C30s，72°C60s，重复25个循环；72°C2min;阳性转化子电泳时只存在186bp左右的带；第1.3.5提取筛选得到的阳性转化子的质粒，多个基因的siRNA表达载体质粒就组成了细胞增殖相关的siRNA干涉文库；第2、文库功能鉴定第2.1、HEK293T细胞的转染第2丄1细胞转染参照Lipofectamine2000说明书，取对数生长期HEK293T细胞，接种于6孔培养板，每孔接种细胞5xl()5个；第2丄2培养24h后进行细胞转染，并设未转染的细胞和转染等量空白质粒(不靶向任何基因，只表达绿色荧光蛋白的质粒)pNKRY-GFP作为对照；第2丄3转染48h之后，按照Trizol说明书，提取各组细胞的总RNA，利用反转录RT-PCR检测特定基因的沉默效果；上游引物SOCS3:5'-ATGGTAGCACGCAACCAGG-3',GAPDH:5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3，；下游引物SOCS3:5'-TCAGATCTGGAAGGGGAAG-3'，GAPDH:5'-CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT-3';第2丄4按照哺乳动物裂解试剂盒说明书，裂解细胞，取全蛋白进行SDS-PAGE;第2丄5将蛋白转至PVDF膜，室温下以5%脱脂奶粉阻断1h，兔抗人SOG^抗体孵育lh，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG孵育lh;第2丄6ECL法显色，暗室曝光显影成像；第3、高通量功能基因扫描第3.1、WST-1高通量细胞增殖分析第3丄1将用含10%FCS的D-MEM培养基在5%二氧化碳温箱中培养状态良好的HeLa细胞铺96于孔板中，每孔2xl04/Cells;第3丄212小时后将siRNA干涉文库中同一个基因的两个质粒混合后利用LipofectamineTM2000转染；每个基因转染3个复孔；第3丄3转染48小时后在450nm下对细胞进行WST-1检测；WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞增殖越慢，则颜色越浅；第3丄4取第4个小时的各基因数据进行双侧t检验，根据统计结果选出变化显著的基因，其T值>1.645或者T值<一1.645;并计算同转染对照质粒数据的比率;经对50个未知功能基因均进行了扫描，实验显示CW^Si3(NMJ73515;HomosapiensCNKSRfamilymember3(aV《Si3))，其T值=8.051663>1.645，能够影响HeLa细胞的增殖能力，沉默CA^Si^基因能够促进HeLa细胞的增殖，增殖比率19%±2.82%;第4、CA^S7^基因的克隆按照Trizol使用说明书，从HEK293T细胞中提取TotalRNA;利用CA^Si3引物正义争连5'-atggaacccgtgaccaagtggagcccca-3，；反义链5'-gtgagtcaacagtttgaggcgcgta-3';通过Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒，按照该公司提供的实验步骤扩增CA^S/3基因，通过Invitrogen胶提取试剂盒提取扩增的CA^S/3基因片段。然后通过Invitrogen公司提供的pCDNA31ffis/V5ToPo载体，根据该公司提供的实验步骤将CiVXSW基因克隆到pcDNA3.iHis/V5TOPO载体，最后，通过测序确定RGS1序列克隆了CA^S/3基因，并将其连入pcDNA3.1V5表达载体中；第5、对筛选的细胞增殖相关基因CA^SiW基因功能进一步鉴定第5.1、GFP细胞比例改变程度分析CA^Si3基因对细胞增殖能力的影响基因对细胞增殖存在影响，转染了成功的细胞与未转染细胞、以及转染了空白对照载体的细胞相比，增殖能力存在差异，培养一段时间之后会造成转染的阳性细胞比率的改变；第5.2、WST-1检测CA^SW基因对细胞增殖功能的影响将pcDNA3.1-CA^5i3,pNKRY-WCA^SiU以及他们的对照质粒pcDNA3.1，pNKRY-GFP转染HEK293T细胞，并通过WST-1方法检测CA^SW基因对其增殖功能的影响；第5.3、细胞计数分析CA^S7^基因对细胞增殖能力的影响WST-1检测细胞增殖完成之后，我们又将各组的细胞用胰酶消化下来，台盼兰染色之后，计数各组的细胞，分析CAT57^基因对细胞增殖能力的影响；第5..4、BrdU渗入检测CA/X基因对细胞增殖能力的影响BrdU是一种核苷类似物能够特异性地渗入进入S期的细胞，因此在新增殖的细胞合成的DNA中会渗入BrdU，用PE标记的抗BrdU特异性的抗体，就能够标记出新增殖的细胞，利用FACS分析细胞的增殖能力；在转染了各组质粒细胞的培养液中加入BrdU，培养48小时之后，按照BrdUFlowKits提供的说明书进行染色，然后FACS分析各组细胞的情况。本发明提供的上述方法还可以应用于大规模功能基因的筛选及功能基因的研究。所述的细胞增殖相关基因CA^Si3，可应用于抗肿瘤药物以及影响细胞增殖药物的制备中。本发明提供了一个非常有效的基于细胞增殖相关基因siRNA干涉文库筛选细胞增殖相关基因CA^Si3的方法，在对细胞增殖与分化、肿瘤治疗、抗肿瘤药物的开发等研究有着重要的意义。通过细胞增殖相关基因siRNA干涉文库和WST-1高通量分析建立了筛选细胞增殖相关基因的方法。细胞增殖相关基因CA^SiJ参与细胞增殖信号通路的调控，在细胞增殖与分化，肿瘤治疗，抗肿瘤药物的开发等方面有着潜在的应用价值。CA^SiJ基因在细胞增殖信号通路调控中具有重要作用，细胞增殖相关基因在肿瘤治疗，细胞分化的研究中具有重要作用，是生物治疗和新药物开发的重要靶点。本发明的积极效果细胞增殖相关基因CA^S/W对细胞的分化与增殖研究具有潜在的应用价值。细胞的分化与增殖是一个多基因调控的过程。目前对于分化与增殖的调控的分子机制目前还不清楚。研究细胞增殖与分化相关基因有助于在分子水平了解细胞增殖与分化的分子机制，对通过生物手段控制细胞的定向分化具有重要的意义。细胞增殖相关基因CA^Si3对肿瘤治疗具有潜在的应用价值。恶性肿瘤是目前亟需解决的疾病之一。每年死于恶性肿瘤的人数众多。肿瘤的发生与发展、以及肿瘤的生长是多基因参与的复杂的调控过程。我们通过高通量的siRNA干涉文库扫描，在人宫颈癌细胞株HeLa细胞中发现CA^Si3能够影响癌细胞的增殖能力，为我们研究癌细胞的生长机制提供了一个选择。对阐明癌细胞生长的机制具有重要的意义。与此同时，由于后续的研究进一步证实CW^Si^在细胞增殖过程中具有重要的作用。因此，CA^Si^肿瘤的生物治疗以及新的抗肿瘤药物的研发中，可能成为重要的靶基因。对肿瘤的治疗和新药物的开发具有重要的意义。图1是根据靶序列设计的siRNA模版示意图。图2是电泳检测阳性转化子。图3是特异性siRNA表达载体及其对照空白载体转染293T细胞。图4是转染各组细胞的TotalRNA及其RT-PCR电泳结果。A是转染各组细胞的TotalRNA的电泳结果；B利用S0CS3的引物进行反转录RT-PCR的电泳结果。表明转染了SOCS3特异性siRNA表达载体pNKRY-w'SOGS3在转染细胞48小时之后，能够在mRNA水平上有效地沉默SOCS3的表达。图5是转染各组细胞的Western-Blotting。图6是WST-1高通量扫描结果。图7是利用流式细胞仪检测各组细胞中表达绿色荧光细胞比率。A是流式细胞仪检测时选取的细胞群；B是检测未转染细胞中表达绿色荧光细胞比率，作为阴性对照；C是转染对照质粒pNKRY-GFP在第O小时时，转染细胞中表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞比率；D是转染对照质粒pNKRY-GFP在第48小时时，转染细胞中表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞比率；CD说明转染空白对照载体pNKRY-GFP的细胞中荧光细胞的比率在0h，48h变化不大。E是转染siRNA表达质粒pNKRY-w'CA^Si^在第0小时时，转染细胞中表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞比率；F是转染siRNA表达质粒pNKRY-w'CiVX5i^在第48小时时，转染细胞中表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞比率；EF说明培养48小时之后，转染siRNA表达载体pNKRY-w'CA^Si3的细胞中的绿色荧光细胞的比率明显增加，即沉默了CWiffi/^确实能够促进细胞的增殖。图8是WST-1检测法检测各组细胞的增殖能力。A是WST-1检测转染表达载体pcDNA-CA^Si3及其对照载体的细胞的增殖能力；转染了CA^5i3基因表达载体pcDNA-V5-CA^SW的细胞，使aVXSW过量表达会抑制细胞的增殖。B是WST-1检测转染siRNA表达载体pNKRY-w'CA^5i^及其对照载体的细胞的增殖能力；转染了CA^SW基因的siRNA表达载体pNKRY-^CA^Si^的细胞，沉默CA^Si3的表达则促进细胞的增殖。图9是细胞计数检测各组细胞的增殖能力。图10利用BrdU渗入法检测转染各种载体之后，细胞的增殖能力的变化。A是转染对照载体pcDNA3.1-V5的细胞在第0小时时，FITC/PE双阳性细胞的比率；B是转染对照载体pcDNA3.1-V5的细胞在第48小时时，FITC/PE双阳性细胞的比率；C是转染表达载体pcDNA3.1-CA^S73的细胞在第0小时时，FITC/PE双阳性细胞的比率；D是转染对照载体pcDNA3.1-CA^SW的细胞在第48小时时，FITC/PE双阳性细胞的比率；AD说明转染了GVi^i^基因表达载体pcDNA-V5-CiViffl7^的细胞培养48小时之后，和转染了空白对照载体pcDNA3.1-V5的细胞相比，FITC/PE双阳性细胞的比率降低，表明CA^S73过量表达会抑制细胞的增殖。E是转染对照载体pNKRY-GFP的细胞在第0小时时，GFP/PE双阳性细胞的比率；F是转染对照载体pNKRY-GFP的细胞在第48小时时，GFP/PE双阳性细胞的比率；G是转染siRNA表达载体pNKRY-'CASi3的细胞在第0小时时，GFP/PE双阳性细胞的比率；H是转染siRNA表达载体pNKRY-'aViSi^的细胞在第48小时时，GFP/PE双阳性细胞的比率；EH说明转染siRNA表达载体pNKRY-WCA^Si^的细胞培养48小时之后，和转染了空白对照siRNA表达载体对照载体pNKRY-GFP的细胞相比，GFP/PE双阳性细胞的比率明显增加，表明沉默CA^SiJ的表达则促进细胞的增殖。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体描述实施例1、细胞增殖相关基因C7Vffi/W的筛选(1)限制性siRNA干涉文库的构建1)候选基因的挑选、siRNA模版的设计与合成1我们根据美国斯坦福大学2004年公布的关于干细胞发育过程中基因芯片(http:〃smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceResult.html)的结果，从中挑选在干细胞发育过程中表达量发生明显变化，变化值>2倍，的基因作为候选基因。2根据PUBMED数据库，检索候选基因的cDNA序列。3根据Ambion公司(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)所提供在线软件寻找siRNA作用的靶序列，每个基因至少2个靶序列。4根据siRNA耙序列设计siRNA模板，并交由试剂公司和成。图1是我们设计出的siRNA模板的示意图，我们寻找到的siRNA的耙序列是一对同源互补的序列，长度为19bp，分别在正义链与反义链的5'端加上"aaag"和"aaaa"4个碱基，使其由平末端转变成为粘性末端，这样既保证了siRNA模板能够以正确的方式连入siRNA表达载体pNKRY，又提高了连接的效率，使得模板更加容易连接。表1是我们选取的50个细胞增殖相关基因siRNA的靶位点。表1基因名称靶位点序列1靶位点序列2AACTGACTCAGTCATCATTGCAAGAACTCACTTCTCAGAACAAACGACTGCTTCGTCAAGATCAAGGGCAACTACTGGACCCTGAAGATACAGGACTTACCATCCAACAGCAGTGAGCAAGGTGAT￡>/AAGCGCATTCTGCACAAGACCAACAAGCGCATTCTGCACAAGAAGCGATCAAGCAGCGACTATAAGGTATTCAGCCAAACGACCAAGAGTTTGCATCTCTAACAGAACAGTTTCCCAGGCAGTACTAAGCTGGTGAAAGTGTGCACAAACGTGGAGCTCAAGTTTGTGAAGCACAGACAAGAATGGACAAACACACGAACACAGACCAGAAACTATCTTCCTGCTGGTGACAAGCTGTGAAGAAACTGCTGGCC"AACCGCCAAGTGTGTGCCAACAAGTGTGTGCCAACCCAGAGA藩5;AAGTTCGTCTTCTCCACGGAGAACTTCAGACCAGATTGTTCCAAGTCGAGTGTGCTACTCAACAAGAAGGCGCGCAAGAACGCTAAGAAGAGGAGGACATCAGTGAAGTCAAGCACAATGGCTGGGAACACAGTCAGCAAGCTGGTGAATGAACCACAGTGCTTCTACAAGTGTCACCTCATTCCAGGCAAGATGCTCCACATAAGATCCMM渭AACAGTTATGCGGCCTGGGCTAAGGAGGCGGAGGCATTCCTAW册2AACCTGAACCATTACGCCACCAACAACGCAGCCACCATCTTG幼"AAGAGAGTGAGGATGTGTCCAAAGGTGTCAATGTCCAGCACTAACATACAGAAACTTTGCTGGAAGATGAATTGAATCTTCTGGAAGGTCTGGAGCAGAGCTGTGAACTCTGGCTCCTTACAGCAGAACAGGTGTCTAGTCACATTCAACGAGTGCTTCGTCAAGGTGAAGCCTCACCTCCTCTACAAG￡CMZAAGATAAGAGGACGCAGAAGC，/AAGACTTGACCACTTACTTGGJ7F7AATGAGGTTGTTAGCCTGATGAATGCTATGGTGCTGGAACTG孤2AAGACATGGAGTTATTGGTGGAACACATGCATTCTCGAAGAGAAGGAGAGTGGTGACATCTCG房認〃AAGTACTTGGAGTTACGAAAGAACGATGCAGAGAGTAGGAAG，77AAGCAACAACTCTCAATGTAGAAGGAGACATTCGACTCTGTGAACACCTTTCGAAACTCCTGAAAGACCCAATGATCAATGAGA層57AACAAGAGATTGAAAGAACTCAACAGTGAAGGCTGTGTTCAAAATGTACTGGCACATCCTTGCAAGGACATCTTTAAGGAAGAGAAGTTACTTCATCATGTGACAAACTATCACAGACTTCTGTACAAGTACCAAGTGGAGTACGACAACAGTTGTGCCTATAAGGTGAAGACAGTGACAGTGCTCCTCAAGAAGCAGGTCTAGAAGAAGAAGAGATGCTGGATGAAGAAGAAGCTGAAGTACTGCTTCACCAAGCTGCAGCAGAAGGAGGAGAACTCCAAGTCAGATTATGTCAAGGTGTCTTACACCTTACAGAACCAGTCAGTACGAGAGTTCAAGGACAAGGAGGAGAAGGACAAGTACTCTGAGTACTGAAGGAAGCCAGAGAATCTGCTGTACAAGAAGACTGGCCTAGAGATGAAGCACACGGCCAGCAATGTGAATGGCACGACCTAGTGGTCGAAGCTCTACACATATATCCAGAAGAAGATAGAACAGTGTGACAACTCTGTGAAGGTGATGTACAATGAAGAACAAGCATGTAACAAGCACATGGAGATAGACATCAAGAGAAGCTGTCGAATCCTCAACATCAGAGGATTCAAACGCAAGTATGATCCAACTCACTTCAAGGAGAAGATCAGCATGTGGAAGATCTATGAAGAAGATCAGAAGGCTGTGTTCAAGGAGTTGAAGTCTGATTGAAACAGTGCAAAGGCTTGTCCTCATGTCTGGAAGCTTCCACTGACAAGGAAGAACATTCCAGAGGGTTCTCACAAGACCAGTTTGAGTACGAGCAAGTGCACTCGGAGCCCACTAAAGCAGGACGTATGCAAGACAAAGCAGGTCTAGAAGAAGTAGAAGTAACCTGAACCCAGATGCAAGGACTGCGAGTACCAGCAGAAGAATCTCAGCCAGAGTCCT1AAGTGGTGGACTGGACTAGAGAAGCAGGTGCTACATCAACTCAAGTGCTGGTTCCTATTCCTCAACGATGACCTCAACAACGTCAATCCTGCTCCAAGGCTCACCAAGCTGGAGTTCATGTTGGTGM舰AAGCTGCTCTCAGTGTGGTGCAAGGAGAATACACACATCACAAAGGATACACTCCACAGACAGAAGACCAGGAAGCAGAAGCAC層wAAGCAGGAAGCTTATGAGCAGAAGCAGCTGGAACACAGGAGGAACTGGTTCTGCAAGGAGCAGAAGTCAACCAGCCAAGGCAGGAATCTGTCTGTGTTCAGACAGAAGCTCAGTTCTACACTCTGCAACCTGTGTCAGTGGACAAGGAAGCAGTACTATGAGCAATCCAAGTACCTGCTGGAGGAGTGGAAGCTGCATCACCACCTGCACAAGACAGACTTCAGAGGCATGAACCTACAGCATGAAGAGCTAAAGCATGGAAACATCCACTTGAAGCAATGAAGCCAGAGGAGCAAGCTGGCCAAGAACATACTGAACCTCAGGAGTCTGACACAGAAGACATGTTCTACCTGCAAGAACGTGAACTTGAGGATGATG柳iVAACCAGGATCCTTCAAGGTCGAAGGTCGATACTGCAAGCAAC，C3AAGCAGGCCACTCCTTACATCAAGACGAGAGACTCAGGAACTGciAAGCACAGTGCTGAGAAGGAGAACGTCATCAACTGCAACTTCAAGGTGTCGATGTGGTCTATGAAGTATCAAGCAGCCATGAGC2)siRNA模版的制备与磷酸化1将合成的单链DNA稀释至lpg4iL。2取正义链、反义链各22.5pL，加入5pL10x退火缓冲液。3加热至94。C，反应5min，随后自然冷却至室温，单链DNA即退火形成双链siRNA模板。4退火的双链siRNA模板lpL，浓度l吗/^L;10xT4磷酸酶缓冲液lpL;T4磷酸激酶lpL，浓度10u4iL;ATPlpL，浓度10mmol/L;并加双蒸水(ddwater)至终体积lOpL,37。C下反应30min。5反应完成之后，加热体系至7(TC终止反应，然后自然冷却至室温。3)特异性的siRNA表达载体构建1将磷酸化的siRNA模板与线性化siRNA表达载体100ng用T4连接酶进行连接。216'C反应12h之后，将连接产物转化感受态细胞￡.^//￡)//56(。3利用Amp抗性在含有Amp，浓度50昭&L，的1%的LB琼脂糖平板上挑选阳性转化子。4每个平板随机挑选10个阳性转化子，菌落PCR对阳性转化子进行鉴定，上游引物5，-CTGGGAAATCACCATAAACGTGAA-3，；下游引物5，-GCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3，。PCR反应程序94°C4min;94°C30s，55°C30s,72°C60s，重复25个循环；72°C2min。阳性转化子电泳时只存在186bp左右的带。5提取筛选得到的阳性转化子的质粒，多个基因的siRNA表达载体质粒就组成了细胞增殖相关的siRNA干涉文库。图2是对随机挑选的阳性转化子进行PCR鉴定的结果，从电泳图中可以看出1,2,5,7,8,9,12，13，14,15,17，19泳道片段的大小为lOOObp左右，是未酶切完全的假阳性菌落；3,4,6,10,11,16,18,20泳道的片段大小为186bp左右，均为siRNA模板正确连接的阳性克隆。(2)文库功能鉴定1)HEK293T细胞的转染1细胞转染参照Lipofectamine2000说明书，取对数生长期HEK293T细胞，接种于6孔培养板，每孔接种细胞5xl05个。2培养24h后进行细胞转染，并设未转染的细胞和转染等量空白质粒(不耙向任何基因，只表达绿色荧光蛋白的质粒)pNKRY-GFP作为对照。图3是转染了SOCS特异性siRNA表达载体pNKRY-siSOCS3、以及其空白对照质粒pNKRY-GFP的荧光显微镜照片。由于siRNA表达载体pNKRY-siSOCS3上具有绿色荧光蛋白，因此转染成功的细胞在紫外激发光下会表现出荧光。从图片中我们可以看出，pNKRY-siSOCS3以及其空白对照质粒pNKRY-GFP对HEK293T细胞有较高的转染率。3转染48h之后，按照Trizol说明书，提取各组细胞的总RNA，利用反转录RT-PCR检测特定基因的沉默效果。上游引物SOCS3:5，-ATGGTAGCACGCAACCAGG-3，，GAPDH:5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3，；下游引物SOCS3:5，-TCAGATCTGGAAGGGGAAG-3',GAPDH:5，-CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT-3，。图4是提取的各组细胞总RNA的电泳图以及反转录RT-PCR结果的电泳图。A:各组细胞总RNA的电泳结果，从结果可以看出各组RNA完整，均没有降解。B:利用SOCS3的引物进行反转录RT-PCR的电泳结果。结果显示转染了SOCS3特异性siRNA表达载体pNKRY-WSOCW在转染细胞48小时之后，能够在mRNA水平上有效地沉默SOCS3的表达。4按照按照哺乳动物裂解试剂盒说明书，裂解细胞，取全蛋白进行SDS-PAGE。5将蛋白转至PVDF膜，室温下以5%脱脂奶粉阻断1h，兔抗人SOC^抗体孵育1h,辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG孵育1h。6ECL法显色，暗室曝光显影成像。图5是对各组细胞进行Western-Blotting检测SOCS3在蛋白质水平被沉默的情况，结果显示以"-actin作为内参，我们构建的SOCS3特异性siRNA表达载体pNKRY-^SOCW在转染细胞48小时之后，能够在蛋白质水平上有效地沉默SOCS3的表达。综合图4、图5的结果，我们用于构建siRNA干涉文库的载体pNKRY在mRNA水平和蛋白质水平都能够有效地沉默目的基因的表达，因此利用该载体pNKRY组建的siRNA干涉文库能够用于功能基因的扫描与研究。(3)高通量功能基因扫描1)WST-1高通量细胞增殖分析1将用含10%FCS的D-MEM培养基在5%二氧化碳温箱中培养状态良好的HeLa细胞铺96于孔板中，每孔2xlO"Cells。212小时后将siRNA干涉文库中同一个基因的两个质粒混合后利用LipofectamineTM2000转染。每个基因转染3个复孔。3转染48小时后在450nm下对细胞进行WST-1检领lj。WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞增殖越慢，则颜色越浅。4取第4个小时的各基因数据进行t检验(双侧)，根据统计结果选出变化显著的基因，其T值〉1.645或者T值<一1.645。并计算同转染对照质粒数据的比率。图6是我们利用WST-1分析进行高通量扫描的部分结果，从该结果中可以看出，沉默aV^5i^基因能够HeLa细胞的增殖，其增殖比率19%±2.82%。表2是我们对所有扫描结果进行T检验(双侧)之后，得到的T值表，从表中可以看出，CA^5i3基因在3次的扫描结果中，其T值都有显著性差异，因此我们推测CA^SiW基因可能在细胞增殖过程中具有重要的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>8.077166-3.903271.418239FZJ707"-7.32529CAKS73.3183281.7092638.0516635.806449膠7-1.34391五CfflW-0,53111MGC76柳13.479085TV腦710.85947F赢"5fi8.357141.125599CffiTO8.917596iM朋6G11.76496-0.34628FA/B尸/丄8.800268-0.08505l.l卯lOlLS7W23.469364-3.16814Z)CC7-1.202947bw7i^-2.4038C7》/720,6322388.801389-1.09648TM服WS-0.17787Fos/2-4.44138-1.75173-9.03723iMMX550,2191370.70363赢Z)i/D71.1362952.620133CC￡C/〃-0.14420.568993MV571.093806-0.204732,5450,084297-2.4442TM蕴，3.149189GmD/-2.41335iZ)爐DJ0.963547M^5-ZF-0.86381S腦7,9235662.02468C70or兩-1.74968柳C3-3.48886GCOM/-1.69101MS舰0細34-0.91857-1.220750.740056-6,2885-2.309780.6426231.3823451細9170.4763421,77791(4)CA^9i3基因的克隆按照Trizol使用说明书，从HEK293T细胞中提取TotalRNA。利用CA^SW弓|物通过Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒，按照该公司提供的实验步骤扩增CiV^Si3基因，通过Invitrogen胶提取试剂盒提取扩增的CA^5及3基因片段。然后通过Invi加gen公司提供的pcDNA3jHis/V5ToPo载体，根据该公司提供的实验步骤将CWiCSi^基因克隆到pcDNA31His/V5TOPO载体。最后，通过测序确定RGS1序列克隆了aVATS/3基因，并将其连入pcDNA3.1V5表达载体中，构建了CW/Si3基因的表达载体pcDNA-V5-CA^5i丄CJVX5i3的基因序列见序列表所示。(5)对筛选的细胞增殖相关基因CA^SiJ基因功能进一步鉴定1)GFP细胞比例改变程度分析CA^5i3基因对细胞增殖能力的影响如果OViSi^基因对细胞增殖存在影响的话，那么转染了CA^SiJ特异性siRNA表达载体pNKRY-w'CA^Si3的细胞会由于CA^SW3被沉默，而与未转染细胞、以及转染了空白对照载体pNKRY-GFP的细胞相比，其增殖能力是不同的。由于先期的研究发现，沉默CA^S/^的表达会促进细胞的增殖，因此转染了siRNA表达载体pNKRY-w'CA^Wj的细胞较其他未转染细胞、以及转染了空白对照载体pNKRY-GFP的细胞会增殖的更快。由于转染了siRNA表达载体pNKRY-WCA^S/3的细胞本身具有荧光且增殖更快，因此荧光细胞的比率会随着培养时间的延长而增力口；反之转染了空白对照载体pNKRY-GFP的细胞中荧光细胞的比率随着培养时间的延长而变化不大。图7是我们通过流式细胞仪检测各组细胞中表达绿色荧光的细胞比率。从结果中可以看出，培养48小时之后，转染siRNA表达载体pNKRY-w'CA^5i^的细胞中的绿色荧光细胞的比率明显增加，而转染了空白对照载体pNKRY-GFP的细胞中荧光细胞的比率则变化不大。说明沉默了CA^^3确实能够促进细胞的增殖。1)WST-1检测CA^SiJ基因对细胞增殖功能的影响将pcDNA3.1-OV尤Si^,pNKRY-w'CW尤SiJ以及他们的对照质粒pcDNA3.1，pNKRY-GFP转染HEK293T细胞，并通过WST-1方法检测CiViffii3基因对其增殖功能的影响。图8是我们通过WST-1检测各组细胞的增殖能力，cellalone:未转染的细胞；pcDNA-V5:转染了空白对照载体pcDNA3.1-V5的细胞；pcDNA-V5-CA^SiJ转染了CW^^3基因表达载体pcDNA-V5-CiV^57J的细胞；pNKRY-GFP:转染了siRNA表达载体对照载体pNKRY-GFP的细胞；pNKRY-^GVA:Si3:转染了CA^5iU基因的siRNA表达载体pNKRY-w'a^S/3的细胞。从结果中可以看到，CA^iSi3过量表达会抑制细胞的增殖，而沉默av^s/3的表达则促进细胞的增殖。1)细胞计数分析CA^/3基因对细胞增殖能力的影响WST-1检测细胞增殖完成之后，我们又将各组的细胞用胰酶消化下来，台盼兰染色之后，计数各组的细胞，分析CA^^3基因对细胞增殖能力的影响。图9是我们统计了细胞计数之后的结果，cellalone:未转染的细胞；pcDNA-V5:转染了空白对照载体pcDNA3.1-V5的细胞；pcDNA-V5-CA^Si转染了CA^M3基因表达载体pcDNA-V5-CA^Si3的细胞；pNKRY-GFP:转染了siRNA表达载体对照载体pNKRY-GFP的细胞；pNKRY-w'aV^Si^:转染了GV尤M3基因的siRNA表达载体pNKRY-w'GViffii3的细胞。同图8的结果类似，我们从图9的结果中可以看出CA^SW过量表达会抑制细胞的增殖，而沉默CA^S7J的表达则促进细胞的增殖。2)BrdU渗入检测CA^SiU基因对细胞增殖能力的影响BrdU是一种核苷类似物能够特异性地渗入进入S期的细胞。因此在新增殖的细胞合成的DNA中会渗入BrdU。用PE标记的抗BrdU特异性的抗体，就能够标记出新增殖的细胞，利用FACS分析细胞的增殖能力。在转染了各组质粒细胞的培养液中加入BrdU,培养48小时之后，按照BrdUFlowKits提供的说明书进行染色，然后FACS分析各组细胞的情况。我们用PE-anti-BrdU标记新增殖的细胞，用FITC-anti-V5标记转染了pcDNA3.1-CA^SiJ-K5以及对照空白载体pcDNA3.1-V5的细胞，用siRNA表达载体自带的绿色荧光标记转染了pNKRY-w'OV^5i^以及pNKRY-GFP的细胞。图10是我们用流式细胞仪分析各组细胞的增殖结果，cellalone:未转染的细胞；pcDNA-V5:转染了空白对照载体pcDNA3.1-V5的细胞；pcDNA-V5-CM^i3转染了CiVX5/^基因表达载体pcDNA-V5-OVXSiW的细胞；pNKRY-GFP:转染了siRNA表达载体对照载体pNKRY-GFP的细胞；pNKRY-w'CA^SiU:转染了CA^Si3基因的siRNA表达载体pNKRY-w'CMS/W的细胞。从结果中可以看出CA^9i3过量表达会抑制细胞的增殖，而沉默CWi^iJ的表达则促进细胞的增殖。序列表<110>南开大学<120>细胞增殖相关基因CNKSR3与筛选方法及其应用<160>1<210〉1<211>1668<212>DNA<213>人禾中(Homosapiens)<400>1atggaacccgtgaccaagtggagccccaaacaagtggtggactggactagagggttggat6061gactgcctgcaacaatatgtccacaagtttgaacgagagaagatcaacggcgagcagctg120121ctgcagatttcccatcaggacctggaggagctgggggtcacacggattggacaccaggag180181cttgtgttggaggctgtggaccttctctgtgcactgaattatggcctcgaaactgataac240241atgaagaacttggttctgaaactgagagcatcttcccacaatttacagaattacataagt300301agccgacggaaaagteccgcttacgatggcaacacctcccgcaaggcccccaatgagttc360361ctgacctcggtggtggagctcatcggcgccgccaaggccctgctggcgtggctggaccgg420421gctccgtttacagggatcactgatttctcagtcacgaagaacaaaattatccagctttgc480481ttggacctgaccactacagtccagaaggattgctttgtagcggaaatggaggataaagtt540541ttaactgtggtcaaggttttaaatggcatctgtgacaaaacaatccgatctaccacagat600601cctgtgatgagccagtgtgcatgtctggaggaagttcacttaccaaacattaaacctggg660661gaaggcctgggcatgtacatcaaatcaacctatgatgggttacacgtgattactggaacc720721acagaaaattctcctgcagacagatctcagaagattcatgctggtgacgaagtcattcaa780781gttaatcagcaaactgtggtgggatggcagctgaaaaatctggtgaagaaattgagagag840841aatcccaccggagttgtgttactgcttaagaagcgccccaccgggtctttcaactttact900901cctgctcccctgaaaaacctacggtggaagccatcctcttgtacagacctcacctccaccc960961gcgacaacccagtcccctgaaagcactatggatacctcactgaagaaggagaagtcagcc10201021atcctggatctttatattcctcctccgcctgctgttccctactctccccgggatgagaat10801081ggcagttttgtttatggagggtccagtaagtgcaaacaaccattgcctggtcctaagggt11401141tcagagtecccgaattccttcttggaccaggaaagccggagacgaagattcaccattgca12001201gactcggatcagttgcctgggtactcggtggaaaccaacattctgcccacaaaaatgaga12601261gagaaaacaccatcttatggcaagccacggcctttgtccatgcctgctgatgggaactgg13201321atggggattgtggacccttttgccagacctcgaggtcatggcaggaaaggggaggatgcc13801381ctttgccggtatttcagtaacgagcggattcctccgatcattgaagagagctcctctccc14401441ccataccggttctccagacccacgaccgagcggcatctggtccggggtgcggactacatc15001501cgaggaagcaggtgctacatcaactcagatctccacagcagcgccacgattccattccag15601561gaggaagggaccaaaaagaaatctggctcctcagctacgaagtcctcgtccacagaaccg16201621tccctcctggtcagctggtttacgcgcctcaaactgttgactcactga1668权利要求1、一种细胞增殖相关基因CNKSR3，其核苷酸序列如序列表所示。2、一种权利要求1所述的细胞增殖相关基因CNKSR3的筛选方法，其特征在于包括下述歩骤第l、限制性siRNA干涉文库的构建第l.l、候选基因的挑选、siRNA模版的设计与合成第l丄l、根据美国斯坦福大学2004年公布的关于干细胞发育过程中基因芯片(http:〃smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceResult.html)的结果，从中挑选在干细胞发育过程中表达量发生明显变化，即变化值>2倍的基因作为候选基因；第1丄2、根据PUBMED数据库，检索上步候选基因的cDNA序列；第1.1.3、根据Ambion公司(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)所提供的在线软件寻找SiRNA作用的靶序列；第1丄4、根据siRNA靶序列设计siRNA模板，并交由试剂公司合成；第1.2、siRNA模版的制备与磷酸化第1.2.1将合成的单链DNA稀释至lpg4iL;第1.2.2取正义链、反义链各22.5pL，加入5pL10x退火缓冲液；第1.2.3加热至94。C，反应5min，随后自然冷却至室温，单链DNA即退火形成双链siRNA模板；第1.2.4退火的双链siRNA模板lpL,浓度l吗/^iL;T4磷酸酶缓冲液l(aL;T4磷酸激酶lpL，浓度10u/pL;ATP:lpL，浓度10mmol/L;并加双蒸水至终体积10pL;37。C下反应30min;第1.2.5反应完成之后，加热体系至70'C终止反应，然后自然冷却至室温；第1.3、特异性的siRNA表达载体构建第1.3.1将磷酸化的siRNA模板与线性化siRNA表达载体，质量100ng;用T4连接酶进行连接；第1.3.216'C反应12h之后，将连接产物转化感受态细胞￡.^//￡>//5;第1.3.3利用Amp抗性在含有Amp，浓度50ngL的1%的LB琼脂糖平板上挑选阳性转化子；第1.3.4每个平板随机挑选10个阳性转化子，菌落PCR对阳性转化子进行鉴定,上游引物5'-CTGGGAAATCACCATAAACGTGAA-3，；下游引物5'-GCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3，；PCR反应程序94°C4min;94°C30s，55°C30s，72°C60s，重复25个循环；72°C2min;阳性转化子电泳时只存在186bp条带；第1.3.5提取筛选得到的阳性转化子的质粒组成细胞增殖相关的siRNA干涉文库；第2、文库功能鉴定第2.1、HEK293T细胞的转染第2丄1细胞转染参照Lipofectamine2000说明书，取对数生长期HEK293T细胞，接种于6孔培养板，每孔接种细胞5xl()5个；第2丄2培养24h后进行细胞转染，并设未转染的细胞和转染等量空白质粒——不耙向任何基因，只表达绿色荧光蛋白的质粒——pNKRY-GFP作为对照；第2丄3转染48h之后，按照Trizol说明书，提取各组细胞的总RNA，利用反转录RT-PCR检测特定基因的沉默效果，上游引物SOCS3:5'-ATGGTAGCACGCAACCAGG-3',GAPDH:5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3，；下游引物SOCS3:5'-TCAGATCTGGAAGGGGAAG-3'，GAPDH:5"-CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT-3';第2丄4按照哺乳动物裂解试剂盒说明书，裂解细胞，取全蛋白进行SDS-PAGE;第2丄5将蛋白转至PVDF膜，室温下以5%脱脂奶粉阻断1h，兔抗人SOGSJ抗体孵育1h，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG孵育1h;第2丄6ECL法显色，暗室曝光显影成像；第3、高通量功能基因扫描第3.1、WST-1高通量细胞增殖分析第3丄1将用含10%FCS的D-MEM培养基在5%二氧化碳温箱中培养状态良好的HeLa细胞铺96于孔板中，每孔2xl04/Cells;第3丄212小时后将siRNA干涉文库中同一个基因的两个质粒混合后利用LipofectamineTM2000转染；每个基因转染3个复孔；第3丄3转染48小时后在450nm下对细胞进行WST-1检测；WST-1是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan细胞，增殖越多越快，则颜色越深；细胞增殖越慢，则颜色越浅；第3丄4取第4个小时的各基因数据进行双侧t检验，根据统计结果选出变化显著的基因，T值>1.645或者T值<一1.645;并计算同转染对照质粒数据的比率；经对50个未知功能基因均进行了扫描，实验显示CA^Si3，NMJ73515;HomosapiensCNKSRfamilymember3(CiV^Si3)，T值=8.051663>1.645，能够影响HeLa细胞的增殖能力，沉默CA^5ij基因能够促进HeLa细胞的增殖，增殖比率=19%±2.82%;第4、CA^SiJ基因的克隆按照Trizol使用说明书，从HEK293T细胞中提取TotalRNA;利用GV《Si3引物正义链5'-atggaacccgtgaccaagtggagcccca-3，；反义链5'-gtgagtcaacagtttgaggcgcgta-3，；通过Itwitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒，按照该公司提供的实验步骤扩增CA^Si^基因，通过Invitrogen胶提取试剂盒提取扩增的CMCS73基因片段；然后通过Invitrogen公司提供的pcDNAuHis/V5ToPo载体，根据该公司提供的实验步骤将CA^Si3基因克隆到pcDNAuHis/V5TOPO载体，最后，通过测序确定RGS1序列克隆了CASi基因，并将其连入pcDNA3.1V5表达载体中；第5、对筛选的细胞增殖相关基因CA^Si3基因功能进一步鉴定第5.1、GFP细胞比例改变程度分析CA^Si3基因对细胞增殖能力的影响基因对细胞增殖存在影响，转染了成功的细胞与未转染细胞、以及转染了空白对照载体的细胞相比，增殖能力存在差异，培养一段时间之后会造成转染的阳性细胞比率的改变；第5.2、WST-1检测aV《Si3基因对细胞增殖功能的影响将pcDNA3.1-C7^:Si3,pNKRY-^C7V^9i^以及他们的对照质粒pcDNA3.1，pNKRY-GFP转染HEK293T细胞，并通过WST-1方法检测CA^SW基因对其增殖功能的影响；第5.3、细胞计数分析CA^Si3基因对细胞增殖能力的影响WST-1检测细胞增殖完成之后，我们又将各组的细胞用胰酶消化下来，台盼兰染色之后，计数各组的细胞，分析CiV^S73基因对细胞增殖能力的影响；第5*4、BrdU渗入检测GV《Si^基因对细胞增殖能力的影响BrdU是一种核苷类似物能够特异性地渗入进入S期的细胞，因此在新增殖的细胞合成的DNA中会渗入BrdU，用PE标记的抗BrdU特异性的抗体，就能够标记出新增殖的细胞，利用FACS分析细胞的增殖能力；在转染了各组质粒细胞的培养液中加入BrdU，培养48小时之后，按照BrdUFlowKits提供的说明书进行染色，然后FACS分析各组细胞的情况。3、如权利要求2所述的方法，其特征在于该方法将应用于大规模功能基因的筛选及功能基因的研究。4、权利要求1所述的细胞增殖相关基因CNKSR3的应用，该基因用于抗肿瘤药物以及影响细胞增殖药物的制备中。全文摘要一种细胞增殖相关基因CNKSR3与筛选方法及其应用。本发明提供的细胞增殖相关基因CNKSR3，其核苷酸序列如序列表所示。本发明通过构建特异性的siRNA表达载体，组建siRNA干涉文库，在人宫颈癌细胞株HeLa细胞中进行高通量WST-1细胞增殖能力扫描，发现沉默CNKSR3基因对细胞增殖功能具有促进作用。在随后的研究中，当CNKSR3基因或靶向该基因的siRNA转染293T细胞系，众多的分析结果都显示过量表达CNKSR3基因会抑制细胞的增殖(附图1A1，A2，B1，B2)，而沉默该基因的表达则促进细胞的增殖(附图1C1，C2，D1，D2)，说明该基因在细胞的增殖过程中具有重要的作用。该基因基因在细胞增殖与分化、肿瘤治疗以及抗肿瘤药物的研发等方面有着巨大的潜在应用价值。文档编号A61P35/00GK101348788SQ200810054129公开日2009年1月21日申请日期2008年8月15日优先权日2008年8月15日发明者彬曾,杨荣存申请人:南开大学