专利名称：Lyrm1基因在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及LYRMl基因在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
背景技术：
肥胖，是一种常见的能量代谢性疾病，已成为日趋严重的全球性流行病。肥胖与冠 心病、高血压、高脂血症、糖尿病、脑血管意外等多种疾病关系密切，严重危害着患者 的身心健康。目前已知肥胖是机体在遗传、环境、行为因素或三者相互作用下能量代谢 失衡的结果，并且随着遗传学和生物学的发展，遗传因素在肥胖发生中的重要性己倍受 重视。已有研究结果指出，肥胖发生的病因中遗传因素占40-70%，开展肥胖病因的遗 传学研究十分重要。
在前期研究工作中，我们以抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization, SSH)技术筛选肥胖与正常人网膜脂肪组织中的差异表达基因(differentially expressed genes),克隆到一条在肥胖者脂肪组织中表达显著上调的功能尚未明确的新基因 ——LYRMl (GenBank登录号NM—020424.3)，目前有关其与肥胖的关系尚未见报道。 该基因cDNA全长1589bp (SEQIDNo.l)，开放阅读框长369bp，编码一 122个氨基酸 的蛋白(NCBI登录号NP一065157.1)。通过与人类基因组序列比对，LYRMl基因定位 于染色体16p11.2，外显子和内含子序列明确；DAS和TMpred未预测出跨膜区域，提 示为非跨膜蛋白；SignalP未预测出信号肽，提示为非分泌蛋白；InterPro和Smart工具 对LYRMl基因可能存在的功能域进行分析，发现在LYRMl上存在一 LYR结构域，LYR 家族蛋白认为是NADH复合物的一个元件，提示其可能参与能量代谢；clustahv软件比 对，发现该基因与大鼠、小鼠、狗、鸡、牛等高度同源，提示其较为保守，存在一定功 能。
我们验证了 LYRMl基因在肥胖与正常人脂肪组织中的差异表达，发现该基因在肥 胖者脂肪组织中核酸及蛋白表达水平均显著上调，与SSH结果(SSH实验筛选出426 条肥胖与正常人网膜脂肪组织中的差异表达基因，其中216个特异高表达于肥胖者脂肪组织，210个特异高表达于正常人脂肪组织。LYRM1是其中一条特异高表达于肥胖者脂 肪组织中的基因) 一致。多组织表达结果显示LYRM1在脂肪组织中的表达量最高。进 一步为分析LYRM1基因的生物学属性，我们应用能够表达融合蛋白LYRM1—绿色荧 光蛋白的表达质粒(LYRMl-pEGFP-N2)，转染不同细胞，根据绿色荧光蛋白在荧光显 微镜下可直接观察的特点，以融合蛋白LYRM1—绿色荧光蛋白的亚细胞定位，初步判 断LYRM1的亚细胞定位，结果发现该融合蛋白定位于胞核内，由于核蛋白与生物遗传 和蛋白质生物合成关系密切，因此有关核蛋白结构与功能的研究十分活跃。
发明内容
本发明的目的是提供LYRM1基因在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
发明人在研究中发现LYRM1基因能够促进脂肪细胞增殖，故提出LYRM1基因、 LYRM1基因编码的蛋白及其融合蛋白在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
有益效果
本发明通过在脂肪细胞中稳定表达LYRM1蛋白，与阴性对照相比，明显促进脂肪 细胞的增殖速度，为制备促进脂肪细胞增殖药物提供了可用的基因序列，为研究肥胖的 发生发展提供了新的研究手段。
图1:脂肪细胞中稳定表达LYRM1蛋白的验证。在稳定表达LYRM1细胞和空载 对照细胞中应用制备的LYRM1特异性抗体验证LYRM1蛋白的表达。
图2:稳定表达LYRM1蛋白的脂肪细胞和空载对照细胞生长曲线图。
图3:稳定表达LYRM1蛋白的脂肪细胞和空载对照细胞24小时细胞染色质合成期 分布图。
图2、 3中LYRM1代表LYRMl-pcDNA3.1myc/hisa(-))转染脂肪前体细胞3T3-L1 组，pcDNA3.1代表pcDNA3.1myc/his a(-)空载转染的脂肪前体细胞3T3-L1组。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
实施例1
1材料和方法
1.1试验材料
本试验所需的真核表达载体pcDNA3.1myc/his a(-)购自美国invitrogen公司。脂肪前 体细胞3T3-L1购自美国ATCC细胞库，细胞筛选的新霉素G418购自美国sigma公司。
本试验过程中所采用的酶，dNTP、感受态细胞JM109等购自大连宝生物公司。
1.2表达载体的构建
采用Trizol提取人网膜下脂肪组织RNA，经反转录成cDNA，利用LYRM1特异性 引物(上游引物5'-AGAATAAACCTCAAGAAACG-3' (SEQIDNo.2);下游引物5'-AATTTTTGCCCCTAATCAAG-3' (SEQIDNo.3))扩增出包含LYRM1蛋白编码序 列的PCR产物，直接连接入pMD-18T载体(TA克隆的原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3'末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3' T突出端的载体， 在连接酶作用下，可以快速地、 一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点(MCS)中，即是说PCR产物末端的A直接与载体上的T连接)。测序验证无误 后，以此T/A克隆载体(包含LYRM1蛋白编码序列的PCR产物连接入pMD-18T载体 所构成的载体)为模版，PCR扩增两头带BamHI和Xhol酶切位点产物。将扩增后产物 与真核表达载体pCDNA3.1myc/hisa(-)采用上述两种酶进行酶切，酶切后纯化连接，转 化入感受态细胞JM109，挑克隆送测序。测序无误后抽提质粒(LYRMl-pcDNA3.1myc/his a(-))待用。
1.3 LYRM1稳定表达细胞的筛选与建立
将构建好的LYRM1真核表达载体(LYRMl-pcDNA3.1myc/his a(-))转染脂肪前体 细胞3T3-L1， pcDNA3.1myc/his a(-)空载转染的脂肪前体细胞作为对照。转染后24小时， 用新霉素G418 (浓度为800ng/ml)进行筛选。筛选维持两周，含有LYRM1表达的阳 性细胞株存活，其余无表达的细胞死亡，G418降至200wg/ml维持，细胞繁殖扩增。 将转染LYRM1 、空载转染的3T3-L1细胞抽提蛋白，应用LYRM1特异性抗体进行Western 免疫印迹(Western—Blot)实验，验证LYRMl蛋白的表达。结果见图l。
1.4脂肪细胞增殖的测定
A. 将LYRMl稳定表达细胞、空载转染的阴性对照细胞，接种于96孔细胞培养板， 接种密度约为每孔500个细胞，以DMEM高糖培养基培养一周。每天取细胞进行细胞 生长活力(MTT)测定，连续7天后，根据MTT吸光度值画出生长曲线。结果见图2。
B. 将LYRMl稳定表达细胞、空载转染的阴性对照细胞，培养于75ci^的细胞培养 瓶。以无血清的DMEM高糖培养基培养48小时后，使细胞同步化，停留于G0期。恢 复正常培养基进行培养，并在恢复正常培养基培养后的第0、 6、 12、 18、 24小时收取 细胞，70%冰乙醇固定后经流式细胞仪检测细胞周期分布，计算不同时间点S期细胞(染 色质合成期)分布(代表细胞增殖能力)。结果见图3。
2结果显示，通过MTT试验发现，在7天中，稳定表达LYRM1的细胞增殖速度 明显快于空载转染的对照细胞，细胞个数明显增加。通过细胞周期检测发现，在恢复含 血清的培养基后第12、 18、 24小时，稳定表达LYRM1的细胞中S期细胞组分明显大 于对照组，表明染色质合成期细胞增多，细胞增殖速度变快。说明LYRM1基因及其编 码的LYRM1蛋白、融合蛋白能显著促进脂肪细胞增殖，可用于制备促进脂肪细胞增殖 药物。
序 列 表
〈110〉郭锡熔刘峰邱洁彭宇竹
〈120〉 LYRM1基因在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用
〈160〉 3
<210〉 1
〈211〉 1589
〈212〉 DNA
〈213〉天然序列，来源人类组织细胞
〈400〉1<sequence>see original document page 7</sequence>
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉DNA
<213>人工序列，上游引物<400> 2
agaataaacc tcaagaaacg 20
<210> 3 <211> 20 〈212〉 DNA
〈213〉人工序列，下游引物 〈400> 3
aatttttgcc cctaatcaag 20
权利要求
1、LYRM1基因在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
2、 LYRM1基因编码的蛋白及其融合蛋白在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，公开了LYRM1基因在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明的技术方案为LYRM1基因、LYRM1基因编码的蛋白及其融合蛋白在制备促进脂肪细胞增殖药物中的应用。本发明为制备促进脂肪细胞增殖药物提供了可用的基因序列，为研究肥胖的发生发展提供了新的研究手段。
文档编号A61K48/00GK101342371SQ20081002188
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者倪毓辉, 峰 刘, 季晨博, 敏 张, 张春梅, 彭宇竹, 霞 池, 玢 王, 洁 邱, 郭锡熔, 陈晓慧 申请人:郭锡熔;刘 峰;邱 洁;彭宇竹