专利名称：：针对禽流感病毒的重组联合dna疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种针对禽流感病毒的DNA联合重组疫苗。它同时利用HA和NP两种病毒蛋白而达到对于H5亚型禽流感病毒甚至更多禽流感病毒的抵抗，在防御禽流感方面具有非常重要的应用价值。
背景技术：
：禽流感(AvianInfluenza,AI)是禽流行性感冒的简称，是由A型流感病毒(AvianinfluenzavimstypeA)引起的一种从呼吸系统到全身败血症等多种症状的急性高度致死性的传染病，被世界卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。我国把它列为一类动物传染病。流感病毒由特异的不具交叉反应的核糖核蛋白抗原区分为三个不同的抗原型，即A、B、C三型，禽流感病毒属于A型。A型流感病毒根据其表面蛋白一一血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)分为若干亚型，目前已知的HME型有15个，N亚型有9个。世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7两种亚型引起，目前在越南、韩国和日本等地流行的禽流感病毒属H5N1型。但随着人类感染禽流感病毒而发病的事例的出现，人们不得不意识到，高致病性禽流感病毒也有可能像SARS病毒一样，引起一场大范围传染性灾难。高致病性禽流感具有几个特点高传播性，禽传禽的特点和候鸟的迁徙带来很大威胁，而禽传人的可能又存在着相当大的隐患；难预防，禽流感和普通流感的症状相差不多，初期很可能被忽视，可其致死率却大大高于普通流感；高变异性，禽流感病毒的高变异性使得治疗性药物和疫苗的研发面对相当大的挑战。针对H5N1禽流感病毒，已经有一些实验室开展了研究工作，并且取得了一定的成绩。对于H5N1病毒的预防，疫苗是非常关键的一个手段。从国内爆发禽流感疫情以来，很多生物公司都研制出不同的疫苗来抵御禽流感病毒，比较有代表性的有H5N2禽流感灭活疫苗、H5/H9二价禽流感灭活疫苗、H5N1重组禽流感病毒灭活疫苗和H5禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗等。从现有技术已开发的疫苗来看，大多是采用灭活方法得到的蛋白疫苗。但是这种疫苗的应用存在很多弊端，比如生产周期长，成本高，仅仅是利用鸡胚培养病毒再进行灭活的过程就要几个月时间，而且对于鸡胚等的消耗量非常大，得率却很低，并且对于储存条件的要求很高，这些都延长了周期和提高了生产成本。而且蛋白类疫苗也无法有效面对禽流感病毒的高变异性，不管是效果还是生产制作的时间都有弊端。因此，本领域还需要开发对于防治禽流感更有效的疫苗，它不但可以降低生产成本，以最快的速度进行合成，并且可以在一定程度上解决新亚型病毒出现的问题。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于防治禽流感的联合疫苗，其制备方法和用途。在本发明的第一方面，提供一种重组载体，所述的重组载体含有(1)操作性相连的启动子l，H5N1流感病毒血凝素(HA)编码基因和终止子；和(2)操作性相连的启动子2，H5N1流感病毒核蛋白(NP)编码基因和终止子。在一个优选例中，所述的启动子1或启动子2选自EF-la启动子，和/或CMV启动子；且，所述的启动子1和启动子2相同或不同。在另一优选例中，所述的启动子l是EF-la启动子；所述的启动子2是CMV启动子。在另一优选例中，所述的重组载体是pBudCE4.1。在本发明的第二方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述的重组载体。在另一优选例中，所述的细胞是真核细胞。在另一优选例中，所述的细胞是HEK293T细胞。在本发明的第三方面，提供所述的重组载体的用途，用于制备防治禽流感的组合物。在另一优选例中，所述的组合物还用于提高动物体内的IFN-Y值。在本发明的第四方面，提供一种防治禽流感的组合物，所述组合物含有有效量(0.00001-50wt。/o;较佳的0.0001-10wt。/。；更佳的0.01-lwt0/。，如0.1%)的所述重组载体；以及药学上可接受的载体。在本发明的第五方面，提供一种防治禽流感的药盒，所述的药盒中含有所述的组合物，或所述的重组载体。另一方面，还提供一种防治禽流感的方法，所述方法包括给予需要防治的对象有效量的所述的重组载体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图lA显示了p-HA，p-NP和p-HA+NP分别被Notl/XholI和BamHI/HindlII酶切后的DNA片段；其中，p-HA+NP即为本发明的双价重组DNA疫苗；HA和NP的基因片段约为1.7K和1.5K。图lB显示了pBudCE4.1(Vector),p-HA，p-NP和p-HA+NP转染HEK293T细胞的表达情况。这两张图证明了p-HA+NP的联合重组是成功克隆的。图2显示了免疫2次后7天抗体滴度的情况，其中阳性(边)和阳性(H5N2)都是阳性血清对照，Vecl是阴性血清对照，NP1和HA是单价疫苗的血清，HA+NP是联合疫苗的血清。这张图证明了联合疫苗可以得到高的抗体滴度。图3显示的是T淋巴细胞杀伤实验(即CTL实验)。其中HA和NP代表单价疫苗得到的杀伤率，H+N代表的是联合重组疫苗得到的杀伤率，Vector是阴性对照。具体实施例方式本发明人经过广泛的研究和反复的试验，意外发现将H5N1流感病毒血凝素(HA)和H5N1流感病毒核蛋白(NP)的编码基因克隆入携带双启动子的载体中，制成的双价DNA疫苗在免疫动物后，可在动物体内良好地诱发分别抗HA和NP的抗体，且抗体的效价很高。并且，所述双价DNA疫苗在免疫动物后，可诱导体内高的IFN-Y值，从而有效提高动物的免疫抵抗能力。本发明提供了一种重组载体(双价DNA疫苗)，所述的重组载体含有(1)操作性相连的启动子l，H5N1流感病毒血凝素(HA)编码基因，终止子；和(2)操作性相连的启动子2，H5N1流感病毒核蛋白(NP)编码基因和终止子。本发明人经过反复试验，从多种禽流感病毒相关蛋白(包括NA，M，NP，HA，NS等)中选择HA蛋白和NP蛋白，将所述蛋白的编码基因克隆入具有双启动子的载体中，获得了高效的可抵御多种不同亚型禽流感病毒的疫苗。HA蛋白和NP蛋白均是H5N1流感病毒的蛋白。H5N1流感病毒的染色体基因组是由分子量不同的8个单链RNA片段组成，每个片段分别转录和复制不同的蛋白质。本病毒颗粒呈球形、杆状或长丝状，为多形性，其直径约80-120nm，表面有一层棒状和蘑菇状的纤突(Spike)，对红细胞有凝集性，称血凝素(HA)。病毒内部的核蛋白(NP)主要用途是"挟持"并潜入宿主细胞。本发明人研究发现，单纯以HA或者NP的基因来制备DNA疫苗，只能发挥局限性的作用，诱发的细胞免疫产生的IFN-Y值也不够高。采用本发明的双价DNA疫苗，在出现H5亚型禽流感疫情时，可以迅速的发挥有针对性的抵抗作用，甚至产生中和性抗体及时清除病毒。在出现非H5亚型禽流感疫情时，由于NP蛋白的相对保守性，其产生的抗体和CTL反应可以尽可能的抵抗多种亚型禽流感病毒，达到延迟病毒侵袭的作用。这种联合疫苗同时发挥了两种关键蛋白的优势，使得高效且广谱地抵御未知禽流感成为可能。并且，采用本发明的双价疫苗，可显著地提高IFN-Y值，从而增强免疫动物的免疫抵抗能力。与融合表达HA和NP的DNA疫苗相比，本发明可更完整地保留HA和NP的抗原决定簇，效果更优异。所述的重组载体是双启动子的载体，优选的，所述的载体还具有至少一个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。所述的启动子是适合迸行真核表达的启动子。作为本发明的优选方式，所述的启动子选自EF-la启动子，和/或CMV启动子。其中，所述的启动子1和启动子2可以是相同或不同的。更佳的，所述的启动子l是EF-lci启动子，用于驱动HA的表达；所述的启动子2是CMV启动子，用于驱动NP的表达。终止子的设置是本领域人员熟知的技术。所述的重组载体通常是一种真核载体，作为本发明的优选方式，所述的重组载体是插入了HA基因和NP基因的pBudCE4.1载体。本发明人发现，pBudCE4.1载体特别适合于用于构建本发明的重组载体，作为DNA疫苗。本发明的DNA疫苗可刺激机体产生特异性体液和细胞免疫反应，尤其可以诱导产生杀伤性T淋巴细胞，对病毒、细菌、寄生虫所引起的传染病有重要的预防作用和潜在的治疗作用。它与灭活疫苗等蛋白疫苗产品相比，具有以下非常显著的特点无感染危险、诱发针对天然蛋白质表位的抗体、诱发特异性细胞毒T细胞免疫反应、长期持续的免疫反应、稳定性不受温度影响、纯化容易，生产成本低、具备预防和免疫治疗双重功能、定向诱导以Thl为主导的免疫反应。本发明的DNA疫苗在免疫动物后，可同时产生针对HA和NP的抗体，滴度约1:50000左右；对于HA的肽和NP的肽混合进行细胞毒T细胞杀伤实验超过51%;对于H5N1灭活病毒进行细胞毒T细胞杀伤实验超过42M。本发明还提供了一种基因工程化的细胞(宿主细胞)，所述的细胞含有所述的重组载体。大量制备本发明的重组质粒的方法是本领域人员已知的，通常是将所述重组质粒转入适合的宿主细胞中，大量培养细胞后收集细胞，然后进行质粒提取。质粒的提取可按照本领域常规的技术。可选择的，在提取质粒后，对所获得的质粒进行纯化，这也可采用本领域常规的纯化技术。由于所述的重组载体可良好地诱导防御性抗体的产生，只需给予受试者较低剂量的本发明的重组载体即可具有良好的免疫效果。本发明的重组载体与单独采用携带HA基因的载体或携带NP的载体相比，产生相同的免疫效果所需的给予的量显著降低，有效避免了基因浪费，提高免疫的效率，且操作简易。本发明还提供了所述的重组载体的用途，用于制备防治(特别是预防)禽流感的组合物。其还用于制备提高动物体内的IFN-Y值的组合物。本发明还提供一种防治禽流感的组合物，所述组合物是指将本发明的重组载体和药学上可接受的载体混合后获得的可用于防治(特别是预防)禽流感的组合物。所述"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对于疫苗，所述的药学上可接受的载体例如包括一种佐剂。在用于给药时，通常0.1-10mg/kg体重，较佳的0.5-2mg/kg体重是适合的；优选的可进行多次给药，以产生良好的免疫效果，例如可间隔l-3周进行重复给药。本发明还提供了一种防治禽流感的药盒，其中含有所述的组合物，或所述的重组载体。此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例l重组疫苗的构建以H5Nl病毒(获自武汉病毒所)反转录获得的cDNA为模板，以5TTGCGGCCGCATGGAGAAAATAGT3;和5CCGCTCGAGAGAATGCAAATTCTGC3为引物，扩增获得HA(GenBank登录号AY950232)编码基因，用限制性内切酶Notl/XholI酶切后插入到经过同样酶切的pBudCE4.1载体(购自Invitrogen)上，位于EF-la启动子后，获得pBudCE4.1-HA(p-HA)。以H5Nl病毒反转获得的cDNA为模板，以5CCCAAGCTTGATGGCGTCTCAAGGC3;禾卩5CGCGGATCCATTGTCATACTCCTC3为引物，扩增获得NP(GenBank登录号AY950253)基因，用限制性内切酶BamHI/HindlII酶切后插入到经过同样酶切的pBudCE4.1-HA载体上，位于CMV启动子后，获得pBudCE4.1-H+N(p-HA+NP，p-H+N)。此外，将NP基因用限制性内切酶BamHI/HindlII酶切后插入到经过同样酶切的pBudCE4.1载体上，位于CMV启动子后，获得pBudCE4.1-NP(p-NP)。将前述构建的载体常规方法转化E.coliDH5a(购自TaKaRa公司)，从而进行质粒的扩增和纯化。实施例2DNA疫苗的大量合成培养转入前述构建的直立的E.coliDH5cc，收集菌体，采用德国QIAGEN公司大抽试剂盒抽提和纯化质粒，纯化获得的质粒作为DNA疫苗。用上述方法获得的各DNA疫苗的浓度约为1000-2000)ag/ml(表l)。取少量上述获得的DNA疫苗，酶切验证，结果如图1A所示。从图中可以看出，联合疫苗经过酶切后可以得到和单价疫苗p-HA相同的HA片段，也可以得到和单价疫苗p-NP相同的NP片段。图lB显示了pBudCE4.1(Vector)，p-HA，p-NP和p-HA+NP转染293T细胞后蛋白的表达情况。图1A-B证明，p-HA+NP的联合重组是成功克隆的。各载体(DNA疫苗)转染细胞后，上述方法培养细胞并进行质粒抽提、纯化后，便可用于免疫小鼠。纯化得到质粒的各项指标由Gene-QuantIIRNA/DNACalculator(Biotech公司生产)测量得到(表1)。表1重组表达载体ABS(吸光值)Ratio(A260/A280)浓度pBudCE4.10.7581.7001999.2ug/mlpBudCE4.1-HA(P隱HA)0.4831.7082677.7iig/mlpBudCE4.1-NP(P-NP)0.2891.7641751.9Pg/mlpBudCE4.1-H+N(p-HA+NP)0.4891.6531291.7iig/ml实施例3免疫方法与血清的抗体滴度取6-8周龄的Balb/c雌鼠，每只按照50ugDNA疫苗/100u1PBS进行免疫，使用小型胰岛素注射器注射大腿内侧肌肉，进针时针口面朝外慢慢推入，每只大腿注射50ulPBS，拔出针头后在针孔两侧以针孔为中心迸行电击。电极和仪器为ECM830购自美国BTX公司。一共免疫3次，两次免疫之间的时间间隔为3周。在免疫第2次或第3次后7天进行静脉取血，将血液在4。C下沉淀24小时后离心，取上方无色或淡黄色的血清。H5Nl灭活病毒抗原包被浓度为10ug/mL，一抗为各个免疫组血清(50iU/孔，1:100起)，二抗用羊抗鼠-HRP检测。免疫第2次后7天抗体滴度的情况见图2，可见联合疫苗可以得到高的抗体滴度。进一步的验证结果可以得知，p-HA+NP组可在体内得到分别针对HA和NP的抗体，且所需使用的剂量更低。实施例4IFN-Y值小鼠经各DNA疫苗免疫之后，取脾细胞(去红细胞)在96孔板中进行培养，刺激物分别是空、BSA(10ug/ml)、H5N1灭活病毒(10Hg/ml)、ConA(lOyg/ml),在37。C/5。/。C02环境中剌激48小时，之后取上清测定其IFN-Y值。取出ELISA专用板，加入IFN-Y标准品包被液在4t放置过夜。之后弃去包被液，每孔加200ul封闭液，封好口，室温放置3小时。用PBS-TWEEN20洗液洗5minX3次。用稀释液稀释样品和标准品，每孔加100ul。封好口，室温放置2小时，其中IFN-y标准品稀释浓度为0.00，62.50，125.00，250.00，500.00，1000.00，2000.00，4000.00pg/ml。洗后，稀释液稀释生物素化的抗IFN-Y检测抗体(购自美国SantaCruz公司)2ug/ml，每孔加100ul(注意要加到底部)。封好口，室温1小时。洗后再用稀释液稀释亲和素辣根过氧化物酶Av-HRP(购自Sigma美国Sigma公司)h1000，每孔加100iU(注意要加到底部)。封好口，室温30分钟(少见光)。最后洗后每孔加100ul底物进行显色。结果见图3，图中BSA作为无关抗原，H5N1是主要抗原，刀豆素A(ConA)是阳性对照。HA和NP用于对照用。横坐标代表的是各个DNA疫苗的免疫组，纵坐标代表的是IFN-Y浓度值。从图中数据可以看出，p-HA+NP疫苗组经H5Nl灭活病毒的刺激能够得到比单价疫苗更高的IFN-Y值，从而说明其可以引起很显著的Thl方向的反应，从而使被免疫的动物具备优秀的免疫抵抗能力。实施例5细胞毒T细胞杀伤实验(CTL)按照实施例3的方法，分别用pBudCE4,l-HA(HA)、pBudCE4.1-NP(NP)、pBudCE4.1-H+N(H+N)免疫6周龄Balb/C雌性小鼠。从Nai'veBalb/C小鼠体内分离脾细胞(去红细胞)，将其分成两部分一部分用HA肽和NP肽以10ug/ml(或病毒以50ixg/ml)的浓度在37。C时刺激l小时(或对于病毒为刺激4小时)；另一部分不作处理。之后，将进行过刺激处理的脾细胞染CFSE(购自美国MolecularProbes公司)5PM，未进行过刺激处理的脾细胞染CFSE0.5uM。最后将两部分细胞以相同的数量混合，对已经分别免疫过pBudCE4.1(空载体)、pBudCE4.1-HA、pBudCE4.1-NP或pBudCE4.1-H+N的DNA疫苗的Balb/C小鼠进行尾静脉注射，每只小鼠2乂107个细胞/400111PBS。杀伤4小时后，取小鼠脾脏并分离脾细胞(去红细胞)再进行流式检测。CTL杀伤实验结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2的结果证明，联合疫苗可以得到比单价疫苗更好的杀伤率，且证实了其对于HA和NP肽分别的杀伤作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体含有(1)操作性相连的启动子1，H5N1流感病毒血凝素编码基因和终止子；和(2)操作性相连的启动子2，H5N1流感病毒核蛋白编码基因和终止子。2.如权利要求l所述的重组载体，其特征在于，所述的启动子1或启动子2选自EF-la启动子，和/或CMV启动子；且，所述的启动子1和启动子2相同或不同。3.如权利要求l所述的重组载体，其特征在于，所述的启动子l是EF-la启动子；所述的启动子2是CMV启动子。4.如权利要求l所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体是pBudCE4.1载体。5.—种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求l所述的重组载体。6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述的细胞是真核细胞。7.权利要求l所述的重组载体的用途，其特征在于，所述的重组载体用于制备防治禽流感的组合物。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于提高动物体内的IFN-Y值。9.一种防治禽流感的组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的权利要求l所述的重组载体；和药学上可接受的载体。10.—种防治禽流感的药盒，其特征在于，所述的药盒中含有权利要求9所述的组合物，或权利要求l所述的重组载体。全文摘要本发明公开了一种重组载体(DNA疫苗)，所述的重组载体含有操作性相连的启动子1，H5N1流感病毒血凝素(HA)编码基因，终止子；和操作性相连的启动子2和H5N1流感病毒核蛋白(NP)编码基因，终止子。本发明还公开了含有所述重组载体的组合物以及药盒。文档编号A61P31/16GK101575608SQ200810037040公开日2009年11月11日申请日期2008年5月7日优先权日2008年5月7日发明者兵孙,靓孙,可徐申请人:中国科学院上海生命科学研究院