指导生物体进化的方法

专利名称：指导生物体进化的方法
技术领域：
本发明涉及一种指导生物体进化的方法，特别是指一种通过更改生物突变率来指 导生物体进化的方法。
背景技术：
在DNA复制期间更改突变率可以增加一个种群内的生物个体内部和个体之间的 遗传多样性。遗传多样性的增加可以用来促进在所述生物体中选择所需的遗传性状。通过 在选择性条件下以更改的突变率来培养生物体，并分离带有所需遗传性状的个体，可以得 到所需的遗传性状。

发明内容
有鉴于此，可以通过将一个或多个增变基因(mutator gene)或蛋白质导入生物 体，来实现生物的进化。在这样的一个实施例中，将至少部分地控制DNA复制的基因或蛋白 质导入生物体，以获得高于野生型突变率的突变率。举例来说，可以以上述方式在生物体中 表达一个或多个增变基因，增加所述生物体DNA的突变率。在这样的一个实施例中，一个或 多个增变基因(单元)可以包含有一个或多个校正的或与野生型等位基因相关的缺失核酸 外切酶的突变DNA聚合酶。在这样的其他实施例中，一个或多个增变基因(单元)可以包含 有一个或多个能够表现出与野生型等位基因相比聚合酶保真度降低的突变DNA聚合酶。在 另一个实施例中，生物体中的一个或多个增变基因单元包含至少一个缺失核酸外切酶的突 变DNA聚合酶，并且包含至少一个与野生型等位基因相比的聚合酶保真度减少的突变DNA 聚合酶。在另一种实施例中，生物体中的一个或多个增变基因(单元)包含至少一个既有 核酸外切酶缺失、又能够表现出与野生型等位基因相比聚合酶保真度减少的突变DNA聚合 酶。上述一个或多个增变基因的导入没有涉及到使用突变拷贝代替一个或多个生物 体内源性DNA聚合酶基因。即使一个或多个增变基因的导入涉及上述一个或多个基因整合 到生物的基因组中，所述导入也不是以替代或影响任何生物内源性基因表达为DNA聚合酶 为目的的。上述指导生物进化方法还包括在施加选择压力的条件下培养突变率增大的生物 以及选择具有一个或多个所需性状的生物。例如，可以改变生物体的突变率以促进选择在 所需环境下能够生长的生物体，所述环境包括诸如具有或缺少某种化学元素、营养物、溶剂 或包括在野生型生物不能生长或存活的环境条件的其他任何环境条件。在另一实施例中， 在导致已进化的生物体对诸如细菌或病毒病原体的其他生物体的侵蚀或感染产生抗性的 条件下，培养具有如上所述突变率增长的生物体。在另一实施例中，按照上述进化方法，在 使用选择压力使已进化的生物体能够更高效地或高产地生产或产生出所需要的包括诸如 特种油、蛋白质、乙醇或其他任何所需化学产品的所需产物的条件下，培养具有如上所述突 变率增长的生物体。
进一步讲，上述指导进化的方法可以包括将具有已更改突变率的生物体的突变率 回复到其野生型突变率。在该实施例中，一旦获得并选择了具有所需性状的生物体，便可通 过去除已进化生物体的一个或多个增变基因来回复其野生型突变率。或者，所述一个或多 个增变基因在特定条件下是可诱导的，并可以通过使生物体满足不会产生增变基因产品转 录或翻译的条件来实现野生突变率的回复。更进一步地讲，当包含在已进化、选择的生物体 中的一个或多个增变基因整合进所述已进化生物体的基因组中，可以通过从所述基因组中 切除或去除所述增变基因，或用功能性(非突变子)等位基因替代所述增变基因，来实现所 述野生型突变率的回复。下面将详述上述指导生物进化的方法中使用的材料和生物体。


图IA为野生型Taiken 396亲本酵母菌和转基因耐克霉唑(CTZ)酵母菌的乙醇相 对产量的示意图；图IB为野生型Taiken 396亲本酵母菌株与转基因耐克霉唑(CTZ)酵母菌的乙醇 耐受性对比图；图2为转基因的烟草细胞在敌草腈(DBN)除草剂生长培养基中培养的示意图；图3为多物种间DNA聚合酶的保守核酸外切酶和聚合酶的模体比对图。
具体实施例方式定义这里使用的术语“进化”是指在遗传信息由个体传给其后代过程中随机变异的发 生。其中，遗传变异可能成为或可能不成为生物体存活或增殖的优势。可以通过增加生物 体遗传信息中随机变异的发生来加速生物体进化。在个体内部以及个体之间具有更多遗传 变异的群体，可以具有适应诸如环境状况、致病生物威胁等变化条件的增强能力。可以具有 增强的能力以适应诸如环境状况的变化条件和来自致病生物的威胁。这里使用的术语“生物(体)”是指一种维持生命过程的物质实体，所述物质实体 具有多种属性，例如典型地，细胞结构、增殖(自体增殖)、生长、调节、新陈代谢、修复能力 以及类似的属性。代表性地，生物体具有基本属性，例如受核苷酸控制的遗传性和增殖性 (其涉及到受相关蛋白控制的代谢)。生物体包括自然型、野生型、人工控制型、基因修饰 型、杂交型或其他突变体或分离体。生物体包括病毒、原核生物、真核生物(例如单细胞生 物，诸如酵母菌等)和多细胞生物(例如植物、动物等)。不难理解，这里使用的术语“生物 体”同样可以意指和包括本文定义的细胞，并且本发明提供的方法可以应用于上述细胞或 细胞群体。这里使用的术语“真核生物”是指带有核膜的具有清晰细胞核结构的生物。真核 生物的实例包括但不仅限于单细胞生物(例如酵母菌等)，植物(例如水稻、小麦、玉米、黄 豆等)，动物(例如小鼠、大鼠、牛、马、猪、猴子等)，昆虫(例如苍蝇、蚕)等类似的生物。这里以其一般含义使用的术语“单细胞生物”是指由一个细胞组成的生物。单细 胞生物包括真核生物。单细胞生物的实例包括但不仅限于酵母、哺乳动物细胞、细胞培养物 等类似生物。7
这里使用术语的“多细胞生物”是指由多个细胞(代表性地，多个不同类型的细 胞)组成的个体生物。多细胞生物包括动物、植物、昆虫等类似生物。这里以其最广泛的含义使用的术语“动物”是指脊椎动物和无脊椎动物。这是使用的术语“植物”是指植物界中的所有生物，包括所有单子叶植物和双子叶 植物。植物的实例包括但不仅限于水稻科的单子叶植物(例如小麦、玉米、水稻、大麦、高粱 等)。优选的植物的实例包括烟草、青椒、茄子、瓜、西红柿、甘薯、卷心菜、韭菜、西兰花、胡 萝卜、黄瓜、柑橘、大白菜、生菜、桃子、马铃薯和苹果。优选的植物并不局限于农作物，还包 括开花植物、树木、菌苔、野草等类似生物。此外，除另有说明，术语“植物”是指所有的植物 体、植物器官、植物组织、植物细胞和种子。植物器官的实例包括根、叶、茎、花等。植物细胞 的实例包括但不局限于愈伤组织、悬浮培养细胞等。这里使用的术语“遗传特性”，也称为遗传型，是指由基因控制的生物特性。这里使用的术语“基因”，是指在细胞里具有预先确定的长度的序列。基因可能会 或可能不会决定遗传特性。这里使用的术语“基因”通常是指基因组中的序列，还可以为染 色体外部序列、线粒体序列、诸如此类。基因通常以给定的顺序排列于染色体上。决定蛋 白质初级结构的基因叫做结构基因。调节结构基因表达的基因叫做调节基因(例如，启动 子)。除另有说明外，这里的基因包括结构基因和调节基因。因此，例如术语“DNA聚合酶基 因”通常是指DNA聚合酶的结构基因，及其转录因子和/或翻译调节序列(例如启动子)。 对于转录和/或翻译的调节序列以及结构基因与本发明所涉及的基因一样重要。这里使用 的术语“基因”是指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”及“核苷酸分子”和/或“蛋白质”、 “多肽”、“寡肽”和“肽”。这里使用的“基因产品”包括由基因表达的“多核苷酸”、“寡核苷 酸”、“核苷酸”及“核苷酸分子”和/或“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”。。这里使用的、同基因相关的术语“复制”是指遗传物质，DNA或RNA，进行自我复制。 其中，亲本核苷酸链(DNA或RNA)被用作形成具有与亲本核苷酸相同的结构和功能的新核 苷酸分子(或者DNA或者RNA)的模板。真核细胞中，形成包含复制酶(DNA聚合酶α)的 复制起始复合物，以在双链DNA分子上的多个复制原点起始复制，而复制反应自复制原点 沿相反的方向进行。所述复制的起始是受细胞周期的调控的。例如，在酵母菌中，自主复制 序列被当作复制起点。复制起始复合物形成于所述复制起点。在一实施例中，所述复制起 始复合物可包括由一个或多个包含复制酶(DNA聚合酶)的蛋白质构件组成的起始复合物。 在复制反应过程中，双链DNA的螺旋状结构可以被部分解链；一小段DNA引物被合成；一条 新DNA链自引物的3’ -OH基开始延长；R崎片段在互补模板链上合成；所述R崎片段被连 接起来；经过校验以比较新生链与模板链，以此类推。因此，所述复制反应可以通过许多反 应步骤来完成。存储生物遗传信息的基因组DNA的复制机制，举例来说，在科恩伯格Α.和贝克 Τ.于 1992 年纽约出版的《DNA 复制》(KornbergA. and Baker Τ. "DNA Replication", New York,Freeman, 1992.) 一书中被详述。特别地，在形成DNA双链中，以DNA的一条链作为模 板，合成互补链的酶，被称为DNA聚合酶(DNA复制酶)。DNA复制需要至少两种DNA聚合 酶。这是因为通常，前导链和滞后链是同时合成的。DNA复制自DNA的特定位置开始，所述 位点被称为复制原点(Ori)。例如，细菌的环状基因组DNA上有至少一个双向的复制原点。 因此，典型地，在一个基因组DNA的复制过程中，需要四个DNA聚合酶同时作用于该基因组8DNA上。在一个实施例中，有利地，可仅在两条链之一对复制错误加以调整，或者，有利地，在 两条链之间存在复制错误或突变率的差异。在这里使用的术语“复制错误”是指在基因(DNA等)复制期间，错误的核苷酸导 入。具有代表性的是，复制错误的频率低至每IO8 IO12对中有一个复制错误。复制错误 频率低的原因是双重的其一，由DNA聚合酶实现的核苷酸的增加，是由在复制期间引入的 核苷酸与模板DNA之间的碱基互补配对决定的；其二，DNA聚合酶的3’到5’的核酸外切酶 活性或校正功能，识别并除去与模板不互补的错配核苷酸。因此，可以实现生物体中的突变 率或DNA复制错误率的调节。举例说明，可通过改变或阻碍DNA聚合物形成正确的核苷酸 碱基对所使用的保真度，和/或通过改变DNA聚合酶的核酸外切酶功能，来实现生物体中的 突变率或DNA复制错误率的调节。这里使用的术语“DNA聚合酶”或“Pol”是指一种从脱氧核糖核苷5，-三磷酸中 脱去焦磷酸，从而使DNA聚合的酶。DNA聚合酶反应需要模板DNA，引物分子，Mg2+等等。连 续地将互补的核苷酸加入引物的3’ -OH末端以延伸出一条分子链。这里使用的术语“校正功能”是指发现并修复细胞DNA中的损坏和/或错误的一种 功能。可以通过在脱嘌呤位点或脱嘧啶位点插入碱基，或者断开一段带有脱嘌呤-无嘧啶 核酸内切酶的链后去除带有5’ 3’核酸外切酶的无嘧啶碱基位点，通过一种脱嘌呤-脱 嘧啶(A-P)内切酶切开一条链，接着所述位点被5’到3’的核酸外切酶除去，来实现这种功 能。在被去除的部分中，用DNA聚合酶来合成、补充DNA，并通过DNA连接酶将合成的DNA与 正常DNA连接在一起。上述反应被称做切除修复。对于由烷化剂、非正常碱基、辐射、紫外 线等等的化学修饰引起损坏的DNA，在上述反应完成修复前(程序外DNA修复)，所述被损 部分由DNA糖苷酶除去。具有核酸外切酶功能的DNA聚合酶实例包括但不仅限于DNA聚合 酶δ，DNA聚合酶ε，DNA聚合酶γ等等。这里使用的“校正缺失突变”或“核酸外切酶缺 失突变”是指一种DNA聚合酶突变，其具有3’到5’核苷酸外切校验活性，比衍生出核酸外 切酶缺失突变的所选亲本聚合酶3’到5’核酸外切酶活性低。这里使用的术语“核酸外切酶功能”是指至少为校正、错配修复、网崎片段形成和 重组中的一种核酸外切酶功能。因此，这里使用的术语“核酸外切酶缺失突变”是指能够损 害在上述至少一种核酸外切酶功能中的活性的突变。这里使用的、与DNA聚合酶有关的术语“保真度”是指相对于模板链的、在合成DNA 链中的互补碱基的受模板指导的核苷酸掺入的精确度。基于在新合成核苷酸链中的错误碱 基掺入率，来测量保真度。错误碱基的掺入能够引起基因点突变、插入或删除。聚合酶保真 度突变可以表现为高保真度或低保真度。术语“低保真度”主要是指低于天然值的正确碱 基渗入率。所述天然值可以是诸如天然的正确碱基掺入率或已知聚合酶的保真度。这里使用的术语“低保真度突变”是指一种具有比衍生出低保真度突变的所选亲 本聚合酶复制保真度低的DNA复制保真度的聚合酶突变。可用过分析亲本和突变聚合酶， 并使用任何一种用来测量互补碱基模板指导掺入精确度的试验方法来比较亲本和突变聚 合酶的活性，来确定已改变的保真度。这里使用的术语“突变”是指核苷酸序列，例如基因的核苷酸序列，或者是指已改 变的核苷酸或基因表达的氨基酸序列的状态。举例说明，这里的术语“突变”是指能够引起 诸如聚合酶核酸外切酶功能变化等表达蛋白质功能变化的基因核苷酸序列中的变化。
这里使用的术语“突变”的宽泛含义是指诸如基因点突变、错义突变、沉默突变、称 码突变、无义突变、核苷酸的插入或删除、功能丧失性突变、功能获得性突变和显性负突变。 上述突变可以划分为A)有限影响生物生长和新陈代谢的中性突变；B)抑制生物生长和新 陈代谢的有害突变；以及C)有益于生物增殖的有益突变。这里使用的与某一生物有关的术语“生长”是指个体生物的定量增殖。生物的生 长可以被认为是在测量值上的定量增殖，例如体型大小(身长)、体重等等。个体的定量增 殖依赖于每个细胞的增殖，依赖于许多细胞的增殖。这里使用的术语“野生型突变”和“自发突变”是可以互换的。自发突变率是指每 次基因被复制或加倍的突变机率。这里使用的术语“突变率”和“频率”同义，同指突变/加 倍/碱基对的绝对数。这里使用的术语“相对率”是指两种生物突变率之比，其中之一通常 为野生型生物体。相对率是指相对于野生型生物体，生物显示出的基因出现突变的可能性。 例如，野生型大肠杆菌(大肠杆菌大约有4. 6X IO6个碱基对)的自发突变率大约为每碱基 对、每次加倍有5X ΙΟ—"1次突变。这里使用的术语“增变基因(mutator gene) ”是指一个具有能够更改生物突变率 的突变的基因。这里使用的术语“突变质粒(又称增变基因质粒mutator plasmid)”是指 具有增变基因的质粒、表达载体或表达框。在基因组复制期间，培育具有增变基因的生物能 够引起突变。增变基因或增变基因质粒包含突变的DNA复制和/或DNA修复基因。DNA复 制和修复基因的单元包括但不仅限于DNA聚合酶I，DNA聚合酶II，DNA聚合酶III，Exo I， Exo II，Exo III，Exo V，ExoVII，Exo IX，Exo X，RecJ，核糖核酸酶 T，核糖核酸酶 H 以及上 述基因的同系物。其他增变基因单元可以包括核酸酶，3’ -5’核酸外切酶，5’ -3’核酸外 切酶，DNA 聚合酶 δ，DNA 聚合酶 ε，Werner 蛋白(WRN)，p53, TREXl，TREX2, MREl 1，RAD9, APE1, VDJPjFENI以及EX01。这里使用的同系物是指功能相关的基因。这里使用的术语“选择突变”是指那些与在给定条件下已进化的遗传特性表型相 关的突变。“与......相关”是指所述突变直接或间接地导致表型的改进或改变。当涉及到宿主细胞或生物的突变或基因改变时，术语“非特异性的”是指宿主细胞 基因组的改变在基因组中随机产生的，可能影响所有核苷酸碱基的变异，并且包含移码突 变。非特异性突变包含单核苷酸碱基对中的突变，也包含多核苷酸碱基对中的的突变，还包 含大段DNA中的变异。例如，所述因已经产生损害聚合酶核酸外切酶功能或保真度的突变 的某一生物包括以超过野生型的突变率、非特异性的随机突变。当涉及到宿主细胞的遗传学变异时，特异性突变是指以确定的基因变异为特征的 突变，如，无限制地，A:T C:G颠换，G:C T:A颠换，A:T G:C及G:C A:T颠换和移 码，G:C T:A颠换(参见米勒等人的《细菌遗传学短期教程》，《大肠杆菌及相关细菌的实 验室手册及指南》，"A Short Course in Bacterial Genetics，a LaboratoryManual and Handbook for E. coli and Related Bacteria，，)当涉及到增变基因时，术语“异源性”是指通过现有的重组方法将所述基因导入细 胞。例如，可以使用质粒将增变基因导入细胞，也可以导入微生物基因组。导入生物体的增 变基因可以是细胞中自然发生的内源DNA复制和修复基因的突变，或者是与宿主微生物无 关的突变。涉及到的将核酸“导入”微生物是指使用标准分子生物技术将核酸插入微生物。 被导入的核酸可与微生物体内自然形成的核酸相同或不同。
这里使用的术语“回复至野生型突变率”是指将增变基因从生物体中移除或失活， 从而回复至野生型突变率的过程。本发明包括从已进化生物体中去除增变基因的所有过 程，并包括但不限于去除(curing)具有增变基因的生物体的内生质粒或者通过切割或其 他方法从宿主基因组中去除增变基因，从而回复正常DNA的复制功能和修复功能。所述去 除(curing)是指产生含有增变基因但不含质粒或其他载体的细胞的方法。本领域技术人 员知道去除生物体任意的内生质粒或其他载体的方法。这里使用的与生物体有关的术语“增殖”是指从亲本产生的下一代新个体。增殖 包括但不仅限于自然增殖、增殖等，利用诸如克隆技术(核移植等)等人工技术进行人工增 殖、增殖等。增殖技术实例包括但不仅限于单细胞培养，嫁接，生根等与植物相关的技术。复 制的生物体代表性地具有从其亲本继承来的遗传性状。有性复制的生物体具有从两性继承 来的遗传性状。具有代表性地是这些遗传性状大致以相同的比例取自两性。无性复制的生 物体具有来自其亲本的遗传性状。这里使用的术语“细胞”取其最广泛的含义。所述细胞可以为自然产生的细胞，或 者人工改良的细胞(例如，融合细胞，转基因细胞等)。细胞可以来源于任何生物(例如， 任何细菌、酵母菌、动物细胞、植物细胞、细胞培养物等单细胞生物)，或者任意多细胞生物 (例如，动物、植物等)。细胞来源实例包括但不仅限于单细胞培养物，胚胎，血液，或者正常 生长的转基因动物的身体组织，细胞混合物，诸如来自正常生长的细胞系的细胞，等等。可以培育这里使用的“细胞”，并可以在选择至少一个所需细胞性状后，区分形成 一个或多个多细胞生物。以所述细胞培养出的多细胞生物总的来说可以具有与所述细胞相 同的所需性状。这里使用的术语“分离/离体(isolated) ”是指在典型的环境中至少减少一个天 然物质，优选地是大致上排除该物质。因此，术语“离体细胞(isolated)”是指一个基本上 不包含在典型环境中自然产生的物质的细胞(例如，其他细胞，蛋白质，核酸等)。与核酸或 多肽有关的术语“分离的”是指一种通过重组DNA技术产生的、基本上不含有细胞物质或培 养基的核酸或多肽，或者是一种通过化学合成的、基本上不含有前体化学物质或其他化学 物质的核酸或多肽。举例说明，优选地，分离的核酸不包含生物体中核酸两端的序列(核酸 5’或3’末端)。这里使用的术语“分化细胞”是指一种具有特定功能和特性的细胞(例如，肌细 胞，神经细胞等)。与干细胞不同，分化细胞没有或基本没有多能型。分化细胞的实例包括 皮肤表皮细胞、胰腺间质细胞、胰腺管细胞、肝细胞、血细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、成骨细 胞、骨骼成肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、色素细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、软 骨细胞。这里使用的术语“分化”或“细胞分化”是指出现在源自一个单细胞的子代细胞群 体的，具有在结构或功能上的不同特征的两种或两种以上细胞类型的现象。因此，“分化”包 括最初不具有特定的、可检测的特征的细胞群(家谱)获得诸如特定蛋白质产品这一特征 的过程。这里使用的术语“组织”是指在多细胞生物体中大体上具有相同功能和/或结构 的细胞集合。代表性地，组织是同源的细胞的集合，也可以是具有相同功能和/或结构的、 非同源的细胞的集合。代表性地，组织构成器官的一部分。
本发明实施例涉及器官或部分器官。同样地，组织或细胞可源自任意器官。这里 使用的术语“器官”是指能够完成某一功能的、位于生物个体某一部分的一种形态独立的结 构。在多细胞生物体(例如，动物、植物)中，器官是由许多组织以某一方式空间勻称地排 列而成，其中每个组织都是有一些细胞组成的。上述器官的实例包括与血管系统有关的器 官。在所述器官的实例中，本发明所述的器官包括但不仅限于皮肤、血管、角膜、肾脏、心脏、 肝脏、脐带、肠、神经、肺、胎盘、胰腺、大脑、四肢、视网膜等。这里使用的术语“产品”是指由目标生物体或其部分产生出的物质。所述产品的 物质实例包括但不仅限于基因的表达产物、代谢物、排泄物、蛋白质、化学元素、抗体、乙醇、 酶等。根据某一实施例，通过调节遗传性状的突变率，目标生物体被允许改变产品的类型和/或数量°这里使用的术语“蛋白质”、“多肽”、“寡肽”和“肽”具有相同的含义，都是指任意长 度的氨基酸。聚合物可以是直链、支链或者环链。氨基酸可以是天然的、非天然的的或者变 异的氨基酸。所述术语包含组合在一起的多肽链，还可以包括自然产生的或人工改良的氨 基酸聚合物。所述改良包括，诸如二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或其他处理、 改良(例如，与示踪部分体的共轭)。这种定义包括至少包含一个氨基酸类似物(例如，非 自然产生的氨基酸等)的多肽，类肽化合物(例如，类肽)，以及其他一些本领域已知的变 体。在本发明的某一实施例中，基因产品可以为多肽形式并可用作制药成分。这里使用的术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”以及“核酸”具有相同的含义，都是指一 种具有任意长度并包含cDNA、mRNA和基因组DNA的核苷酸聚合物。这里使用的核苷酸及 核苷酸分子包含于术语“基因”的概念。为基因序列编码的核酸分子包括“剪接突变体(变 体)”。同样地，由核苷酸编码的特定蛋白质包括由所述核苷酸的剪接变体编码的任意蛋白 质。作为建议的名称，“剪接突变体”为基因选择性剪接的产物。在完成转录后，剪接最初的 核酸转录，以使不同的(可选择的)核酸剪接产物编码不同的多肽。用于剪接变体产物的 机制是可变化的。然而，该机制包括外显子的选择性剪接。上述定义同样包含由通读转录 产生的取自同一核酸的、可供选择的多肽。上述定义包含具有接合产品重组形式的接合反 应的所有产物。因此，这里的基因包含剪接突变体。除非另有说明，特定的核酸其中还暗含保守修饰的变体(例如，简并密码子替代 物)及互补序列，所述序列明确地被描述。具体为，可通过生成使用混合碱基和/或脱氧肌 苷筛留物残基(1991年的Batzer等人的《关于核酸的研究》第19卷，5081页；1985年的 Ohtsuka等人的《生物化学期刊》第260卷26054608页；1994年的Rossolini等人的《分 子细胞探索》第8卷91-98页)代替一个或多个(或所有)已选的密码子的第三位置序列， 产生出简并密码子。这里使用的术语基因的“同源性”(例如，核酸序列，氨基酸序列等)是指两个或多 个基因序列的一致性比例。这里使用的序列的一致性(核酸序列，氨基酸序列)是指在两 个或多个可比较序列之间的相同序列的比例。因此，如果两个给定基因间的同源性越大，则 它们的序列之间的相同或相似度就越大。可以通过直接比较基因序列或通过使用严谨条件 下的杂交方法来确定两个基因是否同源。在直接比较两个基因序列时，较为代表性地是，如 果所述基因的DNA序列彼此间至少有50%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99% 相同，那么这两个基因即为同源。这里使用的基因(例如，核酸序列，氨基酸序列等)“相似12度”是指当保守替换在上述同源中被认为是确定(相同)时，两个或多个序列之间的同一性 比例。因此，同源性和相似度在保守替换中彼此之间是有区别的。如果不存在保守替换，则 同源性和相似度具有相同值。这里使用的术语“引物”是指在大分子合成酶促反应中起始大分子物质合成反应 所需的一种物质。在合成核酸分子的反应中，可以使用作为互补部分用来合成的大分子合 成物的核酸分子(例如，DNA, RNA等)。通常被当做引物使用的核酸分子包括作为目的基因核酸序列互补的、具有至少8 个连续核苷酸的长度的核酸序列。优选地是所述核酸序列至少具有9个连续核苷酸的长 度，较为优选地是所述核酸序列至少具有10个连续核苷酸的长度，更为优选地是所述核酸 序列至少具有11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40和50个连续核苷酸的长度。用 作引物的核酸序列包括与上述序列至少有70%同源性的核酸序列，较为优选地是至少具有 80%同源性的核酸序列，更为优选地是至少具有90%同源性的核酸序列，最佳地是至少具 有95%同源性的核酸序列。适用于引物的序列依赖序列自身的属性进行变化，从而被合成 (扩增)。使用本领域现有技术可以依据目标序列设计出合适的引物。所述引物的设计是 本领域的公知技术，可手动或利用电脑程序来完成。这里使用的术语“变体”是指一种部分不同于初始物质的、诸如多肽或多核苷 酸的物质。所述变体的实例包括替换变体、增补变体、缺失变体、截短变体(truncated variant)、等位变体等等。所述变体的实例包括但不仅限于具有一个或多个替换、增补和/ 或缺失变体的核苷酸或多肽，或者至少具有一个与参考核酸分子或多肽有关的替换、增补 和/或缺失变体的核苷酸或多肽。变体可能具有参照分子(例如，野生型分子等)的生物 活性。根据不同的目的，变体可以被赋予额外的生物活性，或者失去部分生物活性。通过使 用本领域公知技术完成上述设计。可选择的是，可以通过从生物体中分离产生变体来获得 已知属性的变体，并且可以通过扩增所述变体的核酸序列来获得序列信息。因此，对于宿主 细胞来说，来自于不同种类或不同种类产物的相应基因可以被当做是变体。这里使用的术语“核酸分子”包括删除或使用其他碱基替代部分自然产生的核酸 序列，或者插入额外的核酸序列，只要由所述额外核酸表达的多肽具有大体上与上述自然 产生的多肽相同的活性。可选择地是，可以将所述额外的核酸连接到所述核酸的5’末端或 3’末端。所述核酸分子包括杂交生成某一在严谨条件下为多肽编码的基因，并且为具有大 致相同功能的多肽编码。可以使用公知的PCR方法，即化学的合成方法来获得核酸。可以 将这种方法同诸如定点突变和杂交法等相结合。这里对于多肽或多核苷酸使用的术语“替换”、“增补”或“缺失”是指分别与原始 多肽或多核苷酸有关的氨基酸或其替代物，或者核酸及其替代物的替换、增补或删除。可以 通过使用诸如定点突变等本领域公知技术来完成上述功能。多肽或多核苷酸可以具有任意 次数(大于零)的替换、增补或删除。所述替换、增补或删除的次数可以与用来维持所需的 功能(例如，激素和细胞激素的信息传递功能等)的变体的替换、增补或删除的次数一样 多。举例来说，这样的数目可以为一个或几个，优选地是在标准长度的20%或10%以内，或 者至多为100%，或者至多为50%，或者至多为25%。这里使用的术语“载体”或者“重组载体”或者“表达载体”或者“增变基因载体” 是指具有将目标多核苷酸序列传输至目的细胞能力的载体。所述载体能够自我复制或者整合入宿主细胞(例如，酵母菌、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、单体动物、单体植物等)的染 色体内，并在一个适于多核苷酸转录的位点上包含一个启动子。适用于克隆的载体被称为 “克隆载体”。所述克隆载体通常包含一个具有很多限制性位点的多克隆位点。限制位点和 克隆位点是本领域公知常识，可以根据不同目的恰当地或选择地使用。所述载体包括诸如 质粒、病毒载体。对本领域技术人员来说，生物体(例如植物)的表达载体类型和调控元件 类型是可以依据宿主细胞进行变化。载体可以包括通过定点重组或随机插入将核苷酸序列导入宿主基因组中的整合 型载体(integration-type vectors) 0所述整合型载体可以使用同源重组将增变基因插 入到基因组的目标位点，例如DNA聚合酶基因。整合型载体包括全部增变基因，增变基因片 段，以及带有用以实现同源重组的邻近核苷酸(flanking nucleotides)的增变基因。其他可诱导的载体包括能够调节宿主生物体的转基因表达的诱导系统。诱导载体 包括半乳糖诱导GALl :URA3表达系统，Cre/loxP系统或四环素诱导表达系统。这里使用的术语“质粒”是指除染色体之外的遗传因子，并可以自主复制。在特别 指出时，包含在线粒体和叶绿体的细胞核物质中的DNA通常被视为细胞器DNA，并且不同于 质粒，S卩不包含于所述术语“质粒”的定义范围内。质粒载体是由允许宿主中质粒的半独 立复制(semi-ind印endent replication)的复制起点组成。质粒拷贝数的变化取决于质 粒包含的复制起点，所述复制起点决定了质粒处于宽松型还是严谨型的控制。一些质粒是 高拷贝质粒，且具有在宿主细胞中能够使所述质粒达到很高拷贝数的突变。其他质粒为低 拷贝质粒，而且在每个细胞中其常常被维持在非常低的拷贝数。这里使用的术语“启动子”是指用来确定基因转录起始点的碱基序列，是指一种用 来直接调节转录率的DNA区。通过将RNA聚合酶结合到启动子来启动转录。因此，具有启 动子功能的一部分基因被称为“启动区(promoter portion)”。启动区通常位于推测蛋白 质码区的第一外显子上游大约21Λρ内。因此，可以通过使用DNA分析软件预测基因组序列 中的蛋白质编码区来估计启动区。推定的启动区通常位于结构基因的上游，但是这取决于 结构基因，即推定的启动区可能位于结构基因的下游。通过放置基因，在一定条件下可以 调节在该基因特殊启动表达控制之下的基因。通过基因的特定启动子表达的控制，所述基 因可以受到某些条件的调控。这里使用的分子生物技术，生化技术，微生物技术以及细胞生物技术经常使用的、 本领域的公知技术。例如，1989年出版的Sambrook. J等人的《分子克隆技术冷泉港实验室 手册》，及 2001 年第三版；Greene Publishing Associates & Wiley Interscience 于 1987 年出版的Ausubel. F. M的《分子生物学试验方法汇编》；Greene PublishingAssociates & Wiley hterscience于1989年出版的Ausubel. F. M.的《精编分子生物学实验方法指南分 子生物学实验方法大纲》;Academicl^ress于1990年出版的hnis. Μ. A的《聚合酶链式反应 方法及应用指南》；Greene Publishing Associates分别于1992、1995年出版的Ausubel. F. M的《精编分子生物实验方法指南分子生物学实验方法大纲》；Academic Press于1995 年出版的hnis.M.A的《聚合酶链式反应探究》；Wily于1999年年刊修订的Ausubel. F. M的《精编分子生物学实验方法指南分子生物学实验方法大纲》；AcademicPress于 1999年出版的Sninsky. J. J等人的《聚合酶链式反应应用功能基因组实验方法指南》； Jikken Igaktu 的特刊，hdenshi Donyu& Hatsugen Kaiseki Jikkenho 的《实验医学》，Yodo-sha(1997)的《基因导入及表达分析的实验方法》。通过引用将上述所有出版物结合 入本文。用于制备人工合成基因的DNA合成技术和核酸化学已被如下出版物详细描述。 例如IRL Press分别于1985、1990年出版的Gait M. J的《寡核苷酸合成实用方法》；IRL Press于1991年出版的Eckstein F的《寡核苷酸及类似物实用方法》;Chapman & Hall于 1992年出版的Adams R. L等人的《核酸生物化学》；Weinheim于1994年出版的Shabarova Z等人的《核酸高等有机化学》;OxfordUniversity Press于1996年出版的Blackburn G. M 等人的《化学及生物领域中的核酸》；Academic Press于1996年出版的Hermanson G. T的 《生物共轭技术》。通过引用将上述所有出版物结合入本文。指导进化的方法根据本发明的说明书所述的指导生物进化的方法包括修改生物体突变率。这里所 指的修改生物体突变率特别包括以能够引起一个或多个增变基因表达并且使DNA突变率 相对于其亲本增加的方式向生物体内导入一个或多个增变基因。在一个实施例中，一个或 多个增变基因包括其表达的能够改变生物体DNA聚合酶功能的突变DNA聚合酶。在同样的 实施例中，所述突变DNA聚合酶是一种低保真度突变体。在别的实施例中，所述突变DNA聚 合酶是一种核酸外切酶缺失突变体。在其他实施例中，所述一个或多个增变基因至少包括 一个为低保真度突变体的突变DNA聚合酶，并且至少包括一个为核酸外切酶缺失突变体的 突变DNA聚合酶。在更多的实施例中，将一个或多个增变基因导入生物体，包括至少导入一 个既是低保真度突变体的突变又是核酸外切酶缺失突变体的突变的DNA聚合酶。各种不同的DNA聚合酶在本领域中是公知的。基于各种DNA聚合酶在催化亚基的 初始结构上的差别，将DNA聚合酶归类为多个不同的族。A族以对Pol I编码的大肠杆菌 polA基因命名。A族成员还包括噬菌体T7复制聚合酶以及真核线粒体聚合酶Y，同样还有 人聚合酶Pol θ和Pol ν。B族聚合酶包括大肠杆菌Pol II,pol B基因产物以及真核聚合 酶α、δ、ε和ζ。C族聚合酶包括催化亚基由polC基因编码的大肠杆菌复制聚合酶Pol III。大肠杆菌至少具有三个DNA聚合酶，即DNA聚合酶1、11、和III。DNA聚合酶I参 与DNA修复、重组和冈崎片段的形成。DNA聚合酶II参与DNA修复。DNA聚合酶III参与 染色体DNA的复制和修复。这些聚合酶各自具有包含数种蛋白的亚基结构，并且根据该亚 基结构被分成核心酶和全酶。核心聚合酶由α、ε和θ亚基组成。全酶除了 α、ε和θ 亚基之外，还包括τ、Υ、δ和β组分。真核细胞具有大量DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶α、β、δ、Υ和ε的。 动物体内的已知聚合酶包括参与核DNA复制并在细胞生长阶段的DNA复制中起作用的DNA 聚合酶α。DNA聚合酶β参与细胞核DNA修复以及在所述生长阶段和休眠阶段的DNA损 坏修复。DNA聚合酶γ参与线粒体DNA复制和修复，并具有核酸外切酶活性。DNA聚合酶 δ参与核DNA的复制并在后随链的DNA伸长中起作用，其同样具有核酸外切酶活性。DNA 聚合酶ε参与核DNA的复制并在前导链的DNA延伸中起作用，其具有核酸外切酶活性。在革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真核生物体中的DNA聚合酶核酸外切酶功 能多半包括具有在对所述核酸外切酶功能有影响的3’到5’核酸外切酶活性中心起作用的 Exo I模体的氨基酸序列。在诸如大肠杆菌等革兰氏阴性细菌中存在两个DNA聚合酶蛋白质，即具有核酸外切酶功能的分子和具有DNA合成活性的分子。然而，在同真核生物一样 的革兰氏阳性细菌中，一个DNA聚合酶同时具有DNA合成活性和核酸外切酶活性。DNA聚合酶还包括聚合酶活性部分的保真度功能，所述保真度功能具有在DNA复 制期间正确选择核苷酸的聚合酶的能力。DNA聚合酶活性点包括诸如Pol δ催化亚基区域。可在原核和真核生物体内找到DNA聚合酶变体。许多复制性DNA聚合酶具有校正 或核酸外切酶功能，即通过3’到5’核酸外切酶活性删除错误从而完成无错复制。易产生 错误的DNA聚合酶变体具有在复制期间会引起核苷酸序列突变的、损坏的或不正常的核酸 外切酶功能。可供选择地，易产生错误的DNA聚合酶变体可以为同样能够在复制期间引起 核苷酸序列突变的、表现出比野生型复制保真度要低的低保真度突变。通过修饰核酸外切 酶功能和/或保真度其中的一项或全部而成为易产生错误的、用来制造互补核酸碱基对的 所有DNA聚合酶，可以被用来做所述指导进化方法的增变基因。对于生物体来说，根据本发 明说明书描述的被导入生物体中的突变DNA聚合酶可以是异源性DNA聚合酶，突变异源性 DNA聚合酶或突变内源性DNA聚合酶。此外，可以通过本领域公知的生物技术，来实现用于 得到所述突变DNA聚合酶的必要的修饰。可通过诸如在为DNA聚合酶编码的基因中导入能够通过诸如更改DNA聚合酶 Pol δ、Pol ε和/或Pol y的Exo I、Exo II和/或Exo III的模体或其他核酸外切酶 功能活性点来修饰所述聚合酶3’到5’核酸外切酶活性的一个或多个突变体，来构建核 酸外切酶缺失突变DNA聚合体。结合实验实例，详细介绍能够引起缺失核酸外切酶的突 变DNA聚合酶的典型突变。通过引用2002年5月出版的《分子细胞生物学自然综述》中 Shevelev. IV 和 H. Hubscher 的《3，5，核酸外切酶》即"The 3，5，exonuclease” 第 5 期 第3卷364-376页来介绍其他能够引起缺失核酸外切酶的突变DNA聚合酶的突变。此外， 如图3所示，将由箭头所指的DNA聚合酶的核酸外切酶区域Exo I, Exo II和Exo III在 如下多个物种间为保守的，例如酿酒酵母菌(Sc，Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母 菌(Ps，Pichiastipitis)、粟酒裂殖酵母菌(Sp，Schizosaccharomyces pombe)、多孔木霉 (Tc,Tolypocladium inflatum)、烟草(Nt,Nicotianatobacum)、阿拉伯芥(At,Arabidopsis thaliana)、中国仓鼠(Cg, Cricetulus griseus)、老鼠(Mm, Mus muscutus)、智人(Hs, Homosapiens)以及大肠杆菌(Ec, Escherichia coli)。结合实验实例，详细介绍能够引起低保真度DNA聚合酶的典型突变。在一实施 例中，使用DNA聚合酶引起的导致底物识别能力减低的突变被认为是聚合酶低保真度突 变。更为具体地，在基质识别点和/或活性点上的一个或多个突变是聚合酶低保真度突 变的实例。通过引用诸如1994年2月25日出版的《生物化学期刊》中的Reha-Krantz 和Nonay的《噬菌体T4 DNA聚合酶的模体A 起引物延伸和DNA复制保真度的作用》即 "Motif A of Bacteriophage T4DNA polymerase :Role in Primer Extension and DNA ReplicationFidelity"第8期第269卷5635-5643页；2005年6月出版的《遗传学杂志》 中Li等人的《对膦酰乙酸的敏感性一种用于在酿酒酵母中探究DNA聚合酶δ的新表型》 艮口“Sensitivity to PhosphonoaceticAcid :A New Phenotype to Probe DNA Polymerase delta inSaccharomyces cerevisiae"第 170 卷 569-580 页；2006 年 2 月 17 日出版的 《生物化学期刊》中Venkatesan等人的《由真核DNA聚合酶δ的保守模体A残基的替换 弓I 起白勺突变表型〉〉艮口 "Mutator phenotypescaused by substitution at a conserved16motif A residue in eukaryoticDNA polymerase delta" H 7 IJ H 281 ^ 4486-4494 页；2007年4月22日出版的《N. A. R》中Pursell等人的《依据保守活性点残基B族的 DNA聚合酶保真度的调节酵母菌DNA聚合酶ε的M644W，M644L以及M644F突变体的 特性》艮口 "Regulation of B family DNApolymerase fidelity by a conserved active site residue :characterizationOf M644W, M644L and M644F mutants of yeast DNA polymerase印silon”第9期第35卷3076-3086页；2007年1月沈日出版的《生物化学期 刊》中McElhirmy等人的《在利用酿酒酵母DNA聚合酶δ进行低精度DNA合成期间的无 效校IE禾口偏置误差率〉〉艮口 “ InefficientProofreading and Biased Error Rates during Inaccurate DNA Synthesisby a Mutant Derivative of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerasedelta”第4期第282卷23M-2332页，来介绍DNA聚合酶的底物识别位点。在一实施例中，增变基因包含会降低酵母菌中DNA聚合酶Exo I模体的核酸外切 酶功能或者通过降低3’到5’核酸外切酶活性降低CHO细胞中DNA聚合酶Exo II模体的突 变。在另一实施例中，增变基因包含会损害DNA聚合酶模体A或模体B的碱基对匹配保真 度的突变。在又一实施例中，增变基因包含一个或多个可使用大肠杆菌中DNA聚合酶B基 因(Pol II)的功能的突变。在其他实施例中，增变基因包含一个或多个可以改变枯草芽孢 杆菌中DNA聚合酶III基因功能的突变。由这些实例可见，在属于不同家族的聚合酶间，氨 基酸残基对于3’到5’核酸外切活性和聚合酶保真度的保守性来说是必不可少的。因此， 本发明范围并不仅限于特殊聚合酶族。在一实施例中，在本发明方法中将突变DNA聚合酶用作增变基因以在目标生物体 内构建特殊的突变率。例如，用在所述指导进化方法中的增变基因可以是既为低保真度突 变体又为能够在每一代或每一次细胞分裂中产生多次突变的核酸外切酶缺失突变体的DNA 聚合酶。在该实施例中，所述增变基因至少会造成2，3，4，5，6，7，8，9，或10次碱基错配，或 者在每次DNA复制中至少会造成20，25，50，和100次碱基错配。可选择地是，用在所述指 导进化方法中的增变基因可以是一种既为低保真度突变体又是能够导致生物体内的突变 率相对于亲株突变率从大约2倍 最高100，000倍增加的核酸外切酶突变体的DNA聚合 酶。在该实施例中，所述增变基因能够将突变率增加至亲株突变率的大约2倍 大约1，000 倍。在另一实施例中，突变质粒能够将突变率增加至亲株突变率的大约10，20，30，40，50， 60，70，80，100，120，140，160，170，190，200，250，300，350 和 400 倍。在一实施例中，可以使用以诸如抗药性作为指标的体内正向突变实验来计算突变 率。进行本实验时，当相关基因功能缺失或突变时，便会出现突变体，即抗药性。在另一实 施例中，可以使用体内逆向实验来计算所述突变率。进行所述逆向实验时，当相关基因具有 由核苷酸序列中的突变产生的回复功能时，便会出现突变体。所述正向突变实验同所述逆 向实验相比，具有较高的敏感度。在实现本发明方法的过程中，可以通过使用公知技术来完成一个或多个增变基因 的导入。可以使用任何适用于生物体外源基因导入和表达的技术来瞬时或稳定地完成所述 一个或多个增变基因向目标生物体内的导入，例如公知的转化、转导和转染的方法。对于本 领域技术人员来说，上述核酸分子的导入技术是容易获得的，例如，Wiley于1988年在纽约 出版的Ausubel. F. A.等人的《分子生物学实验指南》即“Current Protocols in Molecular Biology" ；Cold SpringHarbor Laboratory Press 分别于 1987 和 2001 年在纽约冷泉港17出版的Mlllbrook. J等人的《分子克隆技术实验室手册》第二版和第三版即“Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. ， and its 3rdEd" ；Yodo-sha ψ 1997 $出片反的牛寺 刊《Jikken Igaku))(实验医学)中的《基因导入及表达分析的医学方法》即“Experimental Method forGene introduction & Expression Analysis，，。此夕卜,可以通过诸如 Northern blotting.ffestern blotting以及其他公知技术确定所述一个或多个增变基因的导入。同 样，上述引用文献中所记载的内容可以作为用来分化细胞从而产生转基因植物的技术，并 且可以作为用来从所述转基因植物处获得种子的方法。在一个实施例中，可以用增变基因瞬时表达系统的宿主生物体来表达增变基因。 使用这一系统，可以从突变体载体中表达出所述增变基因，而不合并入所述生物体基因组 中。作为增变基因瞬时表达系统的一部分，增变基因或增变基因片段包含有启动子序列。可 以使用不同的启动子，包括野生型启动子、组成型表达基因、诱导性启动子或其他本领域内 公知的启动子。在一特定实施例中，启动子是受半乳糖的存在或缺失的控制的GALl诱导启 动子。启动子的选择会影响到来自所述表达载体的增变基因的表达水平。在一特定实施 例中，将弱启动子或强启动子与一个适中的增变基因相结合，以形成弱启动或强启动突变 基因。在另一实施例中，一个弱启动子可以与一个强增变基因或另一个弱增变基因相结合。所述突变体载体还包含一个与增变基因一起的筛选标志，以便选择那些与所述突 变体载体一起已经成功转化的生物体。在一实施例中，所述筛选标志可以是诸如氨苄青霉 素抗性基因或遗传霉素(Geneticin)抗性基因等抗生素抗性基因。在另一实施例中，所述 筛选标志可以是诸如URA3或LEU2等营养缺陷型标志基因。在另一实施例中，突变体载体包含复制起点，其增加了宿主生物体的突变体载体 的稳定性。所述复制起点源自所述宿主生物体，密切相关的物种或其他合适的来源。在某一 具体实例中，将酵母菌细胞和带有复制序列ARSl低拷贝或者2微米复制起点Qum ori)的 高拷贝起点的突变体载体一起转化。在另一实施例中，所述突变体载体包含复制序列ColEl 中等拷贝或者PUC高拷贝起始点。所述突变体载体还可以包含着丝粒序列，以便在细胞分 裂期间帮助保持宿主生物体内所述载体的数量。所述突变体载体的筛选及其特性，例如所需的启动子、复制起点、筛选标志等等， 取决于宿主细胞转化方法，宿主细胞的倍性、宿主细胞的基因组大小和/或宿主细胞使用 的DNA复制及修复机制。这样，可以构建所述突变体载体以便最佳地支持宿主生物体内所 需的突变率。在一个指导生物体表达出所需性状的进化的实施例中，不以特定的选择性条件培 育产生突变的生物体。在没有特定的选择性条件下，具有增变基因的所述生物体因加速的 突变率而积累遗传变异，而加速的突变率导致生物体获得希望的性状。然后，为获得所需性 状筛选已突变的生物体，并选择表现出所需性状的生物体。在这一实施例中，在没有选择性 的条件下培育已转化的带有增变基因的生物体，然后选择使所述生物体能更高效地生长或 能较好地产出所需产物或新产物的性状。筛选和挑选具有所需性状的突变生物体，可以通过多种公知技术完成。在某一实 施例中，可以在选择性条件下进行筛选和分离带有一个或多个增变基因的目标生物体。选 择性条件可选自诸如某些化学成分存在的情况下、特定生物学环境下或者以上条件之结合。筛选生物的选择性条件可以为单独使用或者与其他筛选方法的结合使用。在某一实施例中，理想的物理生长条件包括特定的pH值或者所需的pH值范围。在 另一实施例中，所需物理生长条件包括特定的温度或温度范围、所需的大气压或其他生物 体在生长期间所需经受的物理条件及其结合。在某一实施例中，可以在使用或不使用化学物质的条件下完成生物体的筛选和挑 选。在某一实施例中，选择性化学条件可以是一种或多种营养素，或其他选择性生长培养基 和/或有/没有激素、生长因子、有机溶剂、抗生素、卤化物、芳香族化合物、除草剂、类似物 或其他适当的化学条件。在另一实施例中，可以通过使所述生物体接受诸如生物高种群密度等选择性生物 条件或者使所述生物体接受其他生物种类或类型的存在，筛选带有所需生物性状的已突变 生物体。可以根据生物体耐受高种群密度的特性或者能产生诸如药物化合物等所需产物的 特性，来挑选生物体。在选择性生物条件下生物体之所以能够存活，是因为它们有能力通过 竞争，顺利地获得有限的资源，或者是因为它们可以同周围生物体协同或合作生长。挑选或 分离出那些表现出所需性状的已突变生物体，以供进一步地研究和/或使用。在某一实施例中，一个或多个增变基因的导入同样可以伴随着目标生物体基因组 的额外突变或基因转变。例如，带有增变基因地转换目标生物体，或者在所述目标生物体基 因组的所需位置上进行基因转变。所述基因转变包括敲除突变、点突变、错义突变、沉默突 变、称码突变、无义突变、核苷酸的插入或删除、失去功能的突变、获得功能的突变以及显性 失活突变。为了得到包括高效生长、产出所需产物或化合物等所需性状，筛选所述转基因生 物体。可以采用对于本领域技术人员来说为现有的标准技术、材料和工具来构造用于 将一个或多个增变基因导入目标生物体的载体。可以使用任何适用于已构造载体导入 的方法将所述一个或多个增变基因导入生物体。例如，磷酸钙法(Calcium phosphate method)，DEAE-葡聚糖法(DEAE-dextran)，电穿孑L法(Electroporation method)，基因枪 法(Particle gun)，氯化钙法(Calcium chloride method)，电穿孔法(1990年的酶学方法 (《Methods Enzymol)))第 IM 卷 I82 页，)，脂质转染法(Lipofection method)，原生质球 法(Spheroplastmethod) (1978年《美国国家科学院论文集》第84卷，1拟9页)或乙酸锂法 (Lithium acetate method) (1983年的《细菌学期刊》第153卷，163页)。此外，通过使用本技术领域公知方法，例如使用农杆菌的方法、直接导入法等，可 以将植物表达载体导入植物细胞中。例如，在1990年的Nagel等人的《微生物学快报》 ("Microbiol. Lett. ”)第67卷，325页中记载的使用农杆菌方法的实例。在所述方法中， 通过使用电穿孔将适合于植物的表达载体插入农杆菌，再通过使用如(Kluwer Academic Press Publishers于1994年出版的)Gelvin等人的《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology Manual)中描述的方法将已转化的农杆菌导入植物细胞中。在某一实 施例中，将增变基因与包含花椰菜花叶病毒(CaMV35Q启动子的pBL121载体一起导入植物 中。将植物表达载体直接导入植物细胞的方法实例包括电穿孔法(Shimamoto等人在1989 年的《自然》第338卷274-276页的文章；以及Miodes等人在1989年的《科学》第240卷 204-207页的文章)，基因枪法(Chirstou等人在1991年的《生物技术》(Bio/Technologys) 第9卷957-962页的文章)，以及聚乙二醇法(PEG) (Datta等人在1990年的《生物技术》19(Bio/Technologys)第8卷763-740页的文章)。上述方法都是本技术领域的公知技术，可 以在其中恰当地选择适合于植物转化的方法。根据本技术领域内的公知技术以及所需宿主和复制或整合的方法，选择合适的载 体。例如，在酵母菌株中使用自复制载体。在另一实施例中，在带有未知复制起点的生物体 中使用整合型载体。在该实施例中，整合型载体被用来做定点同源重组。在其他类似实施 例中，整合型载体被用来做非特异性随机整合。在其他实施例中，含有IoxP序列的载体被 用来促使宿主生物体中重组DNA序列的删除。在另一实施例中，通过选择一种或多种载体的组合来减慢生物体的突变率。在该 实施例中，一个或多个载体和启动子的选择取决于宿主细胞生物体及生长条件。在其他类 似的实施例中，会使用低拷贝质粒载体。同高拷贝质粒相比，低拷贝质粒具有更稳定的表型 和足够的消除率(curing rate)。因此，只要可能，就应优选使用低拷贝质粒。在另一个实 施例中，基于宿主细胞生物体以及其生长环境，来选择具有不同强度的启动子，用以消弱或 增强的突变表型强度。上述一个或多个增变基因的导入，并不涉及以突变拷贝替换一个或多个生物体的 内源性DNA聚合酶基因。即便所述一个或多个增变基因的导入涉及到一个或多个增变基 因合并入生物体基因组，所述导入也不以替换或影响任何生物体内源性基因表达DNA聚合 酶。然而，本文提供的实验实例表明，通过导入一个或多个上述增变基因可以得到能够促进 目标生物指导进化的显著增加的突变率。本文提供的详细的指导进化的方法不需要改变为 DNA聚合酶编码的生物体内源性基因。因此，本文提供的指导进化的方法不仅能够指导进化 以及对具有一个或多个所需性状的生物体的挑选，还可以促进生物体回复到其野生型突变 率。当不再需要已进化生物体内的已修改的突变率时，可以回复其野生型突变率。可 以通过所述生物体内的一个或多个增变基因的删除、失活或失效中任意一种处理方式来完 成野生型突变率的回复。例如，消除生物体含有增变基因的内生质粒(resident plasmid) 或其他从生物体内删除增变基因等已知处理方式可以用来回复野生型突变率。或者，构造 用于导入一个或多个增变基因的载体，从而使所述一个或多个增变基因的表达可在特定条 件诱导。在这样的实例中，可以通过使生物体置于不会引起增变基因产物转录或翻译的条 件下，实现野生型突变率的回复。本发明方法可以供应用于各种生物，例如真核多细胞、单细胞生物，植物，以及原 核生物。本发明方法适用的真核生物的特殊实例包括但不仅限于小鼠骨髓瘤细胞，大鼠骨 髓瘤细胞，小鼠杂交瘤细胞，CHO(CHO，Chinese Hamster Ovary)细胞，幼仓鼠肾(BHK，Baby Hamster Kidney)细胞，非洲绿猴肾细胞，人类白血病细胞，人类结肠癌细胞，烟草细胞，真 菌，以及其他真核细胞。真核细胞核细胞系的其他实例包括人类胚肾细胞系HEK293，希拉细 胞系，包括B细胞和T细胞的人类淋巴细胞，人类杂交瘤细胞，人类骨髓瘤细胞，诱导多能干 细胞(iPS, Induced Pluripotent Stem)，胚胎干细胞(ES, Embryonic Stem)等等。在可选 实施例中，可以使用昆虫细胞，例如草地夜蛾Sf9(Sp0d0ptera frugiperda)细胞和黑腹果 蝇 S2(D.melanogaster)细胞。下列实例中使用的细胞菌株名称，例如SYD62D-1A，可参考GenBank编号。实例20
实例1 1 (Saccharomyces cerevisiae)po!3(mutatorvectors)白勺 曾 殖酿酒酵母中的P0L3基因编码酵母菌DNA聚合酶δ的催化亚基，所述的催化亚基 具有两个功能域，即3’到5’核酸外切酶域和5’到3’聚合酶域(参考1989年6月的《欧 洲分子生物学期刊》第6期第8卷1849-1邪4页Boulet等人的《编码DNA聚合酶III的大 亚基的酿酒酵母CDCZ基因的结构及功能》即‘、tructure and function ofSaccharomyces cerevisiae CDCZ gene encoding the large subunit ofDNA polymerase III，，)。这 些核酸外切酶活性和聚合酶活性对于染色体复制、修复和重组来说是必不可少的。此外， P0L3的3’到5’核酸外切酶参与错配修复、冈崎片段消除和DNA合成期间的校正(参考 2005年1月的《分子生物学》第1期第25卷461-471页Jin等人的《聚合酶和核酸外切 酶构象之间变化的酿酒酵母DNA聚合酶δ的3’到5’核酸外切酶的多种生物学作用》即 "Multiple BiologicalRoles of 3' to 5' Exonuclease of Saccharomyces cerevisiae DNApolymerase delta Require Switching between the Polymerase andExonuclease Domains，，)。在先前的研究中，通过使用定点突变法在核酸外切酶模体ΕΧ0Ι、EXOII和EXOIII 的设计的活性位点上产生突变，然后将所述突变导入酿酒酵母菌株中。在含D321A氨基 酸取代(在氨基酸321位点上，丙氨酸替代天冬氨酸)或E323A氨基酸取代(在氨基酸 323位点上，丙氨酸替代谷氨基酸)、不含野生型P0L3的所述突变菌株表现出的突变率为 野生型菌株的370倍。另一方面，带有野生型P0L3的核酸外切酶缺失突变体表现出的突 变率仅为野生型菌株的5倍。以上结果直接表明野生型P0L3的显性作用，在DNA复制和 修复期间限制突变(参考1991年的《欧洲分子生物学期刊》第8期第10卷2165-2170 页Simon等人的《精确复制中所需要的位于P0L3中的3’到5’核酸外切酶活性》即‘‘The 3‘ to 5 ‘ exonuclease activity locatedin the P0L3 is required for accurate replication") ； 1993年4月的《欧洲分子生物学期刊》第4期第12卷1467-1473页 Morrison等人的《酿酒酵母中校正DNA复制错误的途径》即"Pattiway correcting DNAreplication errors in Saccharomyces cerevisiae，，；2006 年的〈〈基因组〉〉第 49 卷 403-410页Murphy等人的《在酿酒酵母中挑选突变DNA聚合酶δ的方法》即“A method to select for mutator DNA polymerasedeItas in Saccharomyces cerevisiae，，)。人们普遍认为D321A和E323A突变对核酸外切酶功能的金属元素附着能力的 缺失有帮助。同样值得注意的是，酵母菌中的D321A和E323A突变对应于人类P0lδ中 的D316A和E318A氨基酸替换(参考2002年5月的《分子细胞生物学自然综述》第5期 第3卷，364-376页的Shevelev IV和U. Hubscher的《3，到5，核酸外切酶》即“The3，到 5，exonucleases，，)·在先前研究中记载的其他pol3突变酵母菌株pol3-L612M，在氨基酸612位点上 蛋氨酸替代亮氨酸，并且被认为会影响DNA聚合酶保真度(参考2005年6月的《遗传学》 第170卷569-580页，Li等人的《对膦酰乙酸的敏感性酿酒酵母的DNA聚合酶δ的探针 的新表型》即 “Sensitivity to Phosphonoacetic Acid :A New Phenotype toProbe DNA Polymerase delta in Saccharomyces cerevisiae，，；2006 年 2 月 17 日的〈〈生物化学其月刊》第7期第281卷4486-4494页，Venkatesan等人的《由真核DNA聚合酶δ中的保守模 体A残基替代物弓I起的突变表型》艮口 “Mutator phenotypes caused by substitution at a conservedmotif A residue in eukaryotic DNA polymerase delta，，)。在 Li 等人禾口 Venkatesan等人的试验中，pol3_L612M突变菌株表现出的突变率大约是相关野生型酵母 菌株的1.6到7.0倍。通过使用定向整合法或质粒重排法(plasmid-shuffling)将pol3_L612M整合进 染色体P0L3基因中，构建上述pol3-L612M突变菌株，从而干扰(disrupt)内源性P0L3基 因。为了回复所述突变菌株的野生型突变率，需要通过另外的寡核苷酸介导诱变来回复所 述内源性野生型P0L3。突变质粒的使用允许所述内源性野生型P0L3的持续表达，并可以通 过消除酵母菌株的所述突变质粒，实现野生型突变率的有效回复。使用这种方法，在已获得 所需性状时，停止增加生物体的突变率以防止其他性状突变。A. YCplacl 11突变质粒载体的构建通过使用弓I 物 ScP0L3pro_S 5' -AGTCGAGTCGACTGTTTTCCTTGATGGCACGGT(SEQ ID N0:2)和 ScP0L3ter_AS 5' -AGTCGAGAATTCTGGAGTGCTGGTGTCATATTA (SEQ ID NO :3)的聚合酶链反应方法 (PCR)，从酿酒酵母染色体DNA中克隆包含编码序列(3^1bp)和非编码序列(上游IOOObp 和下游500bp)的野生型基因组的P0L3基因的DNA片段(SEQ ID NO :1)。将被增扩的DNA 片段插入YCplaclll的多克隆位点(Sail和EcoRI)，从而构建出YCplacl 11/P0L3质粒载 体。对于核酸外切酶缺失pol3(pol3-01)质粒载体来说，使用带有能够产生YCplaclll/ po 13-01质粒载体的启动子kpo 13-01 5' GCGTATCATGTCCTTTGCTATCGCGTGTGCTGGTAGGATTG(SEQ ID NO 4)的 QuikChange 试剂盒(Stratagene)，在YCplac33/P0L3质粒中制成D321A替换(在氨基酸321上，丙氨酸 替代天冬氨酸)和E323A替换(在氨基酸323上，丙氨酸替代谷氨基酸)。为了构建YCplaClll/pO13-01+L612X质粒载体，将氨基酸612上的亮氨酸置换 为所需氨基酸，如表1所示，并通过使用QuikChange试剂盒(Stratagene)及下列引物在 YCplacl 11/P0L3 质粒中构建所述 YCplacl 11/pol3-01+L612X 质粒载体Scpol3L612A 5，GCAACTTTGGATTTCAATTCTGCTTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ IDScpol3L612C 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTTGTTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ IDScpol3L612D 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTGATTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ IDScpol3L612E 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTGAGTATCCAAGTATTATGATGGCG(SEQ IDScpol3L612F 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTTTCTATCCAAGTATTATGATGGCG(SEQ IDScpol3L612G 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTGGATATCCAAGTATTATGATGGCG(SEQ IDNO 5)， NO 6)， NO 7)， NO 8)， NO 9)， NO 10)，
Scpol3L612H 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTCATTATCCAAGTATTATGATGGCG(SEQ ID NO: 11)，Scpol3L612I 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTATATATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :12)，Scpol3L612K 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTAAGTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :13)，Scpol3L612M 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTATGTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :14)，Scpol3L612N 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTAATTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :15)，Scpol3L612P 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTCCATATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :16)，Scpol3L612Q 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTCAGTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :17)，Scpol3L612R 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTCGTTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :18)，Scpol3L612S 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTTCTTATCCAAGTATTATGATGGCG(SEQ ID NO :19)，Scpol3L612T 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTACTTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :20)，Scpol3L612V 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTGTTTATCCAAGTATTATGATGGCG(SEQ ID NO :21)，Scpol3L612ff 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTTGGTATCCAAGTATTATGATGGCG (SEQ ID NO :22)，Scpol3L612Y 5' GCAACTTTGGATTTCAATTCTTACTATCCAAGTATTATGATGGCG(SEQ ID NO :23)。B. YCplac33突变质粒载体的构建用两种限制酶Sail 和 EcoRI 将每个 YCplaclll/pol3_01 或 YCplaclll/ pol3-01+L612M质粒消化。提取染色体pol3增变基因的DNA片段，然后将其插入 YCplac33 质粒的多克隆位点(Sail 和 EcoRI)，从而构成 YCplac33/pol3_01 和 YCplac33/ pol3-01+L612M的质粒载体。C.YEplacl95突变质粒载体的构建用两种限制酶SalI 和 EcoRI 将每个 YCplaclll/pol3_01 或 YCplaclll/ pol3-01+L612M质粒消化。提取染色体pol3增变基因的DNA片段，然后将其插入YEplacl95 质粒的多克隆位点(Sail和EcoRI)，从而构成YEplacl95/pol3_01和YCplacl95/ pol3-01+L612M的质粒载体。D.YIplac33突变体载体的构建用两种限制酶SpeI和NheI消化YCplac33载体，然后用T4 DNA聚合酶处理所述 DNA片段，从而在所述DNA片段上生成平末端(blunting-ends)。将平末端DNA片段与T4DNA连接酶连接，从而构建Yiplac33载体。用两种限制酶Mil和EcoRI消化YCplaclll/ pol3-01或YCplaclll/pol3-01+L612M质体。提取染色体pol3增变基因的DNA片段，然后 将其插入YIplac33质粒的多克隆位点(Mil和EcoRI)，从而构建成YIplac33/pol3-01和 YIplac33/pol3-01+L612M 载体。E. YCplac33/Gallp半乳糖诱导突变质粒载体的构建通过使用引物GALlUl 5，ATACTGCAAGCTTACGGATTAGAAGCCGCCGAG(SEQ ID NO :24)和 GALIDI 5' CCCTATCTGCAGGGGGTTTTTTCTCCTTGACG (SEQ ID NO :2 的 PCR 反应，从酿酒酵 母染色体DNA中克隆GALl启动子区G50bp)。用两种限制酶HindIII和I^stI将被增扩 的DNA片段消化，然后将其插入YCplac33质粒的多克隆位点(HindIII和I^stI)，从而构成 YCplac33/feillp质粒载体。通过使用以SCPDAESAL15，ATACGCGTCGACATGAGTGAAAAAAGATCCCTTC(SEQ ID NO :26)和 SCPDAISAC1 5' GCCACCGAGCTCGAAGGAACAGATCTTACAAGC(SEQ ID NO :27)为引物的 PCR 反应从 YCplaclll/pol3-01+L612M质粒中增扩Pol3-01+L612M编码序列的DNA片段。用两种限制 酶MlI和McI将所述被增扩的DNA片段消化，然后将其插入YCplaC33/(}allp质粒的多克 隆位点(Mil 和 &icl)，从而构成 YCplac33/Gallp/pol3-01+L612M 质粒载体。实例1 用来产牛突变株的酿酒酵母的转化在本实例中，使用了两种酵母菌株单倍体菌株SYD62D-1A (MATalpha, ura3-52, his3_delta300， trpl_delta90， leu2_3，112， lys2-801, ade2_2)禾口 二 倍 体菌株 YPH501(MATa/alpha ura3-52/ura3-52 Iys2-801/lys2-801 ade2_101/ ade2-101trpl-delta63/trpl-delta63 his3-delta200/his3-delta2001eu2-deltal/ leu2_deltal)。^ YPD (Yeast Peptone Dextrose)培养基(1 % 酵母提取物，2 % 多聚蛋 白胨polyp印ton，2%葡萄糖)中培养上述酵母菌株，并通过使用冷冻酵母转化试剂盒 II (Frozen EZ YeastTransformationII, ZymoResearch)来制备感应态细胞。A. YCplaclll 突变株通过使用冷冻酵母转化试剂盒II (ZymoResearch)，将YCplacl 11/ρο13-01或 YCplaclll/pol3-01+L612X 突变体质粒载体 QOOng DNA)导入 IOul SYD62D-1A 感应 态细胞中。将所述细胞涂抹至无亮氨酸的完全合成培养基琼脂板上(SC/-LeU:0.67% ^ ^ M S Sl W Sl # Μ(0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids) ,0. 69g/ LCSM-Leu (F0RMEDIUM )，2%葡萄糖，2%琼脂)，并在30°C下培养三天。分离出每个转化株， 并将其命名为YCplaclll/pol3-01或YCplaclll/pol3-01+L612X的突变株，其中X为所需 氨基酸残基。所述转化株的内源性野生型P0L3基因保持完整和活性。B. YCplac33 突变株通过使用冷冻酵母转化试剂盒II (ZymoResearch)，将YCplac33/pol3_01或 YCplac33/pol3-01+L612M 突变体质粒载体(200ng DNA)导入 IOul SYD62D-1A 感应态 细胞中。将所述细胞涂抹至无尿嘧啶的完全合成培养基琼脂板上(SC/-Ura:0.67% 不含氨基酸的酵母氮源(0. 67 % Yeast Nitrogen Base w/o amino acids)，0. 77g/ LCSM-Ura (F0RMEDIUM )，2%葡萄糖，2%琼脂)，并在30°C下培养三天。分离出每个转化株， 并将其命名为YCplac33/pol3-01或YCplac33/pol3-01+L612M的突变株。所述转化株的内源性野生型P0L3基因保持完整和活性。C. YEplacl95 突变株通过使用冷冻酵母转化试剂盒II (ZymoResearch)，将YEplacl95/pol3_01或 YEplacl95/pol3-01+L612M突变体质粒载体 QOOng DNA)导入 IOul SYD62D-1A感应态细胞 中。将所述细胞涂抹至SC/-Ura，并在30°C下培养三天。分离出每个转化株，并将其命名为 YCplacl95/pol3-01或YCplacl95/pol3-01+L612X的突变株。所述转化株的内源性野生型 P0L3基因保持完整和活性。D. YIplac33 突变株使用限制酶KPnI 将 YIplacl95/pol3_01 或 YEplacl95/pol3_01+L612M突变体质粒载体消化，以便线性化所述载体。通过使用冷冻酵母转化试剂盒 II (ZymoResearch)，将线性化载体(IOOOng)导入100ulSYD62D_lA感应态细胞中。将所述 细胞涂抹至SC/-Ura，并在30°C下培养三天。通过使用引物M13YCp 5，ACGTTGTAAAACGACGGCCAG(SEQ ID N 0 28)和 ScP0L3ICl 5‘TTTACGGTGACACTGATTCCG (SEQ ID NO 29)的 PCR 反应分离出各个转化株并决定 所述转化株的基因型，以便确定所述增变基因载体已与P0L3基因座结合。将各个阳性转化 株命名为YIplac33/pol3-01或YIplaC33/pO13-01+L612M的突变株。所述转化株的内源性 野生型P0L3基因保持完整和活性。E. YCplac33/GalIp 突变株通过使用冷冻酵母转化试剂盒II (ZymoResearch)，将 YCplac33/feillp/pol3-01 或 YCplac33/(iallp/pol3-01+L612M 突变体质粒载体 QOOng DNA)导入 IOul YPH501 感应 态细胞中。将所述细胞涂抹至SC/-Ura，并在30°C下培养三天。分离出每个转化株，并将其 命名为YCplaC33/feillp/pO13-01+L612M的突变株。为了表达突变体pol3基因，将所述转 化株移至SC/-Ura/半乳糖(用2%半乳糖代替2%葡萄糖)琼脂板，并在30°C下培养5 7天。所述转化株的内源性野生型P0L3基因保持完整和活性。在酿酒酵母中CANl基因座上的突变率的变量实验(fluctuationanalysis)CANl正向突变检测通过来自每个培养皿的5个独立菌群上的刀豆氨酸敏感性 (Cans)突变向耐刀豆氨酸(CanK)突变的检测完成。研究突变率，即每次分裂(或每个世代)中每个细胞的突变概率的实验方法，称为 变量实验。在变量实验中，有多种对于本领域技术人员来说为公知的数学方法被用来评估 发生在每次培养中的若干突变的突变率。这些数学方法包括使用在一些相似的培养中观测 的分布值估计出每次培养中可能发生的突变次数，然后使用所述可能发生的突变次数计算 出所述突变率。举例说明，CAm基因座上的突变率(MR)等于突变系数(m)除以本次培养中的细胞 总数(N)，即MR = m/N。所述突变系数定义为m = r0/(r0/m)，其中rO为对于每次克隆来 说耐CanK菌群的数量。使用1948年的《遗传学期刊》第49卷中Lea和Coulson的《细菌种 群中突变体数量的分布〉〉艮p"The distribution of the number Of mutantsin bacterial populations” 264-285 页记载的 Lea-Coulson，s 指数求得 rO/m 的数量值。对每一个培养皿重复三次CANl正向突变，确定平均突变率。结果如表1、2和3所 示25
表1.酿酒酵母(SYD62D-1A，单倍体菌株)中CANl基因座上的突变率(MR)
权利要求
1.一种指导细胞进化的方法，包括至少将一个增变基因导入所述细胞，其特征在于，至 少一个所述增变基因包括低保真度突变和核酸外切酶缺失突变，所述至少一个增变基因的 导入增加了所述细胞的突变率；培养至少有一个所述增变基因导入的所述细胞，以便获得 成熟细胞；并从所述成熟细胞中至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变细胞，以便获得 选择性细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少将一个增变基因导入所述细胞中，而 不干扰细胞内源性DNA聚合酶基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少将一个增变基因导入带有突变载体 的细胞中。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括回复所述成熟细胞的野生型 突变率，以便获得回复的成熟细胞，其中，从所述回复的成熟细胞中，至少挑选出一个带有 所需遗传性状的突变细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括回复所述被挑选出的细胞的野生型突变率。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个所述增变基因为异源性DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个所述增变基因包含带有低保真 度突变体的第一 DNA聚合酶增变基因和带有核酸外切酶缺失突变体的第二 DNA聚合酶增变 基因。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个所述增变基因是所述细胞的内 源性DNA聚合酶的突变拷贝。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个所述DNA聚合酶包含B族DNA 聚合酶，Exo I模体突变体、Exo II模体突变体和Exo III模体突变体中的至少一个；以及 模体A突变体和模体B突变体中的至少一个。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一个所述增变基因是至少具有一个 DNA聚合酶δ的所述细胞DNA聚合酶。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是从真核细胞、哺乳动物细胞、 酵母菌细胞、植物细胞和原核细胞中挑选出来的。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所需生长条件下培养所述细胞，其中 从有机溶剂、卤化物、芳香族化合物、温度、盐浓度、PH环境、独有的生物条件以及高的/低 的种群密度中至少挑选出来一种作为所述所需生长条件。
13.一种带有所需遗传性状的细胞，其特征在于，所述细胞是根据权利要求1所述方法 获得的细胞或其后代。
14.根据权利要求12所述的细胞，其特征在于，至少回复一个所述细胞的野生型突变率。
15.一种至少为指导酵母菌细胞进化的方法，包括至少将一个增变基因导入所述酵母 菌细胞，其特征在于，至少一个所述增变基因包括低保真度突变和核酸外切酶缺失突变；其 中，所述至少一个增变基因的导入增加了所述酵母菌细胞的突变率；至少一个所述增变基 因的导入不会使所述酵母菌细胞的内源性基因组DNA聚合酶分裂；培养至少有一个所述增变基因导入的所述酵母菌细胞，以便获得成熟酵母菌细胞；并 从所述成熟酵母菌细胞中至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变酵母菌细胞，以便获得 选择性酵母菌细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述核酸外切酶缺失突变包含所述酵 母菌细胞的DNA聚合酶δ基因(POU)的催化亚基的D321A (在氨基酸321位点上，丙氨酸 替代天冬氨酸)氨基酸替换和Ε323Α (在氨基酸323位点上，丙氨酸替代谷氨基酸)氨基酸 替换。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述低保真度突变包含在至少一个所 述酵母菌细胞的DNA聚合酶δ基因(P0L3)的催化亚基中的L612M(在氨基酸612位点上， 蛋氨酸替换亮氨酸)氨基酸替换。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，进一步包括回复成熟酵母菌细胞的野 生型突变率，以便获得回复的成熟酵母菌细胞；其中从所述回复的成熟酵母菌细胞中，至少 挑选出一个带有所需遗传性状的突变酵母菌细胞。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，进一步包括回复所述被挑选出的酵母 菌细胞的野生型突变率。
20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，将DNA聚合酶增变基因导入带有低拷贝 可诱导突变体质粒的酵母菌细胞。
21.一种带有所需遗传性状的酵母菌细胞，其特征在于，所述酵母菌细胞是根据权利要 求15所述方法获得的细胞或其后代。
22.根据权利要求21所述的酵母菌细胞，其特征在于，至少回复一个所述酵母菌细胞 的野生型突变率。
23.一种至少为指导CHO细胞进化的方法，包括至少将一个增变基因导入所述CHO细 胞，其特征在于，至少一个所述增变基因包括低保真度突变和核酸外切酶缺失突变；其中， 所述至少一个增变基因的导入增加了所述CHO细胞的突变率；培养至少有一个所述增变基因导入的所述CHO细胞，以便获得成熟CHO细胞；并从所述 成熟CHO细胞中至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变CHO细胞，以便获得选择性CHO 细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述核酸外切酶缺失突变包含在所述 CHO细胞的DNA聚合酶δ基因(Poldl)的催化亚基中的D398A (在氨基酸398位点上，丙氨 酸替代天冬氨酸)氨基酸替换。
25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述低保真度突变包含在所述CHO细胞 的DNA聚合酶δ基因(Poldl)的催化亚基中的L620M(在氨基酸620位点上，蛋氨酸替代 亮氨酸)氨基酸替换。
26.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，进一步包括回复成熟CHO细胞的野生 型突变率，以便获得回复的成熟CHO细胞；其中从所述回复的成熟CHO细胞中，至少挑选出 一个带有所需遗传性状的突变CHO细胞。
27.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，进一步包括回复所述被挑选出的CHO 细胞的野生型突变率。
28.一种带有所需遗传性状的CHO细胞，其特征在于，所述CHO细胞是根据权利要求23所述方法获得的细胞或其后代。
29.根据权利要求观所述的CHO细胞，其特征在于，至少回复一个所述CHO细胞的野生型突变率。
30.一种至少为指导烟草细胞进化的方法，包括至少将一个增变基因导入所述烟草细 胞，其特征在于，至少一个所述增变基因包括低保真度突变和核酸外切酶缺失突变；其中， 所述至少一个增变基因的导入增加了所述烟草细胞的突变率；培养至少有一个所述增变基因导入的所述烟草细胞，以便获得成熟烟草细胞；并从所 述成熟烟草细胞中至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变烟草细胞，以便获得选择性烟 草细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述核酸外切酶缺失突变包含在所述 烟草细胞的DNA聚合酶δ基因(Poldl)的催化亚基中的D275A (在氨基酸275位点上，丙 氨酸替代天冬氨酸)氨基酸替换和Ε277Α (在氨基酸277位点上，丙氨酸替代谷氨基酸)氨基酸替换。
32.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述低保真度突变包含在所述烟草细 胞的DNA聚合酶δ基因(Poldl)的催化亚基中的L567M(在氨基酸567位点上，蛋氨酸替 代亮氨酸)氨基酸替换。
33.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，进一步包括回复成熟烟草细胞的野生 型突变率，以便获得回复的成熟烟草细胞；其中从所述回复的成熟烟草细胞中，至少挑选出 一个带有所需遗传性状的突变烟草细胞。
34.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，进一步包括回复所述被挑选出的烟草 细胞的野生型突变率。
35.一种带有所需遗传性状的烟草细胞，其特征在于，所述烟草细胞是根据权利要求 30所述方法获得的细胞或其后代。
36.根据权利要求35所述的烟草细胞，其特征在于，至少回复一个所述烟草细胞的野 生型突变率。
37.一种至少为指导大肠杆菌细胞进化的方法，包括至少将一个增变基因导入所述大 肠杆菌细胞，其特征在于，至少一个所述增变基因包括低保真度突变和核酸外切酶缺失突 变；其中，所述至少一个增变基因的导入增加了所述大肠杆菌细胞的突变率；培养至少有一个所述增变基因导入的所述大肠杆菌细胞，以便获得成熟大肠杆菌细 胞；并从所述成熟大肠杆菌细胞中至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变大肠杆菌细 胞，以便获得选择性大肠杆菌细胞。
38.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述核酸外切酶缺失突变包含在所述 大肠杆菌细胞的DNA聚合酶B基因(PolII)的催化亚基中的D155A(在氨基酸155位点上， 丙氨酸替代天冬氨酸)氨基酸替换和Ε157Α(在氨基酸157位点上，丙氨酸替代谷氨基酸) 氨基酸替换。
39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述低保真度突变包含在所述烟草细 胞的DNA聚合酶B基因(PolII)的催化亚基中的L422G (在氨基酸422位点上，甘氨酸替代 亮氨酸)氨基酸替换。
40.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，进一步包括回复成熟大肠杆菌细胞的野生型突变率，以便获得回复的成熟大肠杆菌细胞；其中从所述回复的成熟大肠杆菌细胞 中，至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变大肠杆菌细胞。
41.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，进一步包括回复所述被挑选出的大肠 杆菌细胞的野生型突变率。
42.一种带有所需遗传性状的大肠杆菌细胞，其特征在于，所述大肠杆菌细胞是根据权 利要求38所述方法获得的细胞或其后代。
43.根据权利要求42所述的大肠杆菌细胞，其特征在于，回复所述大肠杆菌细胞的野 生型突变率。
44.一种至少为指导枯草杆菌细胞进化的方法，包括至少将一个增变基因导入所述枯 草杆菌细胞，其特征在于，至少一个所述增变基因包括低保真度突变和核酸外切酶缺失突 变；其中，所述至少一个增变基因的导入增加了所述枯草杆菌细胞的突变率；培养至少有一个所述增变基因导入的所述枯草杆菌细胞，以便获得成熟枯草杆菌细 胞；并从所述成熟枯草杆菌细胞中至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变枯草杆菌细 胞，以便获得选择性枯草杆菌细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，进一步包括回复成熟枯草杆菌细胞的 野生型突变率，以便获得回复的成熟枯草杆菌细胞；其中从所述回复的成熟枯草杆菌细胞 中，至少挑选出一个带有所需遗传性状的突变枯草杆菌细胞。
46.根据权利要求44所述的方法，其特征在于，进一步包括回复所述被挑选出的枯草 杆菌细胞的野生型突变率。
47.一种带有所需遗传性状的枯草杆菌细胞，其特征在于，所述枯草杆菌细胞是根据权 利要求44所述方法获得的细胞或其后代。
48.根据权利要求47所述的枯草杆菌细胞，其特征在于，回复所述枯草杆菌细胞的野 生型突变率。
全文摘要
本发明涉及了一种通过改变生物体突变率来指导生物体进化的方法。增加遗传多样性可以用来帮助生物体内所需遗传性状的选择。
文档编号C12N15/00GK102046786SQ20098012008
公开日2011年5月4日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者堀内贵之, 小川昌规, 板谷有希子, 栗田惠利, 田中早苗, 田畑和文, 矢野骏太郎, 窪田米奇 申请人:株式会社新·摩根研究所