一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因的克隆、表达及应用的制作方法

专利名称：：一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因的克隆、表达及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术药物和基因
技术领域：
，具体涉及一种新的柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因的克隆、表达及应用。
背景技术：
：鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养鸡业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防，但由于这些方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控制球虫病。而研制高效安全的抗球虫病基因工程疫苗和新药物的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。本发明人以对鸡危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫(￡.^/^//^)为研究对象，开展了五.&朋//^孢子生殖发育阶段差异表达基因的分离、鉴定等研究，为探索鸡球虫的入侵和生长发育机制，从而研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定基础。蛋白激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的Y磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。蛋白激酶和蛋白磷酸酶参与可逆性磷酸化过程，在调节代谢、基因表达、细胞生长、细胞分裂和细胞分化等方面起关键性作用。几乎所有的细胞内信号通路都是利用蛋白磷酸化产生信号并向远处传递。蛋白激酶催化蛋白质上磷酯键的形成，细胞蛋白质活性发生极大变化。形成的磷酯键性质非常稳定，去除时需要蛋白磷酸酶水解。细胞通过调节蛋白激酶与蛋白磷酸酶的动态平衡，产生一个限定时空的信号，并以一种高度特异性方式来影响蛋白质的活性状态，调节细胞功能。蛋白激酶是细胞内最大的蛋白家族之一。根据受体氨基酸的性质，蛋白激酶家族可以划分为4类丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶、酪氨酸特异性蛋白激酶、组氨酸特异性蛋白激酶和天冬氨酸/谷氨酸特异性蛋白激酶。目前对丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶和酪氨酸特异性蛋白激酶的研究较多，这两种激酶有许多共同的特征催化机制、结构特性、激酶调节机制都非常相似。本发明人研究发现克隆的柔嫩艾美耳球虫新蛋白激酶(EtPK)基因编码的蛋白与利氏曼原虫a^/wwm/aiw/a"^附)蛋白激酶在337505位氨基酸具有30%的同源性。保守区功能域检索发现该基因编码的蛋白在320500位氨基酸间具有丝氨酸/苏氮酸蛋白激酶催化功能域,是丝氨酸/苏氨酸特异性激酶的磷酸转移酶亚家族。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是一类特异地催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的激酶家族，包括蛋白激酶A(PKA)(cAMP依赖性蛋白激酶.)、蛋白激酶C(PKC)((^2+激活的/磷脂依赖性蛋白激酶)、<^2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶、DNA依赖的蛋白激酶、丝裂原激活的蛋白激酶等，参与多种信号传导过程。在鸡球虫中己经发现一些蛋白激酶，如柔嫩艾美耳球虫细胞周期依赖性蛋白激酶(EtCRK2)、环鸟苷酸依赖的蛋白激酶(EtPKG)、f丐依赖蛋白激酶(CDPK)等，研究发现这些蛋白激酶在虫体入侵宿主细胞过程中起重要作用，另外也发现一些球虫蛋白激酶是研究抗球虫病化学药物的作用靶标。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于研究设计扩增柔嫩艾美耳球虫的一种新蛋白激酶(EtPK)基因及其应用。本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因，该基因具有SEQIDNO.l序列。本发明以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊为驱动组，子孢子为实验组，利用抑制性消减杂交技术构建了子孢子的消减cDNA文库。从构建好的消减cDNA文库中挑选了1056个克隆，制作了cDNA微阵列(芯片)，将柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子的总RNA制备探针，分别用cy3和cy5标记，通过芯片杂交、筛选获得了EtPK基因的EST序列，经实时定量RT-PCR检测，该基因在子孢子阶段高表达。利用RACE(cDNA末端快速扩增)技术首次克隆到了编码柔嫩艾美耳球虫一种新蛋白激酶(EtPK)基因含ORF的全长cDNA序列，构建了原核重组表达质粒(pGEX-4T-EtPK)，在大肠杆菌中进行了表达，纯化了重组表达蛋白，并对表达的重组蛋白进行了抗原性的鉴定。本发明的另一目的是提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因的克隆和表达。该方法包括下列步骤(1)试剂与材料Trizol、GeneRaceTMKit购自Invitrogen公司；TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKit、限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司；pGEM-T-easyvector购自Promega公司；DEPC、X-Gal、TagPlusIDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司；bacto-yeastextract、AgarA、bacto-tryptone为OXOID公司产品。丙烯酰胺、N,N'-亚甲基甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵购自Sigama公司；HRP—羊抗兔IgG3购自上海英基生物科技有限公司；HRP—羊抗鸡IgG购自SouthernBiotech公司；蛋白质预染Marker购自Fermentas公司；High-AffinityGSTResin为南京金诗特生物公司产品。罗曼优质黄羽鸡，购自上海汇中种鸡场，出壳后运回实验室饲养，笼具、饲料、饮水等均经严格消毒。柔嫩艾美耳球虫(￡.柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，编号CAAS21111601，由中国农业科学院上海兽医研究所保存提供。pGEX-4T-2表达载体、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21(DE3)由中国农业科学院上海兽医研究所保存提供，这些菌种都是已公开、常规使用的。(2)方法①RACE(cDNA末端快速扩增)引物的合成利用抑制性消减杂交技术(SSH)和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子)虫体差异表达基因，获得了子孢子阶段虫体高表达基因克隆ZB1-A02。根据其EST(表达序列标签)序列(含3'端ploy(A)尾)，设计5，RACE引物(引物由上海赛百盛生物有限公司合成)。5'Primer5，-GACTGTTCATTTCGAGCGGATCCT-3'5，NestedPrimer5'-GACGCTCCCATCCCAAGATCATAA-3，②RACE产物的扩增具体步骤按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行。将扩增获得的RACE产物克隆到pGEM-T-easy载体中，挑选阳性克隆，进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。根据测序结果査找5'RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将两段序列拼接。③含完整ORF(开放阅读框)全长基因的克隆根据拼接的cDNA序列设计上下游引物，进行含ORFcDNA片断的PCR扩增。上游引物5'-AGAACGAGTTGTTGCCAATG-3，下游引物5'-TCAAAGTTTCTTGGGTTCGTAAT-3，以5'RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。反应条件94°C2.0min;94°C30s，52°C40s，，72°C2.0min，30个循环，72°C10min。扩增获得的PCR产物(见图1)经纯化后与pGEM-T-easy载体连接，构建的重组质粒(命名为pGEM-T-EtPK)转化JM109感受态细胞，进行兰白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定，鉴定正确的单菌落送上海英骏生物技术有限公司测序。生物信息学分析利用在线软件ORFfinder(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析获得的新基因的全长cDNA序列，找出编码框。利用ProtParam工具(httr>:〃cn.expasv.org/tools/Drotoaram.html)计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成等。利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(http:〃weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.doprogram=antigenic)分析其抗原位点d利用SingalP3.0在线分析软件(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SingnalP/)分析编码蛋白有无信号肽。ProtScale在线分析软件0ittp:〃www.expasv.org/cgi-bin7protscale.pl)分析编码蛋白的疏水性。利用TMHMM服务器(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析编码蛋白有无跨膜结构。BLASTp软件(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)以及FASTA软件(http:〃www.ebi.ac.uk/fasta33)用于同源蛋白的搜索，利用CDD(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtal)软件査询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域。利用motifscan(http:〃mvhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan),分析功能结构域。⑤荧光实时定量RT-PCR:选择18SrRNA看家基因作为内参，标化反应结果。提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的总RNA，去除基因组DNA后，利用随机引物反转录成cDNA第一链，EtPK基因定量PCR的引物为SensePrimer:5'-GTGGCTGCTTCCTACTGTAGACC-3'，AntisensePrimer:5'-CACTGCTTGACCTTCCCTTTG-3'。18SrRNA的引物为SensePrimer(正义链引物)5'-GAGTATGGTCGCAAGGCTGA隱3',AntisensePrimer(反义链引物)5'-CAGGCTAAGGTCTCGTTCGTT-3'反应体系如下成分体积(^L)5xRT-PCRBuffer(缓冲液)5.0Mg2+(250腿oL/L)0.3dNTP(10mmoL/L)0.75上游引物(10nmoL/L)0.5下游引物(10pmoL/L)0.525xEvaGreen1.0HS隱Ex-Tag(TagDNA聚合酶)(5U/pL)0.25模板(cDNA第一链)2.0ddH20(灭菌去离子水)14.7总体积25.0反应程序95。C90s;(95。C5s，58。C30s，80°C10s)40个循环，其中80°C10s结束时间点为荧光信号检测点。制作溶解曲线的程序为95°Clmin;58°Clmin;(58'Cl0s)80个循环，每个循环温度升高0.5°C。釆用BIO-RAD公司iCyclerTMIQversion5.0软件进行计算分析，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量(copies4iL)。⑥重组表达质粒的构建将经鉴定正确的重组质粒pGEM-T-EtPK，利用克隆载体pGEM-T-easy载体和表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点，选择合适的酶EcoRI禾tlXhoI进行双酶切，酶切后回收EtPK片段和pGEX-4T-2片段，连接构建重组表达质粒(pGEX-4T-EtPK)，连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定(PCR鉴定和双酶切鉴定)(见图2)，对筛选的阳性克隆提取质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)。⑦重组表达质粒pGEX-4T-EtPK在大肠杆菌中的表达将鉴定好的pGEX-4T-EtPK/BL21(DE3)转化菌接种于液体LB(含氨苄青霉素)培养基，37'C震荡培养过夜，将培养过夜的菌液按1。/。的比例接种到另一LB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37°C，200r/min，振荡培养2h-3h，使细菌生长至对数生长期，OD600-0.6-1.0时，加入终浓度为1mmoL/L的1丁0诱导表达，在加入1丁0(异丙基-(3-0-硫代半乳糖苷)诱导后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间，发现表达量在诱导6h即达到高峰。EtPK基因的ORF含1527个核苷酸，编码508个氨基酸，理论分子量为55.7KDa,采用GST基因融合表达系统，对目的基因进行高效表达，表达的融合蛋白带有分子量为26KDa的GST标签，则重组质粒4T-EtPK表达的重组蛋白分子量大约为81KDa，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳结果与预期的大小一致(见图3)，从图中也可看到，重组表达质粒在IPTG诱导下2h即出现表达产物，6h达到最高表达量。⑧重组蛋白的分离纯化根据确定的最佳诱导时间，将重组质粒4T-EtPK转化大肠杆菌BL21后，加入终浓度为lmmoL/LIPTG，于37'C摇床振荡培养，诱导重组蛋白的表达，当表达量达到高峰时，离心，收集菌体，确定重组表达蛋白以可溶形式存在，还是以包涵体形式存在，利用GST(谷胱甘肽一S—转移酶)Resin(树脂)纯化重组表达蛋白。由于pGEX-4T-2表达载体在起始密码子之后有GST标记，GST蛋白可被GSTResin亲和层析柱中的谷胱甘肽吸附，而其它蛋白不能结合上去，因此，可利用GSTResin亲和层析柱将目的蛋白吸附，然后再加入还原型的谷胱甘肽，将结合在柱上的融合蛋白洗脱下来，从而达到分离纯化重组蛋白的目的。4T-EtPDI重组表达菌经超声裂解后，离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果发现重组蛋白以包涵体形式存在。采用包涵体蛋白纯化技术，将包涵体蛋白溶解于8mmoL/L尿素中，经透析后复性融合蛋白，再利用GST柱纯化重组蛋白4T-EtPK，SDS-PAGE分析表明获得了较高纯度的重组蛋白(见图4)。◎Western-blot检测重组表达蛋白将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，用柔嫩艾美耳球虫卵囊口服免疫鸡的抗血清(pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理后)作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG为二抗进行Western-blot检测分析(见图5)。本发明又一个目的是提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因在制备新型抗鸡球虫病疫苗中的应用。将纯化的重组蛋白(pGEX-4T-EtPK)加弗氏佐剂和活的重组表达菌以不同剂量(重组蛋白25吗、50吗、100ng三个剂量；重组表达菌150昭、300吗、)分别三次免疫鸡后，用柔嫩艾美耳球虫攻击，同时设空载体pGEX-4T-2表达蛋白GST免疫组，不免疫不攻虫、不免疫攻虫组，结果显示该重组抗原在增重、卵囊产量、病变记分等方面都诱导了部分保护效果。本发明的柔嫩艾美耳球虫新蛋白激酶(EtPK)编码基因的克隆及生物信息学分析如下本试验利用抑制性消减杂交(SSH)技术和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段虫体差异表达基因，获得了一个克隆号为ZB1-A02基因的EST序列，利用RACE技术对EST序列进行了5'端的延伸扩增，将获得的5'端RACE产物测序后与EST序列拼接得到了一个2086bp的DNA片段，进一步利用PCR技术获得了一个1684bp的cDNA，含一个1521bp的开放阅读框，编码508个氨基酸。利用NCBI网站的Blast在线分析发现该序列与己知的柔嫩艾美耳球虫基因无明显同源性。编码的蛋白同源性比较后发现该蛋白与利氏曼原虫(Z^/zwam'a/w/a"/MW)蛋白激酶在337505位氨基酸具有30%的同源性。CDD软件査询NCBI保守区的功能域数据库，表明在320500位氨基酸间具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化功能域，是丝氨酸/苏氨酸特异性激酶的磷酸转移酶亚家族。蛋白功能结构域分析发现该蛋白具有1个酰胺化位点、2个N端糖基化位点、4个酪蛋白激酶II磷酸化位点、9个N端豆蔻酰基化位点和4个PKC磷酸化位点(见表1)。表l编码蛋白的结构功能域分析位点位置氨基酸序列位点名称49—52PGRRAmidationsite.酰胺化位点92—95NLSNN-glycosylationsite203—206NESVN—糖基化位点7—10SFPECaseinkinaseIIphosphorylationsite酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点239—242TAEE381-384SAVD430—433TGGD58—63GSRVAL66—71GLMFSG170-175GATINL250—255GTTSSMN-myristoylationsite272-277GLAVASN—豆蔻酰化位点317—322GTAASL365—370GNFGTG393—398GANAAA420—425GLGVCL19-21SAK194—196TIKProteinkinaseC225—227TVRphosphorylationsite.307—309SGR蛋白激酶磷酸化位点利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(http:〃weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.doprogram-加tigenic)分析其抗原位点,结果发现该蛋白可能有21个抗原位点(见表2)。信号肽、疏水性和跨膜结构分析表明该基因编码的蛋白无信号肽；有一个跨膜结构，160氨基酸位于膜内，6183氨基酸残基位于膜上，84511位于膜外(见图6);疏水性分析显示最大值为2.456，最小值为一3.389，在6381位之间有很强的疏水性,其余部分比较均匀(见图7)。表2EtPK编码蛋白的抗原肽位点分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本发明柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因在孢子发育阶段的分析为了进一步验证抑制性消减杂交(SSH)技术和cDNA微阵列筛选差异表达基因的可靠性以及EtPK基因在柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体中的表达情况，分别提取了柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的总RNA，选择持家基因18sRNA作为内参，利用荧光定量RT-PCR法检测了该基因在柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体中的表达情况。实验结果证明，EtPK基因在柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子阶段都有表达，但在子孢子阶段的表达高于其他两个阶段，且孢子化卵囊阶段的表达要高于未孢子化卵囊阶段。本发明对经上述纯化分离的重组蛋白进行抗鸡球虫抗原性的鉴定将纯化的重组蛋白4T-EtPK进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊口服免疫鸡的抗血清作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG作为二抗进行Western—blot分析。结果4T-EtPDI重组蛋白出现了反应条带，分子量与预期结果大小一致，表明该重组蛋白都具有一定的抗原性。(见图5)重组蛋白(pGEX-4T-EtPK)免疫保护效果的研究将纯化的重组蛋白(pGEX-4T-EtPK，简称4T-EtPK)加弗氏佐剂和活的重组表达菌以不同剂量(重组蛋白25pg、50吗、100吗三个剂量；活的重组表达菌150吗、300吗两个剂量)分别三次免疫鸡(7、17和27日龄)。重组蛋白和GST(谷胱甘肽一S—转移酶)为胸肌多点注射免疫，活菌为口服免疫。三次免疫后第4天用柔嫩艾美耳球虫攻击，同时设空载体pGEX-4T-2表达蛋白GST免疫组，不免疫不攻虫、不免疫攻虫组，结果显示该重组抗原在增重、卵囊产量、病变记分等方面都诱导了部分保护效果(见表3)。表3:鸡免疫试验结果※同一列数值中上标不同者，表示具有显著性差异(P<0.05),相同者表示差异不显著(P>0.05)-平均增重(g)※相对增重(%)卵囊总量(x108)相对卵囊产量(％,肠道病变记分4T-EtPK(25吗)4T-EtPK(50吗)4T-EtPK(,g)GST(25吗)GST(25吗)GST(25吗)不免疫攻虫组不免疫不攻虫活菌C150吗)活菌GOO吗)rabcd一abc304.0±23.0abcd315.5±17.6a275.5±15.6a315.4±22.8abcd280.9±18.9abcd240.5±24.6ab285.9±23.5abcd390.8±16.4e319.4±16.2bed287.8±18.3abed77.880.760.580.771.961.573.210081.773.67.97.17.87.86.27.99.108.19.286.377.967.786.3101.02.9±0.6a1.7±0.4bed85.82.1±0.4bed86.02.3±0.7bed1.8±0.22.9±0.9。bed100.02.6±0.4bed89.42.6±0.4bed1.4±0.6be图l:柔嫩艾美耳球虫新蛋白激酶(EtPK)基因的PCR扩增1、PCR扩增产物M、标准分子量(从上至下依次为2000bp、1500bp，750bp，500bp，250bp，lOObp)图2:重组表达质粒(4T-EtPK)双酶切和PCR鉴定1、PCR鉴定2、EcoRI和XhoI酶切鉴定M、标准分子量(从上至下依次为2000bp、1500bp，750bp，500bp,250bp，lOObp)图3:SDS-PAGE分析4T-EtPK/BL21不同时相的表达蛋白17、重组质粒4T-EtPK在IPTG诱导后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h的表达产物M、标准蛋白质分子量(从上至下94.0KDa，66.2KDa，45.0KDa,35.0KDa，26.0KDa，20.0KDa，14.4KDa)图4:纯化的4T-EtPK重组蛋白1~2、纯化的4T-EtPK重组蛋白3、重组质粒4T-EtPK在IPTG诱导后6h的表达产物M、标准蛋白质分子量(从上至下94.0KDa,66.2KDa，45.0KDa，35.0KDa，26.0KDa，20.0KDa,14.4KDa)图5:重组蛋白Western-Blot分析1、纯化的重组蛋白4T-EtPKM、预染的标准蛋白分子量(从上至下170KDa、130KDa、95KDa、72KDa、55KDa、43KDa、34KDa、26KDa、17KDa、11KDa)，图6:EtPK基因编码蛋白的跨膜结构分析图7:EtPK基因编码蛋白的疏水性分析具体实施例方式实施例1柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因的克隆1、材料(1)实验动物罗曼优质黄羽鸡，购自上海汇中种鸡场，出壳后运回实验室词养，笼具、饲料、饮水等均经严格消毒。(2)实验虫株柔嫩艾美耳球虫(￡//neW柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，编号CAAS21111601，由中国农业科学院上海兽医研究所保存提供。(3)主要试剂Trizol、GeneRaceTMKit购自Invitrogen公司；TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKit购自大连宝生物工程有限公司；Agarose、PGEM-T-easyvector购自Promega公司；JM109感受态细胞购自大连宝生物有限公司；氨苄青霉素、IPTG购自华美生物工程有限公司；DNAMarker购自上海美季生物技术有限公司；DEPC、X-Gal、TagPlusIDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术有限公司；bacto-yeastextract、AgarA、bacto-tryptone为OXOID公司产品。(4)RACE(cDNA末端快速扩增)弓l物利用抑制性消减杂交技术(SSH)和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子)虫体差异表达基因，获得了子孢子阶段和孢子化卵囊阶段虫体高表达基因克隆ZB1-A02。根据其EST(表达序列标签)序列，设计了5'RACE引物(引物由上海赛百盛生物有限公司合成)。5，Primer5，-GACTGTTCATTTCGAGCGGATCCT-3，5'NestedPrimer5，-GACGCTCCCATCCCAAGATCATAA-3'2、方法(1)柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子的收集从4'C冰箱取出保存的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，室温离心，洗去重铬酸钾溶液后，计数孢子化卵囊的数量，按抱子化卵囊5><104个/羽经口感染2周龄无球虫雏鸡。接种后第8天分别收集盲肠和粪便中的卵囊。收集的未孢子化卵囊一部分纯化后液氮保存，另一部分孢子化后收集纯化孢子化卵囊和子孢子，收集纯化的孢子化卵囊和子孢子保存液氮备用。(2)柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子总RNA的提取取液氮中冻存的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取。(3)RACE产物扩增具体步骤按GeneRacer试剂盒操手册进行。扩增获得的RACE产物克隆到PGEM-T-easy载体中，挑选阳性克隆，进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。根据测序结果査找5'RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将两段序列拼接。(4)含ORF(开放阅读框)全长基因的克隆根据拼接的cDNA序列设计上下游引物，进行含ORFcDNA片断的PCR扩增。上游引物5，-AGAACGAGTTGTTGCCAATG-3，下游引物5'-TCAAAGTTTCTTGGGTTCGTAAT-3,以5'RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。反应条件94°C2.0min;94°C30s,52°C40s,72°C2.0min，30个循环，72°C10min。扩增获得的PCR产物经纯化后与pGEM-T-easyVector连接，构建的重组质粒(命名为pGEM-T-EtPK)转化JM109感受态细胞，进行兰白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定，鉴定正确的单菌落送上海英骏生物技术有限公司测序。(5)生物信息学分析利用在线软件ORFfinder(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/gor￡^orf.html)分析获得的新基因的全长cDNA序列，找出编码框。利用ProtParam工具(http:〃cn.expasv.ore/tools/protparam.html)计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成等。利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(ht^p:〃weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.doprogram=antigenic)分析其抗原位点c利用SingalP3.0在线分析软件(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SingnalP/)分析编码蛋白有无信号肽。ProtScale在线分析软件(http:〃www.exoasv.org/cgi-bin/protscale.pl)分析编码蛋白的疏水性。利用TMHMM服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析编码蛋白有无跨膜结构。BLASTp软件(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)以及FASTA软件(http:〃www.ebi.ac.uk/fasta33)用于同源蛋白的搜索，利用CDD(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)软件査询NCBI保守区的功能域数据库，査询有无保守功能域。利用motifscan(http:〃mvhits.isb-sib,ch/cgi-bin/motifscan)，分析功能结构域。3、结果本研究利用抑制性消减杂交(SSH)技术和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段虫体差异表达基因，获得了一个克隆号为ZB1-A02基因的EST序列，利用RACE技术对EST序列进行了5'端的延伸扩增，将获得的5'端RACE产物测序后与EST序列拼接得到了一个2086bp的DNA片段，进一步利用PCR技术获得了一个1684bp的cDNA,含1521bp的开放阅读框，编码508个氨基酸。利用NCBI网站的Blast在线分析发现该序列与已知的柔嫩艾美耳球虫基因无明显同源性。编码的蛋白同源性比较后发现该蛋白与与利氏曼原虫(丄e/;y/wja"/a/"/flW"w)蛋白激酶在337505位氨基酸具有30%的同源性。CDD软件査询NCBI保守区的功能域数据库，表明在320500位氨基酸间具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化功能域，是丝氨酸/苏氨酸特异性激酶的磷酸转移酶亚家族。蛋白功能结构域分析发现该蛋白具有1个酰胺化位点、2个N端糖基化位点、4个酪蛋白激酶II磷酸化位点、9个N端豆蔻酰基化位点和4个PKC磷酸化位点(见表l)。利用北京大学生物信息学中心WebLab中提供的Antigenic程序(http:〃weblab.cbi.pku.edu.cn/program.inputForm.doprogram=antigenic)分丰斤其抗原位点，结果发现该蛋白可能有21个抗原位点(见表2)。信号肽、疏水性和跨膜结构分析表明该基因编码的蛋白无信号肽；有一个跨膜结构，160氨基酸位于膜内，6183氨基酸残基位于膜上，84511位于膜外(见图6);疏水性分析显示最大值为2.456，最小值为一3.389，在6381位之间有很强的疏水性,其余部分比较均匀(见图7)。实施例2柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶(EtPK)基因在大肠杆菌中的表达1、材料(1)主要试剂限制性内切酶购自大连宝生物生物技术有限公司。T4DNA连接酶购自Promega公司，DNAMarker购自上海美季生物技术有限公司。(2)质粒和菌种重组克隆质粒pGEM-T-EtPK为上述克隆在重组质粒。质粒pGEX-4T-2、BL21(DE3)由中国农业科学院上海兽医研究所提供。2、方法(1)重组表达质粒的构建-将经鉴定正确的重组质粒pGEM-T-EtPK，利用克隆载体pGEM-T-easy和表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点，选择合适的酶进行双酶切(XhoI禾卩EcoRI)，酶切后回收EtPK和pGEX-4T-2片段，连接构建重组表达质粒(pGEX-4T-EtPK),连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定(PCR鉴定和双酶切鉴定)，对筛选的阳性克隆提取质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)。(2)重组表达质粒pGEX-4T-EtPK在大肠杆菌中的表达将鉴定好的？0￡乂-4丁-EtPK/BL21(DE3)转化菌接种于液体LB(含氨苄青霉素)培养基，37"C震荡培养过夜，将培养过夜的菌液按"/。的比例接种到另一LB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37。C，200r/min,振荡培养2h-3h，使细菌生长至对数生长期，OD600-0.6-1.0时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导表达，在加入IPTG诱导后0h，2h,4h，6h，8h,10h，12h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间。3、结果构建的重组表达质粒pGEX-4T-EtPK(命名为4T-EtPK)。连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定(PCR鉴定和双酶切鉴定)(见图2)，对筛选的阳性克隆，提取质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)。将重组质粒4T-EtPK转化大肠杆菌BL21(DE3)后，加入终浓度为lmmoL/LIPTG于37'C摇床振荡培养，诱导重组蛋白的表达，发现表达量在诱导6h即达到高峰。EtPK基因的ORF含1527个核苷酸，编码508个氨基酸,理论分子量为55.7KDa，采用GST基因融合表达系统，对目的基因进行高效表达，表达的融合蛋白带有分子量为26KDa的GST标签,则重组质粒4T-EtPK表达的重组蛋白分子量大约为81KDa，SDS-PAGE电泳结果与预期的大小一致(见图3)，从图中也可看到，重组表达质粒在IPTG诱导下2h即出现表达产物，6h达到最高表达量。序列表SEQIDNO.1本发明柔嫩艾美耳球虫一种新蛋白激酶(EtPK)基因序列d为起始密码子，TAG为终止密码子)AGAACGAGTTGTTGCCAATGGAGAGTCCACCAGTMGCTTTCCCGAGGCAGTGCCTGGTGCGTACTCCGAAAGTGCTAAGGCCCCTATAGAGMGCCAAAGMCAAAGTMCAAACGAAGCAGAGGGAGATGACAGCMTGCTTTCTTCCTAAACGCGCGGCCTGGCCGACGGCAGCAGCGGCAAGTTGGCTCGCGCGnGCTCTGGGTnTGGCCTGATGTTTTCCGGCCTTGTTGCAGCTATCCTATCTAGCCTGCTGTTGCGGCAGCTCCMGMCCTCCCCGAGTCMCCTGTCCAACGCATGGCAGCAGCTGGAGTCGCAGGAGGCGACGTGGCTGCTTCCTACTGTAGACCAGCMGAAGTAGCGGCTCACCCTCGCTTGGCCATGGGTAAATGGTTGCTTGCAGATGCAGTTAACTTTAGGCAAGCAGCTGACATGCAGTGGCGGGGCCCGCTAGGCCGGGAGTTAATGCTCGTTCTTGCTGAGCACCTCACAAAGGGAAGGTCAAGCAGTGTGATAGGCGCCACGATCAACTTGGTMACACGCAGCAGTTAGGTTATCCTGMGTCGACCCAACCCCACACCCTTTTACCATAAAGCGCTATCTATATGAAGACAATGAGTCTGTTACCTTGGAGATAGTAGATCMGCMCGAATTTGCCTTATGCCATGCGGCTGCGCACCGTGCGACCTCGCGTCCACGGTGAGGACGTGCTGCCAGAGACAGCGGAGGMCTGAATCAGCGGTCCTTGGTGGGGACCACTAGCTCTATGCTTCAgGCMTTGGGGAGTCGGATCTGCGAGACGCAGCAGAGGAGAGGGGCTTGGCTGTTGCATCTGCCGTTGCTACGATCCAAGGCGTGCCCACGGTCATGCGCGGCAGTACTGTTTACCTGGTGGCTGACGTTGAGCTGGGTGAGGTTTACAGCGGTCGCTTGAGTGATATATTCGCAGCAGGGACTGCTGCCTCTTTGGAGGCTMGGAGCACGCAGCGAGCCGAATGCTGCTGCAGGTGTTGCAGTTGCAGCACGCCCGATTCAGCCACMCAATCTGAAGCTTGAAAACTTTTTCATGCGGCCAGACGGCTCTTTTCTACTGGGAAACTTTGGCACTGGTACCCCCATAGGCGAGCGCCTAGACAGAGTCAGCGCTGTGGACCCAAAATATGCGGAGATGGAGCTAGGTGCCAACGCTGCAGCTGCTGAGGCTGAGGGGGAGGAAGATCTCGCCAAACCTGTAGTTGACGAGMGTCGGATATGTGGGGCTTGGGTGTTTGTCTATACAAAATATTCACAGGCGGCGATATGCCTTTTGACCTGGCCTCAGAAGACCCTCCTGCATCCGTCTTCTCGTTTATGAAGGAACACAGMTGAGCGGGCAGGCGCTGCGTGGTCGGCTGACAGATTTGGGGGTGCCTGTCAGGTGGCCTTCTACACCTGCGGGGTGTGTAGCCGTAAAGATTGGGACGCAGTTCATAATGGCGACCTACTGGTATTTTATGATCTTGGGATGGGAGCGTCAGCGTCACTGGCACGGTGGATGTTCAGGTGACACCAGTTTACTCTTCAATTACGMCCCMGAAACTTTGA权利要求1、一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因，其特征在于所述该柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因具有下列序列AGAACGAGTTGTTGCCAATGGAGAGTCCACCAGTAAGCTTTCCCGAGGCAGTGCCTGGTGCGTACTCCGAAAGTGCTAAGGCCCCTATAGAGAAGCCAAAGAACAAAGTAACAAACGAAGCAGAGGGAGATGACAGCAATGCTTTCTTCCTAAACGCGCGGCCTGGCCGACGGCAGCAGCGGCAAGTTGGCTCGCGCGTTGCTCTGGGTTTTGGCCTGATGTTTTCCGGCCTTGTTGCAGCTATCCTATCTAGCCTGCTGTTGCGGCAGCTCCAAGAACCTCCCCGAGTCAACCTGTCCAACGCATGGCAGCAGCTGGAGTCGCAGGAGGCGACGTGGCTGCTTCCTACTGTAGACCAGCAAGAAGTAGCGGCTCACCCTCGCTTGGCCATGGGTAAATGGTTGCTTGCAGATGCAGTTAACTTTAGGCAAGCAGCTGACATGCAGTGGCGGGGCCCGCTAGGCCGGGAGTTAATGCTCGTTCTTGCTGAGCACCTCACAAAGGGAAGGTCAAGCAGTGTGATAGGCGCCACGATCAACTTGGTAAACACGCAGCAGTTAGGTTATCCTGAAGTCGACCCAACCCCACACCCTTTTACCATAAAGCGCTATCTATATGAAGACAATGAGTCTGTTACCTTGGAGATAGTAGATCAAGCAACGAATTTGCCTTATGCCATGCGGCTGCGCACCGTGCGACCTCGCGTCCACGGTGAGGACGTGCTGCCAGAGACAGCGGAGGAACTGAATCAGCGGTCCTTGGTGGGGACCACTAGCTCTATGCTTCAgGCAATTGGGGAGTCGGATCTGCGAGACGCAGCAGAGGAGAGGGGCTTGGCTGTTGCATCTGCCGTTGCTACGATCCAAGGCGTGCCCACGGTCATGCGCGGCAGTACTGTTTACCTGGTGGCTGACGTTGAGCTGGGTGAGGTTTACAGCGGTCGCTTGAGTGATATATTCGCAGCAGGGACTGCTGCCTCTTTGGAGGCTAAGGAGCACGCAGCGAGCCGAATGCTGCTGCAGGTGTTGCAGTTGCAGCACGCCCGATTCAGCCACAACAATCTGAAGCTTGAAAACTTTTTCATGCGGCCAGACGGCTCTTTTCTACTGGGAAACTTTGGCACTGGTACCCCCATAGGCGAGCGCCTAGACAGAGTCAGCGCTGTGGACCCAAAATATGCGGAGATGGAGCTAGGTGCCAACGCTGCAGCTGCTGAGGCTGAGGGGGAGGAAGATCTCGCCAAACCTGTAGTTGACGAGAAGTCGGATATGTGGGGCTTGGGTGTTTGTCTATACAAAATATTCACAGGCGGCGATATGCCTTTTGACCTGGCCTCAGAAGACCCTCCTGCATCCGTCTTCTCGTTTATGAAGGAACACAGAATGAGCGGGCAGGCGCTGCGTGGTCGGCTGACAGATTTGGGGGTGCCTGTCAGGTGGCAGGAATTAATTACAGGCCTCTTGGAGATTGATAGAGACGACAGACTGGACGCAGAAACGGTGTCCAGGGAGTTCCAGGATCTTCTACACCTGCGGGGTGTGTAGCCGTAAAGATTGGGACGCAGTTCATAATGGCGACCTACTGGTATTTTATGATCTTGGGATGGGAGCGTCAGCGTCACTGGCACGGTGGATGTTCAGGTGACACCAGTTTACTCTTCAATTACGAACCCAAGAAACTTTGA；所述ATG为起始密码子；TAG为终止密码子。2、根据权利要求1所述的一种柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因，其特征在于所述基因全长1684bp，含1527bp的开放阅读框，编码508个氨基酸；在320-500位氨基酸间具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化功能域，该基因编码的蛋白是丝氨酸/苏氨酸特异性激酶的磷酸转移酶亚家族；生物信息学分析该基因编码的蛋白具有1个酰胺化位点、2个N端糖基化位点、4个酪蛋白激酶II磷酸化位点、9个N端豆蔻酰基化位点和4个PKC磷酸化位点；具有一个跨膜结构，160氨基酸位于膜内，6183氨基酸残基位于膜上，84511位于膜外。3、一种如权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因的克隆和表达方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)试剂与材料Trizol、GeneRaceKit;TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKit、限制性内切酶；pGEM-T-easyvector;DEPC、X-Gal、TagPlusIDNA聚合酶；bacto-yeastextract、AgarA、bacto-tryptone;丙烯酰胺、N,N'-亚甲基甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵；HRP—羊抗兔IgG3;HRP—羊抗鸡IgG;蛋白质预染Marker;High-AffinityGSTResin;罗曼优质黄羽鸡；柔嫩艾美耳球虫；pGEX-4T-2表达载体、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21DE3;(2)方法①RACE引物的合成利用抑制性消减杂交技术和cDNA微阵列技术筛选柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段的未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子虫体差异表达基因，获得了子孢子阶段虫体高表达基因克隆ZB1-A02、根据其EST序列，该EST序列含有PolyA尾，设计了5，RACE引物5，Primer5'-GACTGTTCATTTCGAGCGGATCCT-3，5,NestedPrimer5，-GACGCTCCCATCCCAAGATCATAA-3，；②RACE产物的扩增利用合成的引物进行RACE产物的扩增，扩增获得的RACE产物克隆到pGEM-T-easy载体中，挑选阳性克隆，进行测序，根据测序结果査找5'RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将两段序列拼接；③含完整ORF全长基因的克隆根据拼接的cDNA序列设计上下游引物，进行含ORFcDNA片断的PCR扩增；上游引物5，-AGAACGAGTTGTTGCCAATG-3，下游引物5'-TCAAAGTTTCTTGGGTTCGTAAT-3，以5'RACE扩增时mRNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应条件94°C2.0min;94°C30s，52°C40s，72°C2.0min，30个循环，72。C10min;扩增获得的PCR产物经纯化后与pGEM-T-easyVector连接，构建的重组质粒pGEM-T-EtPK转化JM109感受态细胞，进行兰白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定，对鉴定正确的阳性菌落测序；生物信息学分析利用在线软件ORFfinder分析获得的新基因的全长cDNA序列，找出编码框；ProtParam工具计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成；Antigenic程序分析其抗原位点；利用SingalP3.0在线分析软件分析编码蛋白有无信号肽；ProtScale在线分析软件分析编码蛋白的疏水性；利用TMHMM服务器分析编码蛋白有无跨膜结构；BLASTp软件以及FASTA软件用于同源蛋白的搜索；利用CDD软件査询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域；利用motiflscan分析功能结构域；⑤荧光实时定量RT-PCR:选择18SrRNA看家基因作为内参，标化反应结果，提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子的总RNA，去除基因组DNA后，利用随机引物反转录成cDNA第一链，EtPK基因定量PCR的引物为SensePrimer:5'-GTGGCTGCTTCCTACTGTAGACC-3'，AntisensePrimer:5'-CACTGCTTGACCTTCCCTTTG-3'18SrRNA的引物为SensePrimer:5'-GAGTATGGTCGCAAGGCTGA-3'，AntisensePrimer5'-CAGGCTAAGGTCTCGTTCGTT-3'反应体系如下成分体积0lL)5XRT-PCR缓冲液5.0Mg2+250mmoL/L0.3dNTP10mmoL/L0.75上游引物lOpmoL/L0.5下游引物10nmoL/L0.525XEvaGreen1.0HS誦Ex-TagTagDNA聚合酶5U>L0.25模板cDNA第一链2.0灭菌去离子水14.7总体积25.0反应程序95°C90s;95°C5s，58°C30s，80。C10s40个循环，其中80°C10s结束时间点为荧光信号检测点；制作溶解曲线的程序为95°Clmin;58°Clmin;58°C10s80个循环，每个循环温度升高0.5°C。采用BIO-RAD公司iCyclerTMIQversion5.0软件进行计算分析，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量；⑥重组表达质粒的构建将经鉴定正确的重组质粒pGEM-T-EtPK，利用克隆载体pGEM-T-easy和表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点，选择合适的限制性内切酶EcoRI禾BXhoI进行双酶切，酶切后回收EtPK和pGEX-4T-2片段，连接构建重组表达质粒pGEX-4T-EtPK，连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行阳性克隆的鉴定，对筛选的阳性克隆提取质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3);⑦重组表达质粒pGEX-4T-EtPK在大肠杆菌中的表达将鉴定好的pGEX-4T-EtPK/BL21(DE3)转化菌接种于液体LB含氨苄青霉素培养基，37'C震荡培养过夜，将培养过夜的菌液按P/。的比例接种到另一LB含氨苄青霉素液体培养基中，37°C，200r/min，振荡培养2h-3h，使细菌生长至对数生长期，OD600=0.6-1.0时，加入终浓度为1mmoL/L的IPTG诱导表达，在加入IPTG诱导后0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间；⑧重组蛋白的分离纯化根据确定的最佳诱导时间，将重组质粒4T-EtPK转化大肠杆菌BL21后，加入终浓度为lmmoL/LIPTG，于37'C摇床振荡培养，诱导重组蛋白的表达，当表达量达到高峰时，离心，收集菌体，确定重组表达蛋白以可溶形式存在，还是以包涵体形式存在，利用GSTResin纯化重组表达蛋白；◎Western-blot检测重组表达蛋白将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，用柔嫩艾美耳球虫卵囊口服免疫鸡的抗血清经pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理后作为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗鸡IgG为二抗，进行Western-blot检测分析。4、一种如权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶基因表达的蛋白在制备抗鸡球虫病疫苗中的应用。全文摘要本发明公开了柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)的一种新蛋白激酶(EtPK)基因，克隆号ZB1-A02，全长1684bp，含有一个1527bp的ORF，编码508个氨基酸(Genbank登录号EF552216)。本发明将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-2，构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtPK，并在大肠杆菌系统中进行了表达，表达的重组蛋白以包涵体形式存在。通过纯化重组蛋白4T-EtPK进行SDS-PAGE，再转移至PVDF膜上，用E.tenella卵囊口服免疫鸡的抗血清作为-抗，羊抗鸡IgG作为二抗进行Western-blot分析，表明它有一定的抗原性，能用于研制抗鸡球虫病药物和制备抗鸡球虫病疫苗。文档编号A61K39/00GK101575606SQ20081003719公开日2009年11月11日申请日期2008年5月9日优先权日2008年5月9日发明者倩姚,姜连连,李玉剑,林矫矫,樊玉娟,辉董,赵其平,韩红玉,彦颜,兵黄申请人:中国农业科学院上海兽医研究所