专利名称：重组病毒、保持该重组病毒的大肠杆菌及其制备方法
技术领域：
本发明涉及对疫苗开发或基因治疗载体开发等有用的重组病毒制备方法、保持单 纯疱疹病毒II型的基因组全长的重组病毒和保持该重组病毒的大肠杆菌。
背景技术：
为了制备称为基因治疗载体或多价疫苗的重组病毒，必须在病毒基因组的任一区 域插入外源基因。但是，得到的重组病毒存在缺失原来的基因治疗载体或疫苗的病毒基因 组的基因，或使其性状变化的问题。作为重组病毒的制备技术的现有的方法，已知有利用标记(TK，LacZ)基因的培养 细胞内的同源重组法(非专利文献1)和利用黏端质粒的培养细胞内的同源重组法(非专 利文献2、等，但这些现有的方法均是涉及要插入的外源基因一方的技术，而没有着眼于被 插入一方病毒基因组。而单纯疱疹病毒(HSV :herpes simplex virus)感染症是由HSV-1或HSV-2的感 染引起的。HSV-I主要感染以口腔、上呼吸道粘膜为中心的上半身，诱发口腔炎或唇疱疹。 另一方面，HSV-2主要感染以生殖器为中心的下半身，诱发生殖器疱疹。HSV的疫苗仍没有 被开发。此外，HSV作为基因治疗载体也有用，有几例进入临床试验阶段。为了开发病毒的疫苗或基因治疗载体，需要重组病毒制备的技术。疫苗的开发中， 必须灭活致病因素，而基因治疗载体的开发中，除了需要灭活致病因素之外，还需要载入外 源基因。近年，报告了利用作为大型DNA克隆系统(DNA cloning system)的杆状病毒系统 (bac system,bacterial artificial chromosome system)进行大肠杆菌内的同源重组的 方法，与过去相比，重组病毒的制备变得迅速并且简便。杆状病毒系统中作为核心的材料是保持病毒基因组的大肠杆菌。如果能够获得这 样的大肠杆菌，利用大肠杆菌的遗传学，则各种病毒基因组的改变成为可能。此外，在杆状 病毒系统中，在病毒基因组中插入杆状病毒质粒对大肠杆菌保持基因组是必须的，杆状病 毒质粒的插入存在引起病毒基因组的基因缺失、使野生型的病毒性状变化的问题。但是，在 涉及HSV的利用杆状病毒的保持病毒基因组的大肠杆菌的制备的现有的报告例中，由杆状 病毒质粒(bacmid)的插入引起包装信号(Packaging signal)的缺失(非专利文献3 5)，或者在TK (非必须HSV基因)中插入杆状病毒质粒(非专利文献6)的情况较多。如果 存在这样的缺失或插入，则有时出现不适用于制作多功能载体的情况，而且，也成为病毒自 身在基础研究上应用的障碍。此外，由于杆状病毒质粒为71Λρ，比较大，导致重组病毒的病 原性或限定保持其重组病毒的外源基因的长度，因此需要切除的系统。关于HSV-1，之前报告了通过在UL3以及UL4基因的基因间区域中插入杆状病毒质 粒，成功制备保持具有野生型的性状的全长的感染性HSV-I病毒基因组的大肠杆菌(专利 文献1)。然而，关于HSV-2，没有得到含有实质上保持基因组全长的重组病毒的大肠杆菌。
专利文献1 日本特开2003-189882号公报非专利文献1 =Post L. Ε. et al. Cell24 :555-565,1981非专利文献2 =CunninghamC. et al. Virol. 197 :116-124，1993非专利文献3 Saeki Y. et al. Hum. Gen. Ther. 9 :2787-2794,1998非专利文献4 :Tom Α. S. et al. J. Virol. 72 :7137-7143,1998非专利文献5 Suter Μ. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :12697-12702，1999非专利文献6 =Horsburgh B. C. et al. GeneTher. 6 :922-930,1999
发明内容
本发明的课题在于提供一种不缺失病毒基因组的基因或使其性状变化地在病毒 基因组中插入外源基因的方法。另外，本发明在于提供保持有HSV-2的基因组的全长的重组HSV-2，并提供保持有 该病毒基因组的大肠杆菌。这里，为了对不使目的病毒基因组含有的基因缺失且不对性状产生影响地插入外 源基因而制备重组病毒，本发明的发明人进行了各种研究，发现作为外源基因的插入区域， 如果选择目的病毒基因组中互相呈逆向编码的基因PolyA信号间的区域，则能够容易地制 备目的重组病毒。并且，发现在HSV-2中，如果在UL50和UL51的基因的polyA信号间区域 插入杆状病毒质粒，则可以得到实质上保持HSV-2基因组全长的重组HSV-2，通过在大肠杆 菌中保持该病毒基因组，从而完成了本发明。S卩，本发明在于提供一种重组病毒的制备方法，特征在于在目标病毒基因组中互 相逆向编码的2种基因的polyA信号间的区域(除了 HSV-I的UL3-UL4之间)插入外源基 因。此外，本发明在于提供一种实质上保持野生型病毒基因组的全长的重组病毒基因 组导入大肠杆菌的制备方法，特征在于将在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基 因的PolyA信号间的区域中(除了 HSV-I的UL3-UL4)插入杆状病毒质粒而得到的重组病 毒基因组导入大肠杆菌中。此外，本发明在于提供一种重组HSV-2，其实质上保持野生型HSV-2的基因组全 长，在其基因组的UL50-UL51基因间区域中插入杆状病毒质粒。另外，本发明在于提供一种保持有重组HSV-2基因组的大肠杆菌，该重组单纯疱 疹病毒II型实质上保持野生型HSV-2的基因组的全长，在其基因组的UL50-UL51基因间区 域中插入有杆状病毒质粒。发明的效果根据本发明，能够容易地制备作为疫苗开发或基因治疗载体开发的工具有用的重 组病毒。此外，作为外源基因，如果使用杆状病毒质粒，可以得到保持该重组病毒基因组的 大肠杆菌。由于得到的大肠杆菌显著使病毒改变变得简便，因此利用其而使疫苗开发或基 因治疗载体开发变为可能。此外，由于本发明的重组HSV-2实质上保持野生型HSV-2的基因组全长，因此对用 于基因表达或疫苗开发的载体以及基础研究有用。
图1是表示作为插入部位的polyA信号间区域的图。图2是表示YK336、YK338、YK339的构建工序的图。图3是表示1381和1382的构建工序的图。图4是表示HSV-I、ΥΚ336、ΥΚ338和ΥΚ339的增殖能力的图。
图5是表示HSV-2、ΥΚ381和1382的增殖能力的图。图6是表示pBS-2NC-GFP/BAC的构建工序的图。图7是表示ΥΚ351和YEbac356的构建工序的图。图8是表示1356(在图中用BAC表示)的限制性内切酶的酶切图谱的图。图中， HSV-2(186)为野生型。图9是表示1356(在图中用BAC表示)和野生型HSV-2186 (在图中用186表示) 的增殖能力的图。图中[]内表示MOI (感染复数)。上段表示细胞内病毒量，下段表示细胞 夕卜病毒量。图10表示对小鼠的感染实验结果(生存曲线)。BAC为1356，186为野生型。图11是表示1361的构建工序的图。图12是表示YK801和YIC356的Southern印迹的结果的图。图13表示野生型(wt)和Us3突变导入(US3-KM)的点突变的结果。
具体实施例方式首先，对在目标病毒基因组的特定部位中插入外源基因的方法进行说明。在本发明的方法中，在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基因的polyA信 号间的区域中插入外源基因。作为目标病毒，只要是DNA类型即可，没有特别限制，例如，可 以列举疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、乳头多瘤空泡病毒。目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基因的polyA信号间的区域是指2种 基因相邻存在，且为这2种基因在逆向编码的区域中polyA信号和polyA信号之间的区域 (参照图1)。这些区域能够基于目标病毒的基因组的数据库进行选择。例如HSV-2中，存在 UL3-UL4 区域、UL7-UL8 区域、UL10-UL11 区域、UL15-UL18 区域、UL21-UL22 区域、UL26-UL27 区域、UL35-UL36 区域、UL40-UL41 区域、UL45-UL46 区域、UL50-UL51 区域、UL55-UL56 区域、 Usl-Us2区域和Us9-Usl0区域13处。如果在目标病毒基因组中同一方向编码的2种基因之间的区域中插入外源基因， 则存在破坏启动子的担心。在这点上，如果是本发明方法中所用的polyA信号间区域，则没 有目标病毒的基因的缺失或性状改变。作为外源基因，可以列举杆状病毒质粒、报告基因、编码具有免疫原性的蛋白质的 基因和用于基因治疗的基因等，在以在大肠杆菌中保持重组病毒基因组为目的时，优选杆 状病毒质粒。作为杆状病毒质粒，例如也可以使用在2个IoxP之间夹有杆状病毒质粒的载 体，也可以使用在2个IoxP之间夹有杆状病毒质粒和能够检测的报告基因的载体。这里，作 为能够检测的报告基因，可以使用GFP(绿色荧光蛋白)、CAT(氯霉素乙酰转移酶)、DsRed、 ⑶S(i3葡萄糖醛酸酶)、laCZ、Kaede蛋白、荧光素酶等。其中特别优选为GFP。外源基因向polyA信号间区域的插入，能够利用限制性内切酶位点的通常的克隆方法进行。例如，在质粒中克隆含有目标病毒基因组中作为目的插入位置的上述polyA信 号间区域的片断。通过在所得的质粒的2个polyA信号之间插入在2个IoxP之间夹有外 源基因(根据需要也可导入报告基因)的片段，可以得到在目的PolyA信号间区域中插入 有外源基因的质粒。接着将目标病毒DNA和上述插入外源基因的质粒转染到目标病毒感染的细胞，再 进行同源重组，则能够得到目的的重组病毒。从该感染细胞中，例如通过选择表达报告基因 的细胞，则能够选择目标重组病毒。当得到的重组病毒含有杆状病毒质粒时，通过使该重组病毒基因组导入到大肠杆 菌等的细菌中，则能够得到保持有重组病毒的细菌。可以使得到的重组病毒感染Vero细胞、兔皮肤细胞(rabbit skin cells)等病毒 感染细胞，从其细胞中收集环状病毒DNA，再将其环状病毒DNA导入大肠杆菌中。接着，说明本发明的重组HSV-2的制备方法。本发明的重组HSV-2采用UL50-UL51 间区域作为上述polyA信号间区域，采用杆状病毒质粒作为外源基因。HSV-2中，欲向 UL3-UL4间区域插入杆状病毒质粒，但是没能插入。因此，在向HSV-2中插入杆状病毒质粒 时，UL50-UL51间区域比较适合。首先，构建含有包括UL50-UL51间区域片断的质粒。在该 质粒的UL50-UL51间区域插入杆状病毒质粒。具体而言，使用含有夹在2个IoxP序列中 的杆状病毒质粒的质粒或者含有夹在2个IoxP序列中的杆状病毒质粒和报告基因(例如 GFP)的质粒，将夹在2个IoxP序列中的杆状病毒质粒或者夹在2个IoxP序列中的杆状病 毒质粒和报告基因插入上述质粒的UL50-UL51间区域。接着将野生型HSV-2DNA和所得的重组质粒转染入HSV-2感染的细胞，进行同源重 组，则可以得到实质上保持野生型HSV-2的基因组全长，在其基因组的UL50-UL51基因间区 域中插入杆状病毒质粒的重组HSV-2。这里，实质上是指在不损害功能范围内保持基因组的 全长。如果将得到的重组HSV-2基因组导入到大肠杆菌中，则可以得到保持该重组 HSV-2基因组的大肠杆菌。另外，得到的重组HSV-2由于具有IoxP部位，因此能够用Cre重组酶除去杆状病 毒质粒或者杆状病毒质粒和报告基因。得到的重组HSV-2，或者在大肠杆菌中保持得到的重组HSV-2基因组并从其病毒 基因组再构建的重组HSV-2，具有与野生型HSV-2同程度的增殖能力和病原性，能够作为病 毒载体、疫苗的平台使用。[实施例]接着，列举实施例，详细说明本发明，但是本发明并不受任何限定。在本实施例中，基因克隆及其解析根据Maniates等的分子克隆一实验手册 (Molecular Cloning-Α Laboratory Manual) VXR^^M^^M (Cold Spring Harbor Laboratory) (1982)进行。实验方法按照Ausubel. F等的分子生物学的现有方法(Current Protocols in Molecular Biology) (1987)中详细记载的标准的实验室的方法。实施例1(在基因间区域中插入荧光蛋白质表达框的重组病毒的制备方法)(1)转移质粒的构建
将含有p26. 5-Venus、HSV-I (F)的 UL26. 5 启动子区域(nt 51388 至 nt 51673)、 Venus荧光蛋白质基因、HSV-I UL21和UL22的双向polyA信号的270bp的片段克隆到 pBluescript II KS+(Stratagene)中。将M6· 5-Venus 的 SacI-KpnI 片段克隆到pBR442 (J. Virol. 65 :938-944,1991)的 BamHI 位点中，制备转移质粒 M6. 5-Venus in UL3-4。制备 在将含有 UL50、UL51 的 HSV-I (F)的 BglII-EcoRI 片段(nt 106750 至 nt 110095)克隆至Ij pBluescript II KS+中的质粒的UL50和UL51的polyA信号间区域中导入I^acI位点的质粒 pUL50-51pac。在 pUL50_51pac 的 PacI 位点中克隆入 p26. 5-Venus 的 &icI-KpnI 片段，制备 转移质粒 p26. 5-Venus in UL50-51。制备在将含有 Usl、Us2 的 HSV-1 (F)的 EcoRI-BamHI 片段(nt 131535至nt 136沘9)克隆到pBluescript II KS+中的质粒的Usl和Us2的 PolyA信号间区域中导入I^acI位点的质粒pUsl-2pac。在pUsl-2pac的I^acI位点中克隆 入 p26. 5-Venus 的 SacI-KpnI 片段，制备转移质粒 p26. 5-Venus in Us 1-2。制备在将含有UL3、UL4基因的HSV-2186病毒基因组的BamHI片段(nt 6772至 nt 14950)克隆入pBluescript II KS+中的质粒的UL3和UL4的polyA信号间区域中导 入I^ac I位点的质粒p2UL3-4pac。在p2UL3_4pac的I^acI位点中克隆入p26. 5-Venus的 SacI-KpnI 片段，制备转移质粒 p26. 5-Venus in 2UL3-4。将含有 UL50、UL51 基因的 HSV-2 186 株的基因组 DNA Not I-ClaI 片段(η. η. 106473 至 η· η. 110443)克隆入 pBluescript II KS+(Stratagene)的 NotI-ClaI 位点(pBS_2NC)中。在 pBS_2NC 的 UL50 和 UL51 基因 的PolyA信号区域的NdeI位点中，克隆入p26. 5-Venus的Mcl-Kpnl片段，制备转移质粒 p26.5-Venus in2UL50_51o(2)重组病毒的构建将p26. 5-Venus in UL3_4、p26. 5-Venus in UL50-51 或者 p26. 5-Venusin UL1-2 和HSV-I (F)株的病毒DNA转染兔皮肤细胞(RSC)。之后，在荧光显微镜下，通过选取发 荧光的噬菌斑选择由同源重组发生的、各基因间区域中插入有Venus表达框的重组病毒 YK336 (UL3-UL4 基因间)、YK338 (UL50-UL51 基因间)、YK339 (Usl_Us2 基因间)(图 2)。此 外，在荧光显微镜下进行噬菌斑的纯化直到100%的噬菌斑都发荧光。通过Southern杂交 法确认1336、YK338, YK339为目的的重组病毒。将p26. 5-Venus in 2UL3-4 或者 5-Venus in 2UL50-51 和 HSV-2186 株的病 毒DNA转染兔皮肤细胞(RSC)。之后，在荧光显微镜下，通过选取发荧光的噬菌斑选择由同 源重组发生的、各基因间区域中插入有Venus表达框的重组病毒1381 (UL3-UL4基因间)、 YK382(UL50-UL51基因间)(图3)。此外，在荧光显微镜下进行噬菌斑的纯化直到100%的 噬菌斑都发荧光。通过Southern杂交法确认1381、1382为目的的重组病毒。(3)重组病毒的性状解析将YK336、YK338、YK339 和野生型 HSV-1 (F)以 MOI 0. 01 或者 MOI 5 感染 Vero 细 胞，通过测定病毒的细胞内外的病毒量，比较增殖能力(图4)。可知1336，YK338, YK339 在培养细胞中具有与野生体同等程度的增殖能力。将YK381、YK382 和野生型 HSV-2 186 以 MOI 0. 01 或者 MOI 3 感染 Vero 细胞，通 过测定病毒的细胞内外的病毒量，比较增殖能力(图5)。可知 (381， (382在培养细胞中 具有与野生体同等程度的增殖能力。对1336、ΥΚ338, ΥΚ339和野生型HSV-I (F)，将各种量的病毒接种于小鼠的脑内，7算出LD50。其结果，各种病毒的LD50的值没有观察到显著差别(表1)。对1381、YK382和野生型HSV-2 (186)，将各种量的病毒接种于小鼠的脑内，算出 LD50。其结果，两种病毒的LD50的值没有观察到显著差别(表2)。[表 1]
权利要求
1.一种重组病毒的制备方法，其特征在于在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基因的POlyA信号间的区域(除了 HSV-I 的UL3-UL4之间)插入外源基因。
2.如权利要求1所述的重组病毒的制备方法，其特征在于外源基因选自杆状病毒质粒、报告基因、编码具有免疫原性的蛋白质的基因和用于基 因治疗的基因。
3.一种实质上保持野生型病毒基因组的全长的重组病毒基因组导入大肠杆菌的制备 方法，其特征在于将在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基因的polyA信号间的区域中(除了 HSV-I的UL3-UL4)插入杆状病毒质粒而得到的重组病毒基因组导入大肠杆菌中。
4.如权利要求1 3中任一项所述的制备方法，其特征在于病毒选自疱疹病毒、腺病毒、痘病毒和乳头多瘤空泡病毒。
5.一种重组单纯疱疹病毒II型，其特征在于实质保持野生型单纯疱疹病毒II型的基因组的全长，在其基因组的UL50-UL51基因间 区域中插入杆状病毒质粒。
6.一种保持有重组单纯疱疹病毒II型基因组的大肠杆菌，其特征在于该重组单纯疱疹病毒II型实质上保持野生型单纯疱疹病毒II型的基因组的全长，在 其基因组的UL50-UL51基因间区域中插入有杆状病毒质粒。
全文摘要
本发明在于提供一种保持目标病毒基因组的性状的重组病毒的制备方法。该重组病毒的制备方法特征在于在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基因的polyA信号间的区域插入外源基因。
文档编号C12N7/02GK102046790SQ20098012031
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月29日 优先权日2008年5月30日
发明者川口宁, 森本智美 申请人:国立大学法人东京大学